CN105409782B - 一种山红叶黄八丈的组培快繁方法 - Google Patents

一种山红叶黄八丈的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)外植体选取及灭菌：切取山红叶黄八丈带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成；(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成；(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养3—4周即得山红叶黄八丈无菌苗；所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。

Description

一种山红叶黄八丈的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种山红叶黄八丈的组培快繁方法。
背景技术
山红叶黄八丈，其拉丁名为Acer palmatum‘Ki-hachijo’，其植株健壮，叶子较大，呈鲜亮的深绿色，秋天叶子颜色非常特别，夺人眼球的金黄色稍带有玫瑰红，随后变为浅橙色和红色的混合色，可孤植或群植，其植株健壮，生长旺盛。虽然该品种目前没有广泛栽植，但它将会成为一个很受欢迎的园林景观树种，极具观赏价值与经济价值。目前，山红叶黄八丈主要通过播种和嫁接繁殖，但出芽率和成活率都不是很高，繁殖系数低，繁殖周期长，场地要求大，人工成本较高，远不能满足国内对种苗的需求。
因此，如何提高其生产效率，缩短培育时间，降低人工成本，保持优良树种的遗传稳定性，提高其繁殖系数成为目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取山红叶黄八丈带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；
(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01—0.08mg/L IAA、0.1—0.6mg/L KT、10—50g/L蔗糖、1—8g/L琼脂；
(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05—0.25mg/L NAA、0.05—0.25mg/LKT、0.1—1.0mg/L 6-BA、100—800mg/L CH；
(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养3—4周即得山红叶黄八丈无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1—0.5mg/L IBA。
优选的，所述外植体选取及灭菌的具体操作为：选取山红叶黄八丈幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理8—15s，再用0.1％的升汞处理8—13min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可。
优选的，所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.015—0.03mg/L IAA、0.15—0.4mg/L KT、20—40g/L蔗糖、2—6g/L琼脂。
更为优选的，所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.02mg/L IAA、0.2mg/L KT、30g/L蔗糖、5g/L琼脂。
优选的，所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05—0.15mg/L NAA、0.05—0.15mg/L KT、0.5—0.9mg/L 6-BA、300—600mg/L CH。
更为优选的，所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.1mg/L KT、0.8mg/L 6-BA、500mg/L CH。
优选的，所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1—0.3mg/L IBA。
更为优选的，所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.2mg/L IBA。
优选的，所述启动培养基的pH值为6.3—6.7。
优选的，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。
本申请所述MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
所述B5基本培养基具有较高的钾盐和盐酸硫胺素，但含有较低的铵，而铵这一营养成分可能对有些培养基有抑制生长的作用；其养分的数量和比例合适，能满足部分植物细胞的营养和生理需要，部分植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
所述1/2B5基本培养基是B5基本培养基大量母液在原有基础上减半，更低的盐浓度有利于植物根系的生长。
所述IAA为吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。
所述KT为氯吡脲，是一种具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性较6-苄氨基嘌呤高10—100倍。它能够影响植物芽的发育、加速细胞有丝分裂、促进细胞增大和分化，防止果实和花的脱落，也能作为植物组织培养的细胞分裂素。
所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长激素，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂素。
所述CH为水解乳蛋白，是一种多种氨基酸的混合物，其主要作用是促进胚状体、不定芽的分化，有利于丛生芽的分化。可增强其他营养物质的吸收利用；亦可利用氨基酸对微量元素的结合能力，增强微量元素的利用率。可促进植物吸收作用。
所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
本申请技术方案提供了一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、启动培养、增殖培养、生根培养的步骤，通过对启动培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，采用前述植物生长激素配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，配合各阶段的培养条件，得到的幼苗培养时间短，培养流程简便，提高了山红叶黄八丈繁殖的效率，繁殖系数较高为2—3，能快速获得遗传性状一致的山红叶黄八丈无菌苗，利用组织培养技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)选取山红叶黄八丈幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理8—15s，再用0.1％的升汞处理8—13min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可，得外植体；
(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到pH值为6.3—6.7的启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.02mg/L IAA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、5g/L琼脂；
(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.1mg/L KT、0.8mg/L 6-BA、500mg/L CH；
(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养3—4周即得山红叶黄八丈无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.2mg/LIBA。
其中，所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为24天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为47天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例2
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01mg/L IAA、0.1mg/LKT、10g/L蔗糖、1g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.05mg/LKT、0.1mg/L 6-BA、100mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.5mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为31天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为68天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例3
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.08mg/L IAA、0.6mg/LKT、50g/L蔗糖、8g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.25mg/L NAA、0.25mg/LKT、1.0mg/L 6-BA、800mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为40天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为64天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例4
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01mg/L IAA、0.1mg/LKT、10g/L蔗糖、1g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.25mg/L NAA、0.25mg/LKT、1.0mg/L 6-BA、800mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为31天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为62天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例5
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.08mg/L IAA、0.6mg/LKT、50g/L蔗糖、8g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.05mg/LKT、0.1mg/L 6-BA、100mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.5mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为40天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为67天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例6
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.015mg/L IAA、0.15mg/LKT、20g/L蔗糖、2g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.05mg/LKT、0.5mg/L 6-BA、300mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.3mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为28天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为88天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例7
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.03mg/L IAA、0.4mg/LKT、40g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.15mg/L NAA、0.15mg/LKT、0.9mg/L 6-BA、600mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为27天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为58天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例8
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.015mg/L IAA、0.15mg/LKT、20g/L蔗糖、2g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.15mg/L NAA、0.15mg/LKT、0.9mg/L 6-BA、60mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为28天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为58天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例9
本实施例所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.03mg/L IAA、0.4mg/LKT、40g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(3)中，增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05mg/L NAA、0.05mg/LKT、0.5mg/L 6-BA、300mg/L CH；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.3mg/L IBA。
本实施例中，启动培养过程中，第一个腋芽生成的时间为27天，启动培养结束时，腋芽伸长1—2cm；增殖培养过程中，第一个丛生芽生成的时间为87天，增殖培养结束时，丛生芽株高1—3cm，增殖系数为2—3。
实施例10
启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响
取生长情况一致的外植体若干，经过灭菌晾干后接种到pH值为6.3—6.7的启动培养基上培养3—5周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中启动培养基采用B5基本培养基，补充生长激素、蔗糖、琼脂。在B5基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1 启动培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响结果
从上表可以看出，IAA和KT同时使用比二者任一单用时的分化率要高得多，平均腋芽长度也更长，且从7—9组可以看出，两者同时使用时，IAA为0.02mg/L，KT为0.2mg/L时，分化率最高，为启动培养基的最适合的生长激素组成条件。
实施例11
增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响
取生长情况一致的经过启动培养的腋芽若干，接种到增殖培养基上培养6—8周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中增殖培养基采用B5基本培养基，补充生长激素，在B5基本培养基条件相同的情况下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中腋芽的培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2 增殖培养基中生长激素成分和浓度对增殖的影响结果
从上表可以看出，NAA、KT、6-BA、CH同时使用比四者任一单用时的增殖率要高得多，平均株高也更高，且从13—15组可以看出，四者同时使用时，NAA为0.1mg/L，KT为0.1mg/L，6-BA为0.8mg/L，CH为500mg/L时，其增殖率最高，为增殖培养基的最适合的生长激素组成条件。
实施例12
生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响
取生长情况一致的经过增殖培养的丛生芽的单株若干，接种到增殖培养基上培养3—4周，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。其中生根培养基采用1/2B5基本培养基，补充IBA，在1/2B5基本培养基条件相同的情况下，根据IBA的浓度进行分组，观察并记录培养基中丛生芽的单株的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3 生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响结果
从上表可以看出，IBA为0.2mg/L时，其生根率达到90％，且长势较好，平均生根数和平均根长均较高，为生根培养基的最适合的生长激素条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取山红叶黄八丈带芽茎段，采用酒精和升汞灭菌处理后，得外植体；
(2)启动培养：将步骤(1)所得外植体接种到启动培养基中培养3—5周，腋芽生成，所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.015—0.03mg/L IAA、0.15—0.4mg/L KT、20—40g/L蔗糖、2—6g/L琼脂；
(3)增殖培养：切取步骤(2)所得腋芽，接种到增殖培养基中培养6—8周，丛生芽生成，所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05—0.25mg/L NAA、0.05—0.25mg/L KT、0.1—1.0mg/L 6-BA、100—800mg/L CH；
(4)生根培养：将步骤(3)所得丛生芽分离成单芽，接种到生根培养基中培养3—4周即得山红叶黄八丈无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1—0.5mg/LIBA。
2.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述外植体选取及灭菌的具体操作为：选取山红叶黄八丈幼嫩枝条，去掉叶片，切割成长度为2—3cm的带芽茎段，在无菌操作台上，用75％的酒精处理8—15s，再用0.1％的升汞处理8—13min，无菌水冲洗4—6次，晾干即可。
3.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.02mg/L IAA、0.2mg/L KT、30g/L蔗糖、5g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.05—0.15mg/L NAA、0.05—0.15mg/L KT、0.5—0.9mg/L 6-BA、300—600mg/L CH。
5.根据权利要求4所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养基的组成为：B5基本培养基，补充0.1mg/L NAA、0.1mg/L KT、0.8mg/L 6-BA、500mg/L CH。
6.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.1—0.3mg/L IBA。
7.根据权利要求6所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2B5基本培养基，补充0.2mg/L IBA。
8.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养基的pH值为6.3—6.7。
9.根据权利要求1所述的一种山红叶黄八丈的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养、增殖培养、生根培养步骤中，培养温度为24—28℃，光照强度为2000—3000Lx，光照时间为14—18h/d。
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