CN103655542B

CN103655542B - 杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用

Info

Publication number: CN103655542B
Application number: CN201310574425.9A
Authority: CN
Inventors: 王福俤; 穆明道; 伍爱民; 杜晓利; 安鹏; 吴谦; 邵丹丹; 沈筱筠
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2033-11-15
Also published as: CN103655542A

Abstract

本发明提供了杨梅素Myricetin在制备抑制铁调素Hepcidin表达的制剂中的应用，具体的，所述杨梅素可用于制备防治慢性炎症性贫血（ACI）、难治性缺铁性贫血（IRIDA）或肾性贫血的饮食补充剂或药物。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了杨梅素在制备抑制铁调素Hepcidin表达的制剂中的应用，为杨梅素改善Hepcidin升高性疾病提供了理论依据，特别是对慢性炎症性贫血及缺铁性贫血的药物研发提供了基础。

Description

杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用

（一）技术领域

本发明涉及杨梅素Myricetin在制备抑制铁调素Hepcidin表达的制剂中的应用。

（二）背景技术

铁是人体必需微量元素之一，铁代谢平衡紊乱，会导致体内铁缺乏或铁过载。肝脏分泌的铁调素Hepcidin通过控制铁的吸收和再循环利用维持体内铁稳态的平衡。遗传缺陷导致的低水平Hepcidin是原发性血色病发生发展的重要因素；而在难治性缺铁性贫血（IRIDA）和慢性炎症性贫血（ACI）中Hepcidin的高表达为疾病的治疗带来一定难度。

因此，以铁调素Hepcidin为靶点，靶向筛选Hepcidin的激动剂或拮抗剂，对铁代谢紊乱疾病的治疗都具有重要意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供杨梅素在制备抑制铁调素Hepcidin表达的制剂中的应用，为新药筛选提供基础。

本发明采用的技术方案是：

杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用。

在此前的研究中，发明人发现黑豆皮提取物能显著抑制铁调素Hepcidin的表达，根据文献报道，选取黑豆皮提取物中几类代表性活性成分，筛选其潜在的活性分子。研究发现杨梅素Myricetin能在体外通过降低Smad1/5/8信号通路的磷酸化而显著抑制人源肝癌细胞HepG2铁调素Hepcidin的表达，呈现较强的时间、剂量依赖性。通过荧光素酶报告基因手段，发现杨梅素Myricetin对HAMP基因的转录展现出一致的抑制效果。在2种铁调素Hepcidin的激动剂BMP6和炎症因子IL-6刺激的条件下，杨梅素仍能抑制住铁调素Hepcidin上升。进一步动物体内试验证实，杨梅素抑制肝脏Hepcidin表达的同时，可以减少肝脏铁、脾脏铁的含量，增加外周血清铁浓度。富有意义的是，动物体内研究显示，杨梅素或可改善机体的造血功能，膳食期间机体的红细胞数量、血红蛋白量及红细胞压积显著上升，同时对血小板亦有一定程度的响应。此外，杨梅素膳食处理的小鼠能显著改善急性LPS对小鼠铁调素Hepcidin及机体铁代谢的影响。高铁膳食条件下，杨梅素能显著增加小鼠机体的血清铁，降低肝脏、脾脏等组织铁，更进一步证实了杨梅素促进机体的铁动员。该研究结果为杨梅素改善Hepcidin升高性疾病提供了理论依据，特别是对慢性炎症性贫血及缺铁性贫血的药物研发提供了基础。

具体的，所述杨梅素可用于制备防治慢性炎症性贫血（ACI）、难治性缺铁性贫血（IRIDA）或肾性贫血的饮食补充剂（如保健品）或药物。

通常，所述的饮食补充剂含0.01～50wt%，较佳地为0.1～5wt%的杨梅素；以及食品上可接受的载体。

所述的药物可添加药学上可接受的载体，制成常规的剂型，如片剂、胶囊、颗粒剂等。

药学上可接受的载体指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物是口服药物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。

本发明所述的药物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中杨梅素可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中，也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在制备的药物中，杨梅素占总重量的0.01～20wt%，较佳地为0.05～5wt%，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了杨梅素在制备抑制铁调素Hepcidin表达的制剂中的应用，为杨梅素改善Hepcidin升高性疾病提供了理论依据，特别是对慢性炎症性贫血及缺铁性贫血的药物研发提供了基础。

（四）附图说明

图1为杨梅素体外抑制HepG2细胞HAMP基因表达；

A：黑豆皮潜在活性成分对人肝癌细胞系HepG2细胞HepcidinmRNA表达的影响；

B：不同浓度的杨梅素处理HepG2细胞，处理12小时，对HAMP基因表达的抑制作用；

C：浓度为50μg/mL杨梅素处理HepG2细胞从0h到24h对HAMP基因表达的抑制作用；

D：不同浓度的杨梅素处理HepG2细胞，westernblot检测BMP-SMAD、JAK-STAT、ERK1/2相关通路蛋白变化水平，处理时间12小时；

E：浓度为50μg/mL杨梅素从0h至24h处理HepG2细胞对Hepcidin表达通路相关蛋白的影响，westernblot检测BMP-SMAD、JAK-STAT、ERK1/2通路蛋白水平。

图2为杨梅素抑制BMP6或IL-6诱导的HAMP表达；

A：杨梅素（50μg/mL）和BMP6（10ng/mL）共处理HepG2细胞12小时，对HepG2细胞HepcidinmRNA表达的抑制效果；

B：杨梅素（50μg/mL）和IL-6（50ng/mL）共处理HepG2细胞12小时，对HepG2细胞HepcidinmRNA表达的抑制效果；

C：杨梅素（0-100μg/mL）和BMP6（10ng/mL）共处理HepG2细胞12小时，对HepG2细胞Hepcidin表达的抑制效果，westernblot分析磷酸化Smad1/5/8、磷酸化Stat3和磷酸化Erk1/2水平；

D：杨梅素（0-100μg/mL）和IL-6（50ng/mL）共处理HepG2细胞12小时，对HepG2细胞Hepcidin表达的抑制效果，westernblot分析磷酸化Smad1/5/8、磷酸化Stat3和磷酸化Erk1/2水平。

图3为杨梅素显著抑制HAMP基因的转录；

A：不同浓度杨梅素（0-100ug/mL）处理HepG2细胞12h，荧光素酶报告基因检测HAMP基因转录情况；

B：杨梅素（50ug/mL）处理HepG2细胞0-24h，荧光素酶报告基因检测HAMP基因转录情况；

C：不同浓度的杨梅素（0-100μg/mL）和BMP6（10ng/mL）共处理HepG2细胞24小时，荧光素酶报告基因检测HAMP基因的转录情况；

D：不同浓度的杨梅素（0-100μg/mL）和IL-6（50ng/mL）共处理HepG2细胞24小时，荧光素酶报告基因检测HAMP基因转录情况。

图4为杨梅素腹腔给药24小时抑制正常小鼠肝脏Hamp1表达；

A：杨梅素（40mg/kg）腹腔注射24小时，C57BL/6小鼠肝脏Hamp1表达量情况

B：杨梅素（40mg/kg）腹腔注射24小时，C57BL/6小鼠肝脏Bmp6表达量情况

C：杨梅素（40mg/kg）腹腔注射24小时，C57BL/6小鼠肝脏Id1表达量情况

D：杨梅素（40mg/kg）腹腔注射24小时，C57BL/6小鼠血清铁水平情况。

图5为杨梅素腹腔给药1周抑制正常小鼠肝脏Hamp1表达；

A：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠肝脏Hamp1表达量情况；

B：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠肝脏Bmp6表达量情况；

C：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠肝脏Fpn1表达量情况；

D：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠血清铁水平情况；

E：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠非血红素肝铁水平情况；

F：杨梅素（每天20mg/kg）腹腔注射1周，C57BL/6小鼠非血红素脾铁水平情况。

图6为杨梅素膳食能抑制小鼠体内Hamp1基因表达；

A：杨梅素（3‰）膳食，15-30天，C57BL/6小鼠肝脏Hamp1表达量情况；

B：杨梅素（3‰）膳食，15-30天，C57BL/6小鼠肝脏Bmp6表达量情况；

C：杨梅素（3‰）膳食，15-30天，C57BL/6小鼠肝脏Id1表达量情况；

D：杨梅素（3‰）膳食30天，，C57BL/6小鼠肝脏Epo表达量情况。

图7为杨梅素显著改善急性脂多糖LPS对小鼠机体铁水平的影响；

A：C57BL/6小鼠肝脏Hamp1表达量情况；

B：C57BL/6小鼠血清铁水平情况；

C：C57BL/6小鼠血清转铁蛋白水平情况；

D：C57BL/6小鼠脾脏非血红素铁水平情况。

图8：高铁膳食下，杨梅素能显著增加机体的铁动员；

A：C57BL/6小鼠肝脏血清铁水平情况；

B：C57BL/6小鼠非血红素肝铁水平情况；

C：C57BL/6小鼠非血红素脾铁水平情况；

D：C57BL/6小鼠转铁蛋白饱和度水平情况；

E：C57BL/6小鼠不饱和铁结合力水平情况；

F：C57BL/6小鼠总铁结合力水平情况。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.材料和方法

1.1实验原料制备

黑豆皮中几种代表活性成分：Cyaninchloride、Kuromaninchloride、(+)-Catechinhydrate、β-Sitosterol、Myricetin均购自SIGMA公司。所有活性单体溶于无菌二甲基亚砜DMSO中，配置成所需浓度。脂多糖LPS购自SantaCruzBiotech公司。

1.2细胞株

人肝癌细胞株HepG2及人肾脏细胞株HEK293由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。培养条件：含10％FBS（GIBCO）的DMEM高糖型培养基（GIBCO），37℃，5％CO2饱和湿度培养箱。

1.3Luciferase荧光素酶报告基因检测

按照HDTransfectionReagent-Promega转染系统说明，于转染前1日接HEK293接种于24孔板，5×10⁴/孔，第2日当细胞约60%融合时，更新细胞培养液，共同转染HAMP-promoter2.7kb-pGL3和内参Renilla报告基因质粒。共转24h后，根据实验设计，加药处理不同的浓度、时间后，裂解收集细胞，离心取上清，用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem测定裂解细胞上清内Luciferase（HAMPLuc和RenillaLuc）活性，计算HAMPLuc/RenillaLuc比值。每种处理各个设3复孔。

1.4实验动物

6～10周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，SPF环境饲养。基础饲料AIN-76A（铁含量0.9mg/Kg，ResearchDiets,Inc）适应喂养一周后，按体重随机分组，每组6～8只，根据实验设计，对照组和实验组分别予以不同处理后，5%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血（及时分离血清），并收集肝脾肾组织（液氮保存）。

1.5RNA提取和Realtime-PCR

Trizol（LifeTechnologies）法提取细胞和组织的RNA，具体操作按说明书进行。Nanodrop1000Spectrophotometer上检测RNA纯度（OD260/OD280≈1.9-2.1）及RNA浓度（ng/μl），调整RNA浓度到1μg/μl。2.0μgRNA经DNase（Promega）处理后，M-MLV反转录酶（Promega）和Oligo（dT）18primer（TakaraBioInc.）进行反转录。CFX96Real-TimeSystem(Bio-Rad)中进行RealtimePCR，检测体积为10ul，试剂采用iQSYBRGreenSupermix（Bio-Rad），引物序列如下：

HAMP:

forwardCAGCTGGATGCCCATGTTC

reverseCAGCAGCCGCAGCAGAA；

ACTIN:

forwardCACGGCATCGTCACCAACT

reverseCACGCAGCTCATTGTAGAAGGT；

mouseHamp1:

forwardGCACCACCTATCTCCATCAACA

reverseTTCTTCCCCGTGCAAAGG；

mouseActb(β-actin):

forwardAAATCGTGCGTGACATCAAAGA

reverseGCCATCTCCTGCTCGAAGTC；

mouseId1:

forwardCGCAGCCACCGGACTCT

reverseAACCCCCTCCCCAAAGTC；

mouseBmp6:

forwardATGGCAGGACTGGATCATTGC

reverseCCATCACAGTAGTTGGCAGCG；

mouseTfr2:

forwardTCCAAGAAACCCAGAGACCTGTT

reverseCCGAGTCCTGAGTGGGAAGA；

mouseHfe:

forwardTGTGAGGTGCATGAAGACAACAG

reverseTCTTGCCCGTCATAACCATATCT；

mouseHjv:

forwardCCAGGCTGAGGTGGACAATC

reverseGTCGGTCGCCCCCATT；

mouseEpo:

forwardTCCCCCACGCCTCATCT

reverseTTTCTGCCTCCTTGGCCTCTA；

mouseTmprss6:

forwardACGTGCATTTCACTGCCTAGAG

reverseTGTTCTTCGTCACTGCCATTG；

mouseFpn1:

forwardTCACCTGGCTACGTCGAAAAT

reverseGCTGGGCTAGTCCTGAGAATAGAC；

1.6Westernblot

用含有PMSF（Sigma-Aldrich）和磷酸酶抑制剂（PhosSTOP，Roche）的RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所）裂解细胞或组织后，提取总蛋白。细胞蛋白取30ug，肝组织蛋白取100ug，经10%SDS-PAGE胶电泳后，转移至PVDF膜，该膜与特异性抗体4℃孵育过夜。洗涤三遍，与过氧化物酶标记的二抗（anti-rabbitoranti-mouseIgG1:4000,ProteintechGroup）室温孵育1小时后，Westernblot试剂盒（ECLsystem，Pierce,ThermoScientific）显色。

所用一抗如下：

兔抗anti-pSmad1/5/8（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology），兔抗anti-Smad1（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology），兔抗anti-pStat3（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology），兔抗anti-Stat3（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology），兔抗anti-pErk1/2（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology），兔抗anti-Erk1/2（1:1000浓度稀释；CellSignalingTechnology）and鼠抗antiβ-actin（1:2000浓度稀释；Sigma-Aldrich）。

1.7统计方法

所用统计采用R软件分析，实验数据以Mean±SD表示。细胞和动物实验的组间比较采用Tukey’s检验(ANOVA)，两组间比较以Student'st-test检验，以P<0.05认为有统计学意义。

2结果

2.1杨梅素抑制人肝癌细胞HepG2细胞HAMP基因表达

在体外培养HepG2细胞，将文献筛选的5种活性单体分别加入细胞培养液中，终浓度为20μg/mL，处理12小时后，弃上清培养基，PBS漂洗3遍，Trizol法提取RNA，Realtime-PCR检测HAMP基因表达量。每种活性单体每次处理设3复孔，实验重复3次。

实验发现杨梅素可显著抑制HepG2细胞HAMP基因的表达（图1A）。且杨梅素抑制HAMP基因的表达程度与剂量和作用时间相关。杨梅素的浓度为20μg/mL时，HAMP基因的表达量约为对照组的10%（图1B）。50μg/mL的杨梅素处理，随着时间的变化，HAMP表达量开始极剧下降，处理12-24小时后，表达量明显不足对照组的2%（图1C）。

用含有PMSF（Sigma-Aldrich）和磷酸酶抑制剂（PhosSTOP,Roche）的RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所）裂解细胞或组织后，提取总蛋白。通过western-blot，检测Hepcidin分子调控的主要信号通路BMP-SMAD、JAK-STAT、ERK中各因子的表达情况[6,7]。WesternBlot结果显示，随着杨梅素浓度的增加，磷酸化Smad1/5/8蛋白表达水平亦显著降低（图1D），并且6小时后，Smad1/5/8蛋白磷酸化的水平显著被抑制（图1E），这提示杨梅素通过降低Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平抑制HepcidinmRNA表达。

2.2杨梅素能分别显著抑制BMP6诱导和IL-6诱导的的HAMP表达

BMP6是生理条件下最强的Hepcidin刺激剂，为了探讨杨梅素对BMP6诱导的Hepcidin表达的抑制效果，将杨梅素（50μg/mL）先于BMP6（10ng/mL）30min加入到HepG2细胞的培养液中，培养12小时后，检测HepcidinmRNA表达量。BMP6可使HepcidinmRNA表达量升高到正常值的4-5倍。杨梅素能够减弱BMP6的刺激作用，HepcidinmRNA的表达量仅为正常值的40%（图2A）。WesternBlot结果显示，BMP6可明显增加Smad1/5/8蛋白磷酸化水平，随着杨梅素浓度的增加，BMP6刺激条件下的磷酸化Smad1/5/8蛋白表达水平亦显著降低（图2C）。

细胞因子IL-6主要在炎症状态下通过JAK-STAT信号通路激活Hepcidin表达。为了评价杨梅素在炎症状态下对Hepcidin的抑制作用，我们将杨梅素（50μg/mL）先于IL-6（50ng/mL）15min加入到HepG2细胞的培养液中，培养12小时后，检测HepcidinmRNA表达量。结果与抑制BMP6相似，IL-6可使HepcidinmRNA表达量升高到正常值的2倍。杨梅素能够减弱IL-6的刺激作用，使HepcidinmRNA的表达量仅为正常值的22%（图2B）。WesternBlot结果显示，IL-6可明显增加JAK-STAT信号通路Stat3蛋白磷酸化水平及Smad1/5/8蛋白磷酸化水平。随着加入杨梅素浓度的增加，IL-6条件刺激下的磷酸化Smad1/5/8蛋白表达水平亦显著降低，而Stat3蛋白磷酸化水平未有变化（图2D）。

由此推测杨梅素抑制IL-6诱导Hepcidin表达的作用，不是直接通过抑制Stat通路发挥作用，而是通过抑制Smad通路间接实现。这更进一步证实，杨梅素抑制铁调素Hepcidin表达的潜在靶点可能为BMP-SMAD信号通路中Smad1/5/8蛋白。

2.3杨梅素抑制HAMP基因的转录

利用HEK293细胞株，按照HDTransfectionReagent-Promega转染系统，共同转染HAMP-promoter2.7kb-pGL3和内参Renilla报告基因质粒。共转24h后，处理不同浓度的杨梅素，终浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。处理24h后，裂解收集细胞，离心取上清，用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem测定裂解细胞上清内Luciferase（HAMPLuc和RenillaLuc）活性，计算HAMPLuc/RenillaLuc比值。实验发现，杨梅素随着浓度的增加能显著抑制HAMPLuc的相对活性，20ug/ml的浓度时，HAMPLuc的相对活性已不足对照组的10%（图3A）。此外，杨梅素对HAMP基因转录的抑制呈现出时间依赖，50ug/ml浓度处理下，6小时后，HAMPLuc的相对活性显著下降（图3B）

为了探讨杨梅素分别对BMP6和IL-6诱导条件下HAMP基因转录的抑制效果，我们将不同浓度的杨梅素（0-100μg/mL）分别先于BMP6（10ng/mL）30min，先于IL-6（50ng/ml）15min加入到转染后的HEK293细胞培养液中，24小时后，同样利用双荧光素酶检测报告基因检。

实验发现，BMP6可使HAMPLuc相对活性升高到约为正常值的2.5倍，显著增强HAMP基因的转录水平。不同浓度的杨梅素能够减弱BMP6的该种刺激作用，甚至使BMP6对HAMP基因转录的诱导作用消失（20-100μg/mL），HAMPLuc相对活性约为正常值的7%（图3C）。与BMP6结果相似，IL-6可使HAMPLuc相对活性升高到正常值的3.5倍。不同浓度的杨梅素能够减弱IL-6的该种刺激作用（20-100μg/mL），较高浓度的杨梅素甚至使IL-6对HAMP基因转录的诱导作用降至约为正常值的10%（图3D）。基于此，我们推测杨梅素可通过抑制HAMP基因的转录影响到铁调素Hepcidin的表达。

2.4杨梅素腹腔给药能抑制小鼠体内HAMP1基因表达，增加血清铁水平

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分组后，通过腹腔注射每天杨梅素40mg/kg处理小鼠24小时，检测肝脏组织HepcidinmRNA表达水平，血清铁等变化情况。结果发现，给药24小时，小鼠肝脏Hepcidin表达明显下降（图4A）。通常与肝脏Hamp1基因表达一致的Bmp6、Id1，也均受到了抑制效果（图4B、4C）。

血清铁呈上升趋势（图4D）。此外，每天通过腹腔注射20mg/kg杨梅素，给药7天，与对照组比较，展现出一致的效果，Hamp1、Bmp6、Id1均受到了显著性的抑制（图5A、5B、5C）。7天后，小鼠机体血清铁水平显著增加（5D），肝脏铁、脾脏铁水平显著降低（图5E、5F）。特别的，杨梅素腹腔给药7天（每天20mg/kg，每组6-8只），杨梅素能显著改善机体的造血功能，小鼠红细胞、血红蛋白、红细胞压积均有显著性升高（表1）。

表1：杨梅素腹腔给药1周、显著改善正常小鼠机体的造血功能

2.5杨梅素膳食能抑制小鼠体内Hamp1基因表达，促进机体的造血功能

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分组后，喂饲含杨梅素3‰的混合饲料。分别处理0，15和30天，5%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，送于上海市徐汇区中心医院进行血常规检测。15天起，小鼠肝脏Hamp1、Bmp6、Id1水平均受到了不同程度的抑制（图6A、6B、6C）。此外，血常规结果发现，膳食喂养30天，小鼠肝脏Epo水平显著增加（图6D），小鼠红细胞、血红蛋白、红细胞压积均有显著性升高（表2）。

表2：杨梅素膳食能促进机体的造血功能

基于此，可验证之前的设想，杨梅素或可通过影响肝脏铁调素Hepcidin的表达，进而改善机体铁代谢的状态，增加机体铁的动员，进而改善机体的造血功能，从而发挥补血的功能。

2.6杨梅素能显著改善急性脂多糖LPS对小鼠机体铁水平的影响

炎症是造成机体贫血的常见因素，为了探讨杨梅素对炎症刺激下小鼠铁代谢的改善效果。我们将6-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分组后：正常组、脂多糖LPS组、脂多糖LPS+杨梅素组。杨梅素组（10mg/kg）每天通过腹腔给药，正常组、脂多糖LPS组分别给予空白对照。5天后，脂多糖LPS按2.5mg/kg分别处理脂多糖LPS组、脂多糖LPS+杨梅素组，正常组予以0.9%生理盐水对照处理。6小时后，5%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血、取样，血液送于上海市徐汇区中心医院进行血常规检测。

小鼠在脂多糖的刺激下，小鼠肝脏Hamp1水平显著增加，约为正常值的2倍，而杨梅素能显著抑制该刺激，使其水平与正常值无显著差异（图7A）。此外，脂多糖LPS的急性刺激，能显著降低机体的血清铁水平、转铁蛋白饱和度，杨梅素能显著改善机体血清铁及转铁蛋白度的降低（图7B、7C）。并且，杨梅素能显著抑制脂多糖LPS引起的脾脏铁增加（图7D）。此外，血常规检测结果，同样发现杨梅素能显著改善小鼠的造血功能（表3）。

表3：杨梅素能显著改善急性脂多糖LPS对小鼠机体铁水平的影响

组间没有相同字母，表示有显著性差异，P＜0.05。

2.7高铁膳食下，杨梅素能显著增加机体的铁动员

为了进一步探讨杨梅素对高铁刺激下小鼠铁代谢的改善效果。我们将6-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分组后：正常组、高铁膳食组、高铁膳食+杨梅素组。杨梅素组（20mg/kg）每天通过腹腔给药，正常组、高铁膳食组分别给予空白对照。5天后，5%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血、取样。

小鼠在高铁的刺激下，小鼠肝脏Hamp1水平显著增加，约为正常值的5倍，而杨梅素未能显著抑制该刺激（未展示）。高铁膳食，小鼠的血清铁、转铁蛋白饱和度略有降低，机体的肝脏铁、脾脏铁均显著升高，而杨梅素处理组，能显著改善高铁刺激引起的这些变化，杨梅素能显著增加机体的血清铁、转铁蛋白饱和度（图8A、8D），抑制高铁膳食带来的肝脏铁（图8B）、脾脏铁的上升（图8C）。

基于此，可进一步证实，在高铁条件下，杨梅素能显著促进机体的铁动员水平。

Claims

1.杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用，其特征在于杨梅素用于制备防治慢性炎症性贫血的饮食补充剂或药物。

2.杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用，其特征在于杨梅素用于制备防治难治性缺铁性贫血的饮食补充剂或药物。

3.杨梅素在制备抑制铁调素表达的制剂中的应用，其特征在于杨梅素用于制备防治肾性贫血的饮食补充剂或药物。