CN105670947B - 一种含有狗尾草的镰刀菌培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有狗尾草的镰刀菌培养基及其制备方法。配制1000ml培养基的配方如下：狗尾草50‑200g，玉米淀粉3g，七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂15‑20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0‑8.0。该培养基以田间常见杂草狗尾草为主要材料，添加少量玉米淀粉、七水硫酸镁和磷酸二氢钾，作为辅助碳源和无机盐成分。本发明所提供培养基配方简单，不需要特殊设备，极易制备；采用该培养基可以对多种类型镰刀菌进行快速产孢培养，且生长迅速，产孢量极大。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有狗尾草的镰刀菌培养基及其制备方法。
背景技术
目前对田间杂草的回收利用的研究较少，造成了大量生物质资源的浪费。如，狗尾草是旱地作物常见的一种杂草，广泛分布于我国多个省市玉米种植区。狗尾草生育期与相应作物生育期较为一致，且根系发达，吸收水分和养分能力强，易与田间农作物争夺水分、养分、光照和空间等条件，其生长能力十分强。目前对于农田杂草多事采用化学防除的方法，缺乏回收利用方法。
镰刀菌是我国较为常见的一类丝状真菌。镰刀菌有分生孢子（无性孢子）和子囊孢子（有性孢子）2种孢子，田间存在的为分生孢子形态，分生孢子呈镰刀形，顶端钝圆或略微收缩，有2-7个隔膜。
微生物复杂多样，不同个体间的代谢过程往往有所差异，对于相应培养基也有特殊的要求。不同培养基内所含物质的不同，对相应菌株的生长产生很大的影响。目前以真菌进行植物病害控制和杂草生物防治的工作越来越普遍，生防真菌的研究已经得到越来越广泛的关注。而一种优质、低廉和易制备的培养基对于生防真菌的研究无疑至关重要，也是限制生防菌株低成本利用的重要限制条件。
发明内容
本发明目的是针对现有培养基的缺点，提供了一种镰刀菌培养基，以杂草狗尾草为主要的培养基碳、氮源和无机盐类物质提供者，并辅助以玉米淀粉、七水硫酸镁和磷酸二氢钾等物质，成本便宜，产孢迅速且产孢量极大。
本发明采用了如下技术方案：
一种含有狗尾草的镰刀菌培养基，配制1000ml培养基的配方如下：狗尾草50-200g，玉米淀粉3g，七水硫酸镁 1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0。
优选的，狗尾草50g。
优选的，pH为6.0-7.0 。
更优选的，pH为7.0 。
一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的制备方法为：
将狗尾草去除根部，洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于5厘米，加入蒸馏水，煮沸30分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得狗尾草汁液；
加入玉米淀粉，七水硫酸镁，磷酸二氢钾，琼脂；
加蒸馏水，调节pH为6.0-8.0，定容；
将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用：
将该培养基灭菌后倒入培养皿内，待培养基凝固后，接入相应镰刀菌菌株；培养温度为21-29℃，培养时间为为7天。
优选的，培养温度为25-29℃。
更优选的，培养温度为25℃。
一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用：适用于禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌等各种镰刀菌。
本发明的主要特点是：
1.以杂草为基础材料，原材料极易获得，达到了废物利用的目的；
2.配方简单，成本便宜；
3.配制方法简便，操作简便，不需要特殊设备要求；
4.本培养基可被广泛应用于多种镰刀菌的培养；
5.镰刀菌培养效果优良，采用该培养基能够快速和大量的培养制备镰刀菌分生孢子；
6.该培养基可被广泛应用于生防菌的培养，真菌营养生理、生化特征和遗传功能基因方面的研究。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不应解释为局限于这些实施例。
实施例1 不同杂草培养基的配制和培养效果比较
取50g狗尾草，对狗尾草进行人工切碎，切碎至茎叶片段小于5厘米，沸水煮狗尾草茎叶30分钟，纱布过滤掉杂草茎叶。在过滤获得的狗尾草汁液中加入玉米淀粉3g，七水硫酸镁 1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，琼脂18g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为7.0。并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105 Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。根据组成成分，将该培养基定名为狗尾草玉米淀粉培养基（SCA）。
将上述培养中的狗尾草替换为其它杂草，其他步骤不变，制作培养基。本实施例中同时采用稗草、马唐、牛筋草、看麦娘、播娘蒿和反枝苋作为添加杂草，与添加狗尾草的培养基进行横向比较。
配制好的培养基用于培养禾谷镰刀菌菌株。
PDA培养基活化保存的镰刀菌菌株，5 天后，在菌落的边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种到各供试培养基上。将接种菌块的培养基放置到培养箱内，并将培养条件设定为25℃，黑暗培养。
7 天后测量菌落直径；3 mL无菌水清洗菌落表面孢子，收集后血球计数板计数，计算产孢量。
表1 添加不同杂草培养基的培养试验
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
由表1提供的数据可以看出，通过在基础培养基（CK，玉米淀粉3g，七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0）内添加相同含量的7种田间最常见杂草，根据实施例3中提到的方法，进行统计，发现添加狗尾草的培养基，无论是在菌落生长，还是在分生孢子产孢量方面都有显著优于添加其它杂草的培养基。
实施例2 镰刀菌培养常规培养基的配制和培养效果比较
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：土豆200 g，人工切成约2×2厘米的土豆块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，并定容至1000ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
马铃薯蔗糖培养基（PSA）：土豆200 g，人工切成约2×2厘米的土豆块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g蔗糖和20g琼脂，并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
胡萝卜培养基（CA）：胡萝卜200 g，人工切成约2×2厘米的胡萝卜块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g琼脂，并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
玉米淀粉培养基（CS）：玉米淀粉3g、七水硫酸镁 1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
真菌培养基（ZJ）：蛋白胨5 g，酵母粉2 g，葡糖糖2 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，琼脂20 g，水1000 ml；将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
水琼脂培养基（WA）：琼脂20 g，水定容至1000 mL，将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
配制好的培养基用于培养串珠镰刀菌。
培养方法和观察方法同实施例1 。
表2 镰刀菌菌株在不同培养基上的生长速率
| 培养基 | SCA | PDA | PSA | CS | ZJ | CA | WA |
| 菌落直径（cm） | 6.1±0.3<sup>a</sup> | 6.1±0.1<sup>a</sup> | 5.9±0.4<sup> ab</sup> | 5.7±0.4a<sup>b</sup> | 6.5±0.4<sup>a</sup> | 6.1±0.4<sup>ab</sup> | 0<sup>f</sup> |
| 产孢量(10<sup>9</sup>) | 396.4±16.8<sup>a</sup> | 201.3±22.4<sup>b</sup> | 95.7±8.7<sup>c</sup> | 26.7±3.3<sup>e</sup> | 98.9±3.9<sup>d</sup> | 31.9±6.2<sup>e</sup> | 0<sup>f</sup> |
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
由表2可以看出，本发明所提供的培养基（SCA），相较于目前在镰刀菌培养中应用比较广泛的培养基，在分生孢子产孢量方面有较为显著的优势。
实施例3 本发明所提供培养基中狗尾草用量的培养效果比较
以本发明所提供的培养基SCA为基础，对培养基内的材料狗尾草含量进行梯度筛选，在保证对菌株高效培养前提下尽量降低所用材料量，降低成本。参照实施例1中的配制方法，将狗尾草梯度设为0g、25g、50g、100g、200g、400g六个梯度。参照实施例1中所提到的方法对不同配比下镰刀菌生长情况进行测定。培养的菌株为禾谷镰刀菌。
表3 镰刀菌菌株LD-1禾谷镰刀菌在不同配比培养基上的产孢量
| 狗尾草（g） | 0 | 25 | 50 | 100 | 200 |
| 产孢量(10<sup>9</sup>) | 19.6±2.3<sup>c </sup> | 203.7±9.6<sup>b</sup> | 396.3±22.4<sup> a</sup> | 372.6±23.8<sup>a</sup> | 409.7±18.9<sup>a</sup> |
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
由表3可知，本发明所提供的培养基（SCA）内狗尾草添加量不同，镰刀菌的分生孢子产生量，可以得出，本发明所提供培养基内狗尾草含量为50-200g为佳，考虑降低成本因素，优选为每升50g。
实施例4不同镰刀菌菌株在SCA培养基内的生长差异
参照实施例1的方法配置本发明所提供培养基，并参照实施例3的方法验证各种镰刀菌（LD-1：禾谷镰刀菌;LD-2：串珠镰刀菌;LD-3：尖孢镰刀菌;LD-4: 厚垣孢镰刀菌）在本发明所提供培养基内的生长速率。
表4 不同镰刀菌菌株在本发明培养基上的生长速率
| 菌株 | LD-1 | LD-2 | LD-3 | LD-4 |
| 菌落直径（cm） | 6.3±0.7<sup>a</sup> | 6.6±0.4<sup>a</sup> | 6.3±0.5<sup> a</sup> | 6.5±0.2<sup>a</sup> |
| 产孢量(10<sup>9</sup>) | 409.7±16.8<sup>a</sup> | 357.2±31.2<sup>ab</sup> | 416.8±28.7<sup>a</sup> | 376.5±19.7<sup>ab</sup> |
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，四种所测试镰刀菌在本发明所提的培养基内生长迅速，并产生大量分生孢子。
实施例5 SCA培养基培养条件的优化实验
以LD-1为测试菌株，参照实施例1中所提到的方法进行本发明培养基SCA配制，镰刀菌培养和观察。所设温度为17、21、25、29、33℃五个梯度；所设pH值为4、5、6、7、8、9六个梯度。
表5 不同培养温度对菌株LD-1的影响
| 温度 | 17 ℃ | 21 ℃ | 25 ℃ | 29 ℃ | 33 ℃ |
| 菌落直径（cm） | 3.8±0.2<sup>b</sup> | 7.1±0.5<sup>a</sup> | 7.1±0.2<sup>a</sup> | 6.4±0.1<sup>a</sup> | 6.0±0.3<sup>a</sup> |
| 产孢量(10<sup>9</sup>) | 31.3±2.2<sup>d</sup> | 148.7±19.2<sup>c</sup> | 406.2±29.4<sup>a</sup> | 389.8±27.7<sup>a</sup> | 312.8±21.5<sup>b</sup> |
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，本发明培养基内镰刀菌菌落生长适宜培养温度范围21-29℃，结合分生孢子产量分析确认培养温度优选为25-29℃，本着能源节约的角度，最优温度为25℃。
表6 pH值对菌株LD-1生长的影响
| pH值 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 菌落直径（cm） | 2.9±0.2<sup>c</sup> | 5.9±0.4<sup>b</sup> | 7.0±0.5<sup>a</sup> | 7.2±0.1<sup>a</sup> | 6.5±0.4<sup>ab</sup> | 5.8±0.2<sup>b</sup> |
| 产孢量(10<sup>9</sup>) | 0.07±0.01<sup>f</sup> | 23.1±2.8<sup>e</sup> | 301.6±24.9<sup>b</sup> | 396.5±28.7<sup>a</sup> | 182.7±24.2<sup>c</sup> | 37.1±6.6<sup>d</sup> |
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，本发明培养基内镰刀菌菌落生长培养pH范围6-8，结合分生孢子产量分析确认较佳培养pH为6-7，pH为7.0效果最佳。
Claims (8)
1.一种含有狗尾草的镰刀菌培养基，其特征在于，配制1000ml培养基的配方如下：狗尾草50-200g，玉米淀粉3g，七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH 为6.0-8.0；
所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的制备方法为：将狗尾草去除根部，洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于5厘米，加入蒸馏水1000ml，煮沸30分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得狗尾草汁液；
加入玉米淀粉，七水硫酸镁，磷酸二氢钾，琼脂；加蒸馏水，调节pH为6.0-8.0，定容至1000ml； 将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
2.根据权利要求1所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基，其特征在于：所述的狗尾草为50g。
3.根据权利要求1所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基，其特征在于：所述的pH为6.0-7.0。
4.根据权利要求3所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基，其特征在于：所述的pH为7.0。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用，其特征在于：将该 培养基灭菌后倒入培养皿内，待培养基凝固后，接入相应镰刀菌菌株；培养温度为21-29℃，培养时间为为7天。
6.根据权利要求5所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用，其特征在于：所述的培养温度为25-29℃。
7.根据权利要求6所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用，其特征在于：所述的培养温度为25℃。
8.根据权利要求1-4任一所述的一种含有狗尾草的镰刀菌培养基的应用，其特征在于：所述的培养基适用于禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌。
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