CN105638460B

CN105638460B - 一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法

Info

Publication number: CN105638460B
Application number: CN201511020722.4A
Authority: CN
Inventors: 沈香兰; 马建华; 马良良; 朱晓菲
Original assignee: Sichuan Qicai Forestry Industry Development Co Ltd
Current assignee: Sichuan Qicai Forestry Co., Ltd.
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN105638460A

Abstract

本发明公开一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)外植体选取及灭菌：切取日本枫蝴蝶带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成；(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成；(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养4—6周即得日本枫蝴蝶无菌苗；所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。

Description

一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法。

背景技术

日本枫蝴蝶，其拉丁名为Acer palmatum‘Butterfly’，是一个非常特别的小型花斑叶品种，叶子形状多变，几乎很难找到两片一样的叶子，叶子以乳白色或白色为主要颜色。春天新叶的浅粉色区域大于白色或乳白色区域，秋天白色部分变成洋红色，使整片叶子呈现出新的景象。其植株健壮，生长旺盛，是观叶植物的佳品。该品种数量少，虽然目前没有广泛栽植，但它将会成为一个很受欢迎的园林景观树种，极具观赏价值与经济价值。目前主要通过播种和嫁接繁殖，但出芽率和成活率都不是很高，繁殖系数低，繁殖周期长，场地要求大，人工成本较高，远不能满足国内对种苗的需求。

因此，如何提高其生产效率，缩短培育时间，降低人工成本，保持优良树种的遗传稳定性，提高其繁殖系数成为目前亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体选取及灭菌：切取日本枫蝴蝶带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；

(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.25mg/L NAA、0.01—0.08mg/L6-BA、10—50g/L蔗糖、1—10g/L琼脂；

(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.25mg/L 2，4-D、0.05—0.25mg/L NAA、0.05—0.25mg/L TDZ、0.1—1.0mg/L 6-BA；

(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养4—6周即得日本枫蝴蝶无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.01—0.08mg/L NAA、0.01—0.02mg/L IBA。

优选的，所述外植体选取及灭菌的具体操作为：选取日本枫蝴蝶幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理6—10s，再用0.1％的升汞处理6—10min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可。

优选的，所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.15mg/L NAA、0.03—0.06mg/L 6-BA、20—40g/L蔗糖、3—8g/L琼脂。

更为优选的，所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂。

优选的，所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.15mg/L 2，4-D、0.05—0.15mg/L NAA、0.05—0.15mg/L TDZ、0.5—0.9mg/L 6-BA。

更为优选的，所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L 2，4-D、0.1mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、0.8mg/L 6-BA。

优选的，所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.03—0.07mg/LNAA、0.01—0.015mg/L IBA。

更为优选的，所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.05mg/LNAA、0.01mg/L IBA。

优选的，所述启动培养基的pH值为6.3—6.7。

优选的，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。

本申请所述White基本培养基无机盐含量较低，但提高了硫酸镁的浓度，添加了硼素，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，较多的用于植物的生根。

所述1/2White基本培养基为：上述White基本培养基配方大量母液减半，更少量的无机盐浓度，更有利于植物的生根。

所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长激素，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂素。

所述2，4-D是用于诱导愈伤组织形成的生长素类似物的一种，可作为植物生长调节激素，用于组织培养。

所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。

所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本申请技术方案提供了一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、启动培养、增殖培养、生根培养的步骤，通过对启动培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，采用前述植物生长激素配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，配合各阶段的培养条件，得到的幼苗培养时间短，培养流程简便，提高了日本枫蝴蝶繁殖的效率，繁殖系数较高为2—3，能快速获得遗传性状一致的日本枫蝴蝶无菌苗，利用组织培养技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体选取及灭菌：选取日本枫蝴蝶幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理6—10s，再用0.1％的升汞处理6—10min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可，得外植体；

(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到pH值为6.3—6.7的启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂；

(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L 2，4-D、0.1mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、0.8mg/L 6-BA；

(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养4—6周即得日本枫蝴蝶无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.05mg/LNAA、0.01mg/L IBA。

其中，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为25天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为47天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例2

本实施例所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：

步骤(2)中，启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.01mg/L 6-BA、10g/L蔗糖、1g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05mg/L 2，4-D、0.05mg/L NAA、0.05mg/L TDZ、0.1mg/L 6-BA；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.08mg/L NAA、0.02mg/L IBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为33天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为124天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例3

步骤(2)中，启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.25mg/L NAA、0.08mg/L 6-BA、50g/L蔗糖、10g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.25mg/L 2，4-D、0.25mg/L NAA、0.25mg/L TDZ、1.0mg/L 6-BA；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.01mg/L NAA、0.01mg/L IBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为42天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为102天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例4

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为32天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为103天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例5

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为40天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为122天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例6

步骤(2)中，启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.03mg/L 6-BA、20g/L蔗糖、3g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05mg/L 2，4-D、0.05mg/L NAA、0.05mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.07mg/L NAA、0.015mg/L IBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为36天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为104天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例7

步骤(2)中，启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.15mg/L NAA、0.06mg/L 6-BA、40g/L蔗糖、8g/L琼脂；

步骤(3)中，增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.15mg/L 2，4-D、0.15mg/L NAA、0.15mg/L TDZ、0.9mg/L 6-BA；

步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.03mg/L NAA、0.01mg/L IBA。

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为29天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为74天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例8

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为35天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为74天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例9

本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为30天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为103天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—2cm，增殖系数为2—3。

实施例10

启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响

取生长情况一致的外植体若干，经过灭菌晾干后接种到pH值为6.3—6.7的启动培养基上培养3—5周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中启动培养基采用White基本培养基，补充生长激素、蔗糖、琼脂。在White基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。

表1启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响结果

从上表可以看出，NAA和6-BA同时使用比二者任一单用时的分化率要高得多，平均腋芽长度也更长，且从7—9组可以看出，两者同时使用时，NAA为0.1mg/L，6-BA为0.05mg/L时，分化率最高，为启动培养基的最适合的生长激素组成条件。

实施例11

增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响

取生长情况一致的经过启动培养的腋芽若干，接种到增殖培养基上培养6—8周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中增殖培养基采用White基本培养基，补充生长激素。在White基本培养基相同的条件下根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中腋芽的培养情况，具体分组及培养结果见表2。

表2增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响结果

从上表可以看出，2，4-D、NAA、TDZ、6-BA同时使用比四者任两种或任三种使用时的增殖率要高得多，平均株高也更高，且从13—15组可以看出，四者同时使用时，2，4-D为0.1mg/L，NAA为0.1mg/L，TDZ为0.1mg/L，6-BA为0.8mg/L时，其增殖率最高，为增殖培养基的最适合的生长激素组成条件。

实施例12

生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响

取生长情况一致的经过增殖培养的丛生芽的单株若干，接种到生根培养基上培养4—6周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中，生根培养基采用1/2White基本培养基，并补充生长激素，在1/2White基本培养基条件相同的情况下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中丛生芽的单株的培养情况，具体分组及培养结果见表3。

表3生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响结果

从上表可以看出，NAA、IBA同时使用比两者任一单用时的生根率要高得多，平均生根数和平均根长也均较高，且从6—11组可以看出，两者同时使用时，NAA为0.05mg/L，IBA为0.01mg/L，其生根率达到90％，且长势较好，平均生根数和平均根长均较高，为生根培养基的最适合的生长激素条件。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.25mg/L NAA、0.01—0.08mg/L 6-BA、10—50g/L蔗糖、1—10g/L琼脂；所述启动培养基的pH值为6.3—6.7；

2.根据权利要求1所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述外植体选取及灭菌的具体操作为：选取日本枫蝴蝶幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理6—10s，再用0.1％的升汞处理6—10min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可。

3.根据权利要求1所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.15mg/L NAA、0.03—0.06mg/L6-BA、20—40g/L蔗糖、3—8g/L琼脂。

4.根据权利要求3所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.05—0.15mg/L 2，4-D、0.05—0.15mg/L NAA、0.05—0.15mg/L TDZ、0.5—0.9mg/L 6-BA。

6.根据权利要求5所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养基的组成为：White基本培养基，补充0.1mg/L 2，4-D、0.1mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、0.8mg/L6-BA。

7.根据权利要求1所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.03—0.07mg/L NAA、0.01—0.015mg/L IBA。

8.根据权利要求7所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2White基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.01mg/L IBA。

9.根据权利要求1所述的一种日本枫蝴蝶的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。