CN105596347A - 轮枝孢菌素a及与trail组合在制备药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供轮枝孢菌素A单独或与TRAIL组合在制备抗肿瘤转移药物中的应用。本发明研究证实轮枝孢菌素A能够有效增加包括人肝癌细胞，乳腺癌细胞以及结肠癌细胞在内的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。目前临床上缺乏真正的抗肿瘤转移药物，因此verticillin？A具有很好的应用前景。本发明verticillin？A能够在较低剂量下有效增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，并以协同作用的方式抑制肿瘤细胞转移。因此verticillin？A及与TRAIL组合具有更好抗肿瘤细胞转移的应用前景。

Description

轮枝孢菌素A及与TRAIL组合在制备药物中的应用
技术领域
本发明属制药领域，涉及轮枝孢菌素A与TRAIL组合在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的疾病之一，肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因，某种程度上讲，控制肿瘤转移即能控制癌症死亡，目前尽管国内外抗肿瘤转移药物研究投入了大量的人力、财力、时间，但是还没有一个真正的抗肿瘤转移药物上市。
TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand)是肿瘤坏死因子超家族的一个成员，由于能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，自被发现以来研究人员就将其作为一个选择性抗肿瘤药物进行着广泛的研究。近期，以TRAIL为主体的肿瘤治疗正在进行I期和II期临床试验(www.clinicaltrails.gov)。虽然TRAIL在临床前试验中表现了良好的选择特异性和较低的细胞毒性，TRAIL在肿瘤临床治疗中的疗效非常有限。究其原因，就是肿瘤细胞特别是转移性肿瘤细胞对TRAIL产生了耐药性。因此，寻找新型有效的TRAIL增敏剂与TRAIL协同作用以治疗肿瘤尤其是治疗肿瘤转移具有广泛的应用前景。已有报道verticillinA具有抗肿瘤效果，但是verticillinA抗肿瘤转移的效果未曾报道。
发明内容
本发明的目的是提供轮枝孢菌素A(verticillinA)在制备抗肿瘤转移药物中的应用。所述的verticillinA是从高等真菌黄赭鹅膏菌(含菌寄生菌歪孢菌)子实体中分离所得，分子式为C30H28N6O6S4，分子量(ESI-MS)：m/z696.3，所述药物由verticillinA与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。本发明所述肿瘤主要包括肝癌、结肠癌和乳腺癌。
本发明的另一个目的是提供轮枝孢菌素A(verticillinA)与TRAIL组合(重量比1:10)在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
本发明提供的药物，其制剂形式液体制剂、固体制剂或胶囊剂，主要包括颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。
本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
本发明提供的verticillinA对多种人的以及小鼠的肝癌细胞、结肠癌和乳腺癌细胞都有较强的TRAIL增敏效果。表明verticillinA是一广谱的有效的TRAIL增敏剂。目前临床上缺乏真正的抗肿瘤转移药物，因此verticillinA具有很好的应用前景。本发明verticillinA能够在较低剂量下有效增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，并以协同作用的方式抑制肿瘤细胞转移。因此verticillinA及与TRAIL组合具有更好抗肿瘤细胞转移的应用前景。
附图说明
图1是轮枝孢菌素A的液相色谱分析。仪器：Agilent1100系列高效液相色谱仪；柱：HypersilBDS-C18,，5μm，4.6×250mm；柱温：35℃；流动相：60％乙腈-40％水；流速：0.8mL/min；检测波长：210nm。
图2是4T-1细胞划痕实验显微照片图。
图3是4T-1细胞划痕实验柱状图。
图4是CT26细胞划痕实验柱状图。
图5是RKO细胞划痕实验柱状图。
图6是RKO细胞Tranawell实验，上图是显微照片图(左：对照，右：加药)，下图是柱状图。
图7是RT-PCR筛查基因的结果。
图8是VerticillinA下调c-Met蛋白表达。
图9是VerticillinA抑制HGF(肝细胞生长因子)激活的c-Met蛋白表达及其磷酸化。
图10是VerticillinA抑制HGF诱导的RKO细胞转移Tranawell实验。
图11是VerticillinA抑制HGF诱导的DLD1细胞转移Tranawell实验。
图12是VerticillinA与TRAIL组合抑制小鼠体内结肠癌细胞肺部转移的照片。
图13是VerticillinA与TRAIL组合抑制小鼠体内结肠癌细胞肺部转移肿瘤颗粒数的柱状图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例与附图详细说明本发明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1：分离纯化抗肿瘤细胞毒化合物VerticillinA
1.提取和纯化：黄赭鹅膏菌真菌(含菌寄生菌歪孢菌)湿重1500g，真空冻干粉碎后先用石油醚然后用乙酸乙酯室温浸提,取乙酸乙酯浸提物1.2g溶剂溶解后过反相色谱柱,流动相取石油醚:氯仿:乙腈＝6:1:3,部分收集器收集分离片段进行体外MTT法检测各片段对肝癌细胞HepG2的毒性,检测到毒性最大的组分收集后用C8反相半制备柱(HypersilODS20*250mm)纯化,流动相为10％-100％的乙腈或甲醇梯度洗脱,收集细胞筛选有活性的洗脱峰,挥发溶剂后得白色晶体10.5mg,纯度99.0％，VerticillinA的高效液相色谱图见图1。
2.结构鉴定：核磁共振仪(INOVA-400)，质谱仪(BrukerEsquire3000plus)。
3.实验结果：VerticillinA，分子式为C30H28N6O6S4，ESI-MS：m/z696.3，根据这些数据与文献(MinatoH,etal.JChemSocPerkin197317:1819-25)比较所得VerticillinA的化学结构如下：
实施例2VerticillinA体外抑制肿瘤细胞迁移；
实验材料和方法：
肿瘤细胞购自美国AmericanTypeCultureCollection并培养在DMEM培养基(Invitrogene)，添加5％小牛血清(Invitrogene)，2mM谷氨酰胺，37℃，10％CO2培养箱。
实验选择5种不同肿瘤细胞分别是4T-1(鼠乳腺癌)、Bcap37(人乳腺癌)、CT26(鼠结肠癌)、RKO(人结肠癌-转移性)、HCT116(人原发结肠癌)，分别添加或不添加VerticillinA24或48小时利用细胞划痕实验，显微观察分析肿瘤细胞的迁移情况(图2)，结果表明：0.1μMVerticillinA48小时处理可以显著抑制4T-1、CT26及RKO的细胞迁移达50％左右(图3-5)，而对Bcap37或HCT116影响不大(图略)。
VerticillinA溶解在DMSO中配成1mg/ml母液，置于-20℃冰箱，实验时用培养液稀释成所需浓度供用。
实施例3VerticillinA在体内抑制肿瘤细胞迁移；
实验材料和方法：细胞来源同实施例2。
我们选取了迁移能力最强的人结肠癌RKO细胞进行transwell实验，模拟verticillinA抑制细胞在体内的迁移，数据显示(图6)。
VerticillinA能够有效抑制RKO细胞的穿膜能力，抑制率也达到了近50％，我们也尝试用更高浓度的药物去处理细胞，然而并未得到更好的迁移抑制效果，这一发现与细胞划痕实验的数据是一致的。
实施例4VerticillinA抑制RKO细胞c-Met、u-PA和MMP1的基因表达
实验材料和方法：细胞来源同实施例2。
将人结肠癌肿瘤细胞RKO经0.1μMverticillinA处理24小时后，提取总RNA，并逆转录成cDNA；利用RT-PCR检测各种与肿瘤细胞转移相关的关键基因的表达变化情况。
我们对肿瘤细胞迁移相关的关键基因进行了筛查，结果显示(图7)。VerticillinA能够抑制RKO细胞c-Met、u-PA和MMP1的基因表达，其中以对MMP1抑制尤为显著，这些基因在肿瘤细胞迁移的过程中都起到非常关键的作用，例如原癌基因c-Met的编码产物是肝细胞生长因子参与细胞信号传导和细胞骨架重排；尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)参与细胞与细胞,细胞与细胞外基质(ECM)的基质金属蛋白酶(MMP)之间的相互反应和调节。
接来下我们将重点研究这些基因的表达变化是否与verticillinA对肿瘤细胞的迁移抑制相关。
实施例5VerticillinA通过下调c-Met蛋白表达影响肿瘤细胞的迁移
实验材料和方法：细胞来源同实施例2。
将结肠癌细胞RKO经过不同浓度的VerticillinA处理12小时，提取总蛋白。根据基因筛选的结果，我们利用蛋白免疫印迹技术，检测了相关蛋白在VerticillinA作用下的表达变化情况。结果显示(图8)，c-Met的表达受到了显著抑制，而u-PA的表达基本无变化。
接下来，我们将对VerticillinA如何通过c-Met影响肿瘤细胞的转移进行研究。
c-Met是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前认为，c-met与多种癌的发生和转移密切相关，研究表明，许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有c-met过度表达和基因扩增。
我们检测了肝细胞生长因子HGF在RKO细胞中激活c-Met的情况以及VerticillinA对这一激活过程的影响。并利用Transwell实验检测了VerticillinA在c-Met活化情况下，对结肠癌细胞转移的抑制作用。
结果表明：HGF能够有效激活c-Met，表现为c-Met在生长因子处理下，磷酸化水平的显著升高。如图9所示，生长因子处理3小时后，c-Met即被激活。VerticillinA能够抑制HGF激活c-Met，在9小时的时候，效果尤为明显。
我们利用Transwell实验，检测了HGF对肿瘤细胞转移能力的影响，以及VerticillinA是否能够作用于这一影响。
结果表明，HGF显著增强了肿瘤细胞的转移能力，而VerticillinA又有效地抑制了这一过程，表明VerticillinA有抑制肿瘤细胞转移的潜能(图10-11)。
实施例6VerticillinA与TRAIL组合有效抑制了小鼠体内结肠癌细胞的肺部转移。
实验材料和方法：细胞来源同实施例2。
实验模型的建立：20g大小的BALB/C雌性小白鼠，饲养2天后，静脉注射CT26细胞2.5*105到小鼠17天后，将小鼠解剖，向肺部注射墨水使之充盈，可见肿瘤细胞转移至肺部并形成固体瘤。
将105个小鼠结肠癌细胞CT-26尾静脉注射到BALB/C小鼠中，饲养3天后给药处理，剂量为10μgVerticillinA每只小鼠，TRAIL100μg/只，VerticillinA与TRAIL使用剂量的重量比是1:10(微克)。对照组为PBS处理。每两天给一次药，21天后，处死小鼠，并剥离肺组织，在10％的甲醛溶液中固定，计数肺部肿瘤颗粒数量，并拍照。结果如图12、13所示，VerticillinA与TRAIL组合有效抑制了结肠癌细胞的肺部转移。
综上实施例显示，本发明提供的verticillinA对多种人的以及小鼠的结肠癌和乳腺癌细胞都有较强的抗肿瘤转移效果，与TRAIL组合使用增敏效果更强。表明verticillinA是一广谱的有效的TRAIL抗肿瘤转移增敏剂。目前临床上缺乏能有效逆转肿瘤对TRAIL耐药性的抗肿瘤转移药物，因此verticillinA尤其是与TRAIL组合具有很好的应用前景。

Claims (4)

1.一种轮枝孢菌素A在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述轮枝孢菌素A的分子式为C50H28N6O6S4，分子量696.3，其特征在于，所述药物由轮枝孢菌素A与制剂允许的药物赋形剂或载体制成，所述肿瘤为肝癌、结肠癌和乳腺癌。
2.根据权利要求1所述的一种轮枝孢菌素A在制备抗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于，所述药物由轮枝孢菌素A与TRAIL按1:10比例组合，再与制剂允许的药物赋形剂或载体制成。
3.根据权利要求1或2所述的一种轮枝孢菌素A在制备抗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式选用液体制剂、固体制剂或胶囊剂。
4.根据权利要求3所述的一种轮枝孢菌素A在制备抗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂的给药形式为口服给药或注射给药。
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