CN102379881B - 4-羟基水杨酰苯胺在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了4-羟基水杨酰苯胺在制药领域中的新用途。该化合物是核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)的抑制剂，通过抑制RR酶活性，阻断乙型肝炎病毒(HBV)复制所需dNTPs的合成，从而达到抑制HBV复制、治疗肝炎尤其是乙型肝炎的目的；通过抑制肝癌细胞RR酶活性包括HBV激活的RR酶活性，抑制肝癌细胞增殖，达到预防和治疗肝癌的目的；通过抑制RR酶，达到治疗多种肿瘤的目的。可用于预防和治疗乙型肝炎、肝癌、口咽上皮癌、大肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、以及慢性粒细胞白血病等肿瘤，具有重要应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)为靶标的药物中的应用，尤其是4-羟基水杨酰苯胺在制备以RR酶为靶标的防治肝炎的药物和抗肿瘤药物中的应用。
(二)背景技术
慢性肝炎是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。全世界约有20多亿人曾感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)，每年由于HBV感染而死亡的人数达100万。HBV感染不仅是引起慢性乙型肝炎、而且是引起原发性肝癌的重要生物学因素。中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，原发性肝癌的发生率显著高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎现有的治疗主要有干扰素、核苷类药物、胸腺素，但这些药物长期应用会出现较严重的毒副作用或产生耐药，且价格昂贵。因此，寻找新型、有效的抗HBV药物是急需解决的问题。
核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)是细胞DNA合成限速酶。其功能是催化核糖核苷酸(NDPs)中核糖上C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸(dNDPs)。在细胞内，dNDPs经激酶作用生成三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，为DNA合成提供原料。RR酶由2个相同的大亚基(α2)和两个相同的小亚基(β2)组成四聚体(α2β2)。R1(在人RR又称为M1)代表α2部分，R2(在人RR又称为M2)代表 β2部分，哺乳动物中还有另一RR小亚基p53R2(在人RR又称为M2B)。已经证明，RR高表达，或由此造成的细胞内dNTPs库混乱，与肿瘤发生发展密切相关。而且，RR酶的高表达增加肿瘤治疗中的化疗抵抗。目前靶向针对RR酶治疗相关肿瘤已逐渐成为热点与重点。
HBV基因组为双链、部分环状的DNA，由长链和短链组成。HBV侵入机体后，在肝细胞内进行复制，在其复制过程中病毒前基因组RNA逆转录成为DNA并复制子代病毒DNA。HBV DNA合成需要以dNTPs为底物。HBV通常在静止肝脏细胞中复制较快，但静止肝脏细胞中的dNTPs含量较低，正常情况下无法满足HBV的复制。最近研究表明，HBV之所以能够在静止肝脏细胞中复制，是因其HBx蛋白能够阻断R2抑制性调节因子x1(Rfx1)的作用，在静止肝细胞中选择性激活R2基因表达，从而激活RR酶活性而使细胞能够生成大量dNTPs，供HBV在静止肝细胞中的自身复制需要，引起肝炎。
4-羟基水杨酰苯胺，其结构式为：
该化合物的分子式为C13H11NO3，白色粉末状，分子量为229.24，CAS编号为526-18-1。该化合物的通用名为柳胺酚片，目前用于肝胆病用药，作用机制与去氢胆酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使胆汁中水分显著增加。利胆作用较去氢胆酸强，能使Oddi括约肌松弛。此外尚有降低血胆固醇作用。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供4-羟基水杨酰苯胺的新用途，即4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)为靶标的药物中的应用。
本发明采用的技术方案是：
4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)为靶标的药物中的应用。
本申请人经实验研究发现，该化合物能有效抑制RR酶的活性，并且其能作为RR酶抑制剂，具有抑制肿瘤细胞生长的能力，可发展为肝炎和肿瘤的预防及治疗药物。
具体的，所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治肝炎(尤其是乙型肝炎)的药物。
具体的，所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备抗肿瘤药物。
更为具体的，所述4-羟基水杨酰苯胺可用于制备防治肝癌、口咽上皮癌、大肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、以及白血病的药物。
本发明化合物对RR酶的半数有效抑制浓度(IC50)的测定结果见图1，对HepG2.2.15细胞的IC10、IC25及IC50的测定见表2，对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg的影响的测定见表3，对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的影响见表4。对各种肿瘤细胞的杀伤活性结果见图4～图10。该化合物可添加药物可接受的载体，制成常规的剂型如片剂、颗粒剂、针剂等。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明对已知药物4-羟基水杨酰苯胺发掘了新的医疗用途，开 拓了多个新的应用领域。
(2)本发明发现4-羟基水杨酰苯胺是RR酶的抑制剂。
(3)与RR靶向抑制药物羟基脲(Hydroxyurea，HU)比较，4-羟基水杨酰苯胺的RR酶抑制活性高10倍以上。
(4)4-羟基水杨酰苯胺的IC10剂量对HepG2.2.15细胞表达HBsAg、以及HBV DNA复制具有明显抑制作用。4-羟基水杨酰苯胺抑制HBsAg表达作用明显较高于HU和拉米夫定(Lamivudine，3-TC)；抑制HBV-DNA拷贝数明显高于HU、略低于3-TC。证明本发明的疗效显著，药理作用强。
(5)HBV常发生变异而产生耐药性，已有3-TC耐药的报道。4-羟基水杨酰苯胺抑制HBV的机制与3-TC不同，可供临床治疗选择使用。
(6)4-羟基水杨酰苯胺对多种肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。
(7)4-羟基水杨酰苯胺具有抑制HBV复制和肝癌细胞增殖的双重作用，因此与HU和3-TC比较，对肝癌的治疗和预防具有重要应用价值。
(8)4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，预示着其在肝炎和癌症领域有很好的药用前景。
(四)附图说明
图1为RR酶活性抑制实验结果。纵坐标为RR酶相对活性，是指每种化合物处理组相对于溶剂对照组RR酶活性(100％)作图(n＝3， 
)；羟基脲(HU)；
图2为4-羟基水杨酰苯胺、羟基脲(HU)及拉米夫定(3-TC)对HepG2.2.15细胞的抑制曲线；
图3为HBsAg标准品标准曲线；
图4为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对肝癌细胞(HepG2细胞)的抑制曲线；HU是对照化合物；
图5为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对人口咽上皮癌细胞(KB细胞)的抑制曲线；HU为对照化合物。
图6为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对大肠癌细胞(RKO细胞)的抑制曲线；HU为对照化合物；
图7为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对人卵巢癌细胞(CaOV-3细胞)的抑制曲线；HU为对照化合物；
图8为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对人卵巢癌细胞(3-AO细胞)的抑制曲线；HU是对照化合物。
图9为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)的抑制曲线；HU是对照化合物；
图10为4-羟基水杨酰苯胺和羟基脲(HU)对人慢性粒细胞白血病细胞(K562细胞)的抑制曲线；HU是对照化合物。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：药物的重组RR酶抑制活性
1、实验材料
(1)主要试剂：羟基脲(Hydroxyurea，HU，Sigma)，4-羟基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)。
(2)主要仪器：高效液相仪(日本岛津LC-10ATVP)，液体闪烁计数仪(Backman LS6500)。
2、实验方法
(1)重组RR酶活性测定样品制备
1)准备反应样品：大肠杆菌体外表达纯化的重组人RR酶大亚基M1(序列参见SEQ ID NO.1)和小亚基M2蛋白(序列参见SEQ ID NO.2)(蛋白用量为RR酶活性达到65～95％)，加双蒸水调节体积为80μl，加入不同浓度的测试化合物10μl；混匀，室温孵育30～60min；
2)每管加入反应缓冲液至体积100μl(终浓度：50mM HEPES，pH 7.2，6mM DTT，4mM magnesium acetate，2mM ATP，0.05mM CDP，100mM KCl，0.125μM[3H]CDP)；37℃孵育20～30min；沸水灭活10min；
3)加入5μl 20mg/mL PDE，37℃孵育30min～60min；沸水灭活10min；16000rpm离心15min，取上清。
(2)HPLC测定：
1)色谱条件：流动相：磷酸二氢铵，pH3-5；流速：1mL/min。色谱柱：C18柱。
2)样品测定：将上述上清进样20μL；收集HPLC分离样品50μL/管，每管加入4mL闪烁液。置于闪烁计数仪中测定样品的DPM和CPM。
(3)计算RR酶活性(％)＝实验组产物dCDP的CPM/空白对照组的CPM×100％。
3、实验结果
以RR酶代表性抑制药物羟基脲(Hydroxyurea，HU)为阳性对照药物，将体外表达纯化的RR大、小亚基蛋白重组成RR全酶，测定药物的RR靶向抑制作用，结果见图1。
结果表明，HU对重组RR酶活性的抑制作用呈剂量依赖性，与药物 浓度呈正相关，计算其IC50为96.55μM(RR酶活性50％抑制时的药物浓度)。4-羟基水杨酰苯胺对重组RR酶活性抑制作用明显高于HU，并呈剂量依赖性，计算其IC50为8.23μM，抑制活性约为HU 10倍。
实施例2：药物实验剂量的确定
1.实验材料
(1)细胞株：HepG2.2.15细胞(稳定转染HBV基因，可以稳定进行HBV基因组复制和表达)(浙江大学传染病研究所惠赠)。
(2)主要试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，羟基脲(Hydroxyurea，HU，Sigma)，4-羟基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)，拉米夫定(Lamivudine，3-TC，日本东京仁成工业株式会社)；Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK8，日本株式会社同仁化学研究所)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养：
细胞培养于DMEM高糖培养基(添加10％胎牛血清的DMEM培养基，pH 7.2)，添加400μg/ml的G418，2mmol/L谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。待细胞生长到70％～80％时，用含有EDTA的胰酶消化传代。
(2)CCK8试剂盒测定各药物对HepG2.2.15细胞杀伤力：
将4-羟基水杨酰苯胺用去除G418的DMEM培养基配制成125，175，250，350，500，700μM共6个浓度梯度，3-TC也同样配制成625，1250， 2500，5000，10000，20000μM的浓度梯度，HU则配制成250，500，1000，2000，4000，8000，12000μM的浓度梯度。HepG2.2.15细胞浓度4×104个/mL，加入96孔培养板100μL/孔，置CO2孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除培养液，加入以上不同浓度不同药物的含药培养基100μL/孔，每个浓度3个复孔。连续培养72h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪490nm检测各孔OD值。计算细胞存活率：细胞抑制率(％)＝[1-(实验孔OD均值/对照孔OD均值)]×100％。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度(IC50)。
3.实验结果
分别以RR抑制药物HU、抗HBV药物3-TC为阳性对照药物，应用MTT法(CCK8)测定药物的对HepG2.2.15的细胞毒性，计算各药物抑制HepG2.2.15细胞的IC10、IC25及IC50(图2，表2)。
为检测药物低细胞毒性剂量时对HBV的抑制作用，后续相关实验选用抑制细胞生长为10％及25％时的药物浓度即IC10和IC25两个剂量；同时阳性对照药3-TC及HU也设置IC10和IC25两个剂量，以保证不同药物作用的可比性。
表2：实验药物对HepG2.2.15的细胞毒性作用
实施例3：药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg表达水平抑制作用
1.实验材料
(1)主要试剂：HBsAg检测ELISA试剂盒(上海研吉生物科技有限公司)。
(2)主要仪器：全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
将HepG2.2.15细胞(5×104个/mL)置CO2孵箱中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，除去培养液，根据细胞毒性试验结果，分别加入含有不同浓度药物的去除G418的细胞培养液，每个浓度设置3个重复，并设去除G418的完全培养基的细胞为正常对照，5％CO2、37℃下培养。分别在连续培养48h，72h，96h后吸取各样本上清液置于1.5mL灭菌离心管中，1000rcf离心10min取上清，-20℃保存；同时收集各样品细胞，-70℃保存。
采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测。以试剂盒HBsAg标准品的浓度为横坐标、相应的OD值为纵坐标制作标准曲线。将各样本OD值读数代入标准曲线，计算出各样本中HBsAg含量及抑制率。药物对HBsAg抗原的抑制百分率(％)＝(1-样品抗原含量/空白抗原含量)×100％。
3.统计学分析
实验数据用SPSS 13.0软件处理，结果以 
表示，多个样本均数的比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P＜0.05为统计学差异显著。
4.实验结果
分别以RR抑制药物HU、抗HBV药物3-TC为阳性对照药物，应用ELISA方法检测4-羟基水杨酰苯胺对HepG2.2.15细胞上清液HBsAg表达水平的影响。以HBsAg标准品制作标准曲线(见图3)。各受试药物取IC10和IC25两个浓度，各样品的ELISA检测OD值代入标准曲线方程计算结果，见表3。
表3：各受试物对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg表达量的影响(n＝3， 
)
与对照相比，*P＜0.05，ΔP＜0.01
结果可见，4-羟基水杨酰苯胺对HepG2.2.15细胞表达和分泌HBsAg有明显抑制作用，并与药物浓度及作用时间呈明显正相关，与细胞对照组比具有显著性差异(P＜0.01)。4-羟基水杨酰苯胺IC10剂量在加药后96h时对HBsAg抑制率可达66.78％，而3-TC IC10剂量在加药后96h时对HBsAg抑制率仅为27.73％。为保证上述结果不是因为细胞数量的差异而产生，以同样细胞毒性剂量3-TC及HU(IC10和IC25两个浓度)为对照，均表明4-羟基水杨酰苯胺对于HepG2.2.15细胞表达和分泌HBsAg的抑制作用大于3-TC及HU。此结果证明，4-羟基水杨酰苯胺在抑制HBsAg合成和分泌作用方面具有独特优势。
实施例4：药物对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA复制的抑制作用
1.实验材料
(1)主要试剂：FQ-PCR试剂盒(罗氏Roche，批号：12995100)
(2)主要仪器：FQ实时荧光定量PCR仪(ABI，7500 real-time PCR)
2.实验方法
按照DNA提取试剂盒说明，提取同上分别经各药物处理的HepG2.2.15培养细胞样品的DNA，测定OD值，计算用于FQ-PCR的模板体积，使各样本中总DNA量相同。PCR扩增引物为：P1：5-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3；P2：5-CAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3，按以下条件进行扩增：50℃2min、92℃10min处理后，再做95℃15s和60℃1min 40个循环。
3.统计学分析
实验数据用SPSS 13.0软件处理，结果以 
表示，多个样本均数的比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P＜0.05为统计学差异显著。
4.实验结果
与空白对照组比较，4-羟基水杨酰苯胺IC10剂量在加药96h后对HBVDNA拷贝数具有明显抑制作用(P＜0.01)(表4)。其作用高于HU，略低于3-TC。
表4：各受试物对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的影响(n＝3， 
)
与对照相比，*P＜0.05，ΔP＜0.01
实施例5：针对人肝癌细胞的杀伤活性
1.实验材料：
(1)细胞株：人肝癌细胞(HepG2细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清)
(2)主要试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，羟基脲(Hydroxyurea，HU，Sigma)，4-羟基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法：
(1)细胞培养
细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，培养基加2mmol/L谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取HepG2细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至6×104个/mL。取96孔培养板每孔加入50μL上述细胞悬液，置CO2孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，加不同浓度的用培养基配制的药物50μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养72h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵 箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测490nm各孔OD值。计算细胞存活率：细胞抑制率(％)＝[1-(实验孔OD均值/对照孔OD均值)]×100％。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
3.实验结果
实验结果见图4。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对HepG2细胞的杀伤活性大于HU，其IC50为389μM，而HU对HepG2细胞的杀伤活性较弱。
实施例6：针对人口咽上皮癌细胞的杀伤活性
1.实验材料
人口咽上皮癌细胞(Human oropharyngeal carcinoma KB cells，KB细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％小牛血清)。其他同实施例5。
2.实验方法参见实施例5。
3.实验结果
实验数据见图5。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对KB细胞的杀伤活性大于HU，两者的IC50分别是141μM和1600μM，即4-羟基水杨酰苯胺对KB细胞的杀伤活性约是HU的11倍。
实施例7：针对人结肠腺癌细胞的杀伤活性
1.实验材料：人结肠腺癌细胞(RKO细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％小牛血清)。其他同实施例5。
2.实验方法：参见实施例5
3.实验结果
实验数据见图6。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对RKO细胞的杀伤活性大于HU，两者的IC50分别是141μM和1600μM，即4-羟基水杨酰苯胺对RKO细胞的杀伤活性是HU的11倍。
实施例8：针对人卵巢癌细胞的杀伤活性
1.实验材料：人卵巢癌细胞(CaOV-3细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)，其他同实施例5。
2.实验方法：参见实施例5。
3.实验结果
实验结果见图7。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对CaOV-3细胞的杀伤活性大于HU，两者的IC50分别是264μM和1515μM，即4-羟基水杨酰苯胺对CaOV-3细胞的杀伤活性是HU的5倍以上。
实施例9：针对人卵巢癌细胞的杀伤活性
1.实验材料：人卵巢癌细胞(3-AO细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)，其他同实施例5。
2.实验方法：参见实施例5。
3.实验结果
实验结果见图8。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对3-AO细胞的杀伤活性大于HU，两者的 IC50分别是205μM和3000μM，即4-羟基水杨酰苯胺对3-AO细胞的杀伤活性是HU的14倍以上。
实施例10：针对人非小细胞肺癌细胞的杀伤活性
1.实验材料：人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清)，其他同实施例5。
2.实验方法：参见实施例5。
3.实验结果
实验结果见图9。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对A549细胞的杀伤活性远远大于HU，其的IC50是398μM，而羟基脲对A549作用微弱。
实施例10：针对人慢性粒细胞白血病细胞的杀伤活性
1.实验材料：人慢性粒细胞白血病细胞(K562细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)，其他同实施例5。
2.实验方法：参见实施例5。
3.实验结果
实验结果见图10。
结论：4-羟基水杨酰苯胺对K562细胞的杀伤活性大于HU，两者的IC50分别是165μM和250μM，即4-羟基水杨酰苯胺对K562细胞的杀伤活性约为HU的2倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 4-羟基水杨酰苯胺在制备防治肝炎或和抗肿瘤药物中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 792
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met His Val Ile Lys Arg Asp Gly Arg Gln Glu Arg Val Met Phe Asp
1 5 10 15
Lys Ile Thr Ser Arg Ile Gln Lys Leu Cys Tyr Gly Leu Asn Met Asp
20 25 30
Phe Val Asp Pro Ala Gln Ile Thr Met Lys Val Ile Gln Gly Leu Tyr
35 40 45
Ser Gly Val Thr Thr Val Glu Leu Asp Thr Leu Ala Ala Glu Thr Ala
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Thr Lys His Pro Asp Tyr Ala Ile Leu Ala Ala Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Ser Asn Leu His Lys Glu Thr Lys Lys Val Phe Ser Asp
85 90 95
Val Met Glu Asp Leu Tyr Asn Tyr Ile Asn Pro His Asn Gly Lys His
100 105 110
Ser Pro Met Val Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ile Val Leu Ala Asn Lys
115 120 125
Asp Arg Leu Asn Ser Ala Ile Ile Tyr Asp Arg Asp Phe Ser Tyr Asn
130 135 140
Tyr Phe Gly Phe Lys Thr Leu Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Lys Ile Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Ala Glu Arg Pro Gln His Met Leu Met Arg Val Ser Val
165 170 175
Gly Ile His Lys Glu Asp Ile Asp Ala Ala Ile Glu Thr Tyr Asn Leu
180 185 190
Leu Ser Glu Arg Trp Phe Thr His Ala Ser Pro Thr Leu Phe Asn Ala
195 200 205
Gly Thr Asn Arg Pro Gln Leu Ser Ser Cys Phe Leu Leu Ser Met Lys
210 215 220
Asp Asp Ser Ile Glu Gly Ile Tyr Asp Thr Leu Lys Gln Cys Ala Leu
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ser Ala Gly Gly Ile Gly Val Ala Val Ser Cys Ile Arg
245 250 255
Ala Thr Gly Ser Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Gly Asn Ser Asn Gly Leu
260 265 270
Val Pro Met Leu Arg Val Tyr Asn Asn Thr Ala Arg Tyr Val Asp Gln
275 280 285
Gly Gly Asn Lys Arg Pro Gly Ala Phe Ala Ile Tyr Leu Glu Pro Trp
290 295 300
His Leu Asp Ile Phe Glu Phe Leu Asp Leu Lys Lys Asn Thr Gly Lys
305 310 315 320
Glu Glu Gln Arg Ala Arg Asp Leu Phe Phe Ala Leu Trp Ile Pro Asp
325 330 335
Leu Phe Met Lys Arg Val Glu Thr Asn Gln Asp Trp Ser Leu Met Cys
340 345 350
Pro Asn Glu Cys Pro Gly Leu Asp Glu Val Trp Gly Glu Glu Phe Glu
355 360 365
Lys Leu Tyr Ala Ser Tyr Glu Lys Gln Gly Arg Val Arg Lys Val Val
370 375 380
Lys Ala Gln Gln Leu Trp Tyr Ala Ile Ile Glu Ser Gln Thr Glu Thr
385 390 395 400
Gly Thr Pro Tyr Met Leu Tyr Lys Asp Ser Cys Asn Arg Lys Ser Asn
405 410 415
Gln Gln Asn Leu Gly Thr Ile Lys Cys Ser Asn Leu Cys Thr Glu Ile
420 425 430
Val Glu Tyr Thr Ser Lys Asp Glu Val Ala Val Cys Asn Leu Ala Ser
435 440 445
Leu Ala Leu Asn Met Tyr Val Thr Ser Glu His Thr Tyr Asp Phe Lys
450 455 460
Lys Leu Ala Glu Val Thr Lys Val Val Val Arg Asn Leu Asn Lys Ile
465 470 475 480
Ile Asp Ile Asn Tyr Tyr Pro Val Pro Glu Ala Cys Leu Ser Asn Lys
485 490 495
Arg His Arg Pro Ile Gly Ile Gly Val Gln Gly Leu Ala Asp Ala Phe
500 505 510
Ile Leu Met Arg Tyr Pro Phe Glu Ser Ala Glu Ala Gln Leu Leu Asn
515 520 525
Lys Gln Ile Phe Glu Thr Ile Tyr Tyr Gly Ala Leu Glu Ala Ser Cys
530 535 540
Asp Leu Ala Lys Glu Gln Gly Pro Tyr Glu Thr Tyr Glu Gly Ser Pro
545 550 555 560
Val Ser Lys Gly Ile Leu Gln Tyr Asp Met Trp Asn Val Thr Pro Thr
565 570 575
Asp Leu Trp Asp Trp Lys Val Leu Lys Glu Lys Ile Ala Lys Tyr Gly
580 585 590
Ile Arg Asn Ser Leu Leu Ile Ala Pro Met Pro Thr Ala Ser Thr Ala
595 600 605
Gln Ile Leu Gly Asn Asn Glu Ser Ile Glu Pro Tyr Thr Ser Asn Ile
610 615 620
Tyr Thr Arg Arg Val Leu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Val Asn Pro His
625 630 635 640
Leu Leu Lys Asp Leu Thr Glu Arg Gly Leu Trp His Glu Glu Met Lys
645 650 655
Asn Gln Ile Ile Ala Cys Asn Gly Ser Ile Gln Ser Ile Pro Glu Ile
660 665 670
Pro Asp Asp Leu Lys Gln Leu Tyr Lys Thr Val Trp Glu Ile Ser Gln
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Lys Thr Val Leu Lys Met Ala Ala Glu Arg Gly Ala Phe Ile Asp Gln
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705 710 715 720
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770 775 780
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785 790
<210> 2
<211> 389
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Leu Ser Leu Arg Val Pro Leu Ala Pro Ile Thr Asp Pro Gln Gln
1 5 10 15
Leu Gln Leu Ser Pro Leu Lys Gly Leu Ser Leu Val Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Thr Pro Pro Ala Leu Ser Gly Thr Arg Val Leu Ala Ser Lys Thr Ala
35 40 45
Arg Arg Ile Phe Gln Glu Pro Thr Glu Pro Lys Thr Lys Ala Ala Ala
50 55 60
Pro Gly Val Glu Asp Glu Pro Leu Leu Arg Glu Asn Pro Arg Arg Phe
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His Val Leu Ala Phe Phe Ala Ala Ser Asp Gly Ile Val Asn Glu Asn
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Val Val Ala Phe Ala Ala Val Glu Gly Ile Phe Phe Ser Gly Ser Phe
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Ala Ser Ile Phe Trp Leu Lys Lys Arg Gly Leu Met Pro Gly Leu Thr
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Val Arg Glu Ile Ile Ile Asn Ala Val Arg Ile Glu Gln Glu Phe Leu
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Phe Ser Lys Val Phe Arg Val Glu Asn Pro Phe Asp Phe Met Glu Asn
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Ile Ser Leu Glu Gly Lys Thr Asn Phe Phe Glu Lys Arg Val Gly Glu
355 360 365
Tyr Gln Arg Met Gly Val Met Ser Ser Pro Thr Glu Asn Ser Phe Thr
370 375 380
Leu Asp Ala Asp Phe
385
Claims (7)
1.4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）为靶标的药物中的应用，所述以核糖核苷酸还原酶为靶标的药物为抗肿瘤药物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治肝癌的药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治口咽上皮癌的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治大肠癌的药物。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治卵巢癌的药物。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治非小细胞肺癌的药物。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备防治白血病的药物。
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