CN105886410A - 一种含有稗草的漆斑菌培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有稗草的漆斑菌培养基及其制备方法。配制1000ml培养基的配方如下：稗草100g‑200g，葡萄糖2g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0‑8.0。本发明培养基以杂草稗草为主要的培养基碳、氮源和无机盐类物质提供者，并辅助以葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾等物质，成本便宜，产孢迅速且产孢量极大。

Description

一种含有稗草的漆斑菌培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有稗草的漆斑菌培养基及其制备方法。
背景技术
漆斑菌是我国较为常见的一类丝状真菌。目前比较常见的漆斑菌包括疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）、露湿漆斑菌（M.roridum）和禾漆斑菌（M. gramineum）。疣孢漆斑菌菌落呈圆形扁平状，边缘整齐，黄色，光滑不透明，无迁移性。菌丝与孢子都可以发育为菌丝体，基内菌丝生长良好，无气生菌丝，表面的基内菌丝断裂成短孢菌丝顶端的孢子链一般有一到二个孢子，可应用于产生胆红素氧化酶的研究。露湿漆斑菌菌落白色至淡黄色，在培养基上均能形成分生孢子座，浅杯状有时具有拟薄壁组织状的座基，常为大量的绿色至黑色的粘孢子所覆盖。分生孢子杆状，窄椭圆形，两端顿圆，但基部略呈平截，光滑，无色，成堆时呈墨绿色，埋藏于粘液中，大小为5.2-7.8×1.7-2.2μm。露湿漆斑菌为多种植物病害病原微生物，目前研究显示，可侵染大豆、扁豆、茄、辣椒、甜菜、番茄、苘麻、蓖麻、锦葵等多种植物，引起茎基腐病、腐败病、漆腐病、轮纹病等。根据露湿漆斑菌侵染作物的差异，露湿漆斑菌又分为多种亚种转化型，不同转化型菌种之间致病力差异显著，例如露湿漆斑菌辣椒转化型，能够侵染辣椒，但是对苘麻、大豆，茄子等其它作物则安全。另一方面，露湿漆斑菌也被筛选作为生防菌，进行目标植物的防治工作。
微生物复杂多样，不同个体间的代谢过程往往有所差异，对于相应培养基也有特殊的要求。不同培养基内所含物质的不同，对相应菌株的生长产生很大的影响。目前以真菌进行植物病害控制和杂草生物防治的工作越来越普遍，生防真菌的研究已经得到越来越广泛的关注。而一种优质、低廉和易制备的培养基对于生防真菌的研究无疑至关重要，也是限制生防菌株低成本利用的重要限制条件。
目前对田间杂草的回收利用的研究较少，造成了大量生物质资源的浪费。目前对于农田杂草多事采用化学防除的方法，缺乏回收利用方法。利用杂草作为培养基原料，是杂草回收利用的一个有效方式。
发明内容
本发明目的是针对现有培养基的缺点，提供了一种漆斑菌培养基，以杂草稗草为主要的培养基碳、氮源和无机盐类物质提供者，并辅助以葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾等物质，成本便宜，产孢迅速且产孢量极大。
本发明采用了如下技术方案：
一种含有稗草的漆斑菌培养基，配制1000ml培养基的配方如下：稗草100g-200g，葡萄糖2g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0 。
优选的，所述稗草为100g。
优选的，所述pH调节为6.0-7.0。
更优选的，所述pH调节为7.0。
配制固体培养可添加琼脂15-20g。
一种含有稗草的漆斑菌培养基的制备方法为：
将稗草去除根部，洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于10厘米，加入蒸馏水，煮沸30分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得稗草汁液；
加入葡萄糖，酵母提取物，磷酸二氢钾；
加蒸馏水，调节pH，定容；
将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
一种含有稗草的漆斑菌培养基的应用：将培养基灭菌后倒入试管或培养皿内，接入相应漆斑菌菌株；培养温度为22-31℃；培养时间为为7天。
优选的，培养温度为22 ℃。
本发明的主要特点是：
1.以杂草为基础材料，原材料极易获得，达到了废物利用的目的；
2.配方简单，成本便宜；
3.配制方法简便，操作简便，不需要特殊设备要求；
4.本培养基可被广泛应用于多种漆斑菌的培养；
5.漆斑菌培养效果优良，采用该培养基能够快速和大量的培养制备漆斑菌分生孢子；
6.该培养基可被广泛应用于生防菌的培养，真菌营养生理、生化特征和遗传功能基因方面的研究。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不应解释为局限于这些实施例。
实施例1 含有不同杂草培养基的配制和培养效果比较
取100g稗草，对稗草进行人工切碎，切碎至茎叶片段小于10厘米，沸水煮稗草茎叶30分钟，纱布过滤掉杂草茎叶。在过滤获得的稗草汁液中加入2g葡萄糖、1g酵母浸粉和0.5g磷酸二氢钾和15-20g琼脂，并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105 Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。根据组成成分，将该培养基定名为稗草葡萄糖酵母浸粉培养基（EDY）。
将上述培养中的稗草替换为其它杂草，其他步骤不变，制作培养基。本实施例中同时采用狗尾草、牛筋草、看麦娘、播娘蒿和反枝苋作为添加杂草，与添加稗草的培养基进行横向比较。
配制好的培养基用于培养露湿漆斑菌。
活化保存的漆斑菌菌株，5 天后，在菌落的边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种到各供试培养基上。将接种菌块的培养基放置到培养箱内，并将培养条件设定为25℃，黑暗培养。
7 天后测量菌落直径，3 mL无菌水清洗菌落表面孢子，收集后血球计数板计数，计算单个培养皿内每毫升孢子量。
表1 含有不同杂草培养基的漆斑菌培养效果比较
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，由表1提供的数据可以看出，通过在基础培养基（CK: 葡萄糖2g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0，其中若固体培养可添加琼脂15-20g）内添加相同含量的6中田间最常见杂草，根据实施例3中提到的方法，进行统计，发现添加稗草的培养基，无论是在菌落生长，还是在分生孢子产孢量方面都有显著优于添加其它杂草的培养基。
实施例2 其它培养基的配制及其与含有稗草培养基的培养效果比较
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：土豆200 g，人工切成约2×2厘米的土豆块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
胡萝卜培养基（CA）：胡萝卜200 g，人工切成约2×2厘米的胡萝卜块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g琼脂，并定容至1000 ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
葡糖糖蛋白胨培养基（DPA）：葡糖糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000 ml；将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
真菌培养基（ZJ）：蛋白胨5 g，酵母粉2 g，葡糖糖2 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，琼脂20 g，水1000 ml；将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
配制好的培养基用于培养露湿漆斑菌。
表2 露湿漆斑菌菌株在不同培养基上的培养效果比较
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。
实施例2中用到的培养基是目前在漆斑菌培养过程中应用较为广泛的4类真菌培养基。由表2可以看出，本发明所提供的培养基，相较于其它培养基，在分生孢子产孢量方面有较为显著的优势。
实施例3 本发明培养基中稗草参数的优化实验
以本发明所提供的培养基为基础，对培养基内的材料稗草含量进行梯度筛选，在保证对菌株高效培养前提下尽量降低所用材料量，降低成本。参照实施例1中的配制方法，将稗草梯度设为0g、25g、50g、100g、200g等5个梯度。参照实施例1中所提到的方法对漆斑菌生长情况进行测定。配制好的培养基用于培养露湿漆斑菌。
表3 漆斑菌菌株在稗草不同含量培养基上的产孢量
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，可以得出，本发明所提供培养基内稗草含量为100-200g为佳，考虑降低成本因素，优选为每升100g。
实施例4 本发明中培养菌株培养条件的优化实验
参照实施例1中所提到的培养和统计方法进行本发明培养基内漆斑菌最优培养条件的筛选。所设温度为16、19、22、25、28和31℃等6个梯度；所设pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六个梯度。配制好的培养基用于培养露湿漆斑菌。
表4 不同培养温度对菌株生长的影响
温度 16℃ 19℃ 22℃ 25℃ 28℃ 31℃
菌落直径（cm） 2.9±0.1c 5.2±0.2b 7.0±0.4ab 7.3±0.6a 7.5±0.4a 7.1±0.5a
产孢量(1011) 0.3c 12.8±3.2b 33.7±4.2a 36.1±5.4a 35.9±3.7a 33.8±4.1a
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。
综合以上分析结果，本发明培养基内漆斑菌菌落生长最佳培养温度范围22-31℃，结合分生孢子产量和本着能源节约的角度，本发明优选温度为22℃。
表5 本发明所提供培养基的pH值对菌株生长影响
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
菌落直径（cm） 0.8±0.1e 1.9±0.3d 6.7±0.3b 7.5±0.2a 7.3±0.1a 3.8±0.5c
产孢量(1011) 0 1.7±0.2c 35.3±3.9a 34.7±6.2a 38.3±4.1a 4.7±0.6b
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在 0.05 水平上差异显著。配制好的培养基用于培养露湿漆斑菌。
综合以上分析结果，本发明培养基内漆斑菌菌落生长最佳培养pH范围6.0-8.0，分生孢子产量分析确认最佳培养pH为6.0-7.0，本发明优选推介pH为7.0。

Claims (8)

1. 一种含有稗草的漆斑菌培养基，配制1000ml培养基的配方如下：稗草100g-200g，葡萄糖2g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0 。
2.根据权利要求1所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基，其特征在于：所述稗草为100g。
3.根据权利要求1所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基，其特征在于：所述pH调节为6.0-7.0。
4.根据权利要求3所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基，其特征在于：所述pH调节为7.0。
5.根据权利要求1-4所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基，其特征在于：添加琼脂15-20g。
6.根据权利要求1-5所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基的制备方法，其特征在于：
将稗草去除根部，洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于10厘米，加入蒸馏水，煮沸30分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得稗草汁液；
加入葡萄糖，酵母提取物，磷酸二氢钾；
加蒸馏水，调节pH，定容；
将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
7.根据权利要求1-5所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基的应用，其特征在于：将该培养基灭菌后倒入试管或培养皿内，接入相应漆斑菌菌株；培养温度为22-31℃；培养时间为为7天。
8.根据权利要求7所述的一种含有稗草的漆斑菌培养基的应用，其特征在于：所述培养温度为22 ℃。
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