CN103520195A

CN103520195A - 克力托辛在制备增敏剂中的应用

Info

Publication number: CN103520195A
Application number: CN201310230334.3A
Authority: CN
Inventors: 孙建国; 刘非燕; 吴平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明提供克力托辛在制备逆转肿瘤TRAIL耐药性的增敏剂中的应用，该克力托辛分子式为C₉H₁₃N₅O₆，分子量287。所述药物由clitocine与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。本发明提供的clitocine对多种人的以及小鼠的肝癌细胞、结肠癌和乳腺癌细胞都有较强的TRAIL增敏效果，能够在较低剂量下有效增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，并以协同作用的方式诱导肿瘤细胞凋亡，是一种广谱的有效的TRAIL增敏剂，为TRAIL抗肿瘤药物的安全、广泛应用提供了保障。

Description

克力托辛在制备增敏剂中的应用

技术领域

本发明属制药技术领域，涉及克力托辛在制备逆转肿瘤细胞对TRAIL耐药性的增敏剂中的应用。

背景技术

TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）是肿瘤坏死因子超家族的一个成员，由于能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，自被发现以来研究人员就将其作为一个选择性抗肿瘤药物进行着广泛的研究。近期，以TRAIL为主体的肿瘤治疗正在进行I期和II期临床试验（www.clinicaltrails.gov）。虽然TRAIL在临床前试验中表现了良好的选择特异性和较低的细胞毒性，TRAIL在肿瘤临床治疗中的疗效非常有限。究其原因，就是肿瘤细胞特别是转移性肿瘤细胞对TRAIL产生了耐药性。已有的研究表明，肿瘤细胞对TRAIL的耐药性的分子机制非常复杂。

因此，寻找新型有效的TRAIL增敏剂与TRAIL协同作用以治疗肿瘤具备了广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供克力托辛（clitocine）在制备逆转肿瘤TRAIL耐药性的增敏剂中的应用，该clitocine是从高等真菌大白桩菇菌（Leucopaxillus giganteus）子实体中分离所得，分子式为C₉H₁₃N₅O₆，分子量287。所述药物由clitocine与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。本发明所述的高等真菌大白桩菇菌（Leucopaxillus giganteus）属白蘑科，夏秋季于草原上单生或群生，有时生于林中草地上。分布于河北、内蒙古、吉林、辽宁、山西、黑龙江、青海、新疆等地。所述肿瘤主要包括肝癌、结肠癌和乳腺癌。

本发明提供的药物，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。

本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。

本发明提供的clitocine对多种人的以及小鼠的肝癌细胞、结肠癌和乳腺癌细胞都有较强的TRAIL增敏效果。表明clitocine是一广谱的有效的TRAIL增敏剂。目前临床上缺乏能有效逆转肿瘤对TRAIL耐药性的药物，因此clitocine具有很好的应用前景。本发明Clitocine 能够在较低剂量下有效增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，并以协同作用的方式诱导肿瘤细胞凋亡。因此clitocine具有很好的逆转肿瘤细胞对TRAIL耐药性的应用前景，为TRAIL抗肿瘤药物的安全、广泛应用提供了保障。

附图说明

图1是clitocine的液相色谱分析。

图2(A、B)是clitocine与TRAIL协同作用有效抑制人肝癌细胞HepG2的体外生长。

图3(A、B)是clitocine与TRAIL协同作用有效抑制人乳腺癌细胞MCF-7的体外生长。

图4(A、B)是clitocine与TRAIL协同作用有效抑制人结肠癌细胞SW620的体外生长。

图5(A、B)是clitocine与TRAIL协同作用有效抑制人结肠癌细胞LS411N的体外生长。

图6(A、B)是clitocine与TRAIL协同作用有效抑制人结肠癌细胞HCT116的体外生长。

具体实施方式

以下将结合具体实施例与附图详细说明本发明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1：从新鲜大白桩菇菌子实体提取分离纯化抗肿瘤活性化合物及其结构鉴定

1.提取和纯化：将原料新鲜大白桩菇菌子实体（2.7kg）真空冷冻干燥，粉碎机粉碎，所得340g菌粉浸于1.5L 95%（v/v）酒精中，其间更换新鲜溶剂一次，合并两次浸提液，减压浓缩得酒精浸膏(25.7g)，浸膏经乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯浸膏(15.7 g)。取15g乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，CH₂Cl₂/MeOH (10:0- 0:10)梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰(6.5g)，然后上反相株RP-18（ODS, 50 mm，Φ25×420 mm），MeOH/H₂O (1:9) 洗脱，细胞筛选有活性的部分再经过反相株RP-C₈制备[5 mm；Φ20×250 mm；MeOH/H₂O (5:95)；8 ml/min]，得到目的化合物clitocine(815mg)。其液相色谱分析图参见附图1，在洗脱时间9.0 分时出现单一峰即为clitocine。

2.结构鉴定：核磁共振仪（INOVA-400），质谱仪（Bruker Esquire 3000 plus）

3.实验结果：clitocine，分子式为C₉H₁₃N₅O₆，ESI-MS：m/z 287。其一维的二维的核磁数据列于表1。根据表1数据与文献比较所得clitocine的化学结构：

。

实施例2 人肝癌细胞HepG2对TRAIL耐药性以及clitocine与TRAIL配伍使用抑制人肝癌细胞HepG2的体外生长的检测

实验材料和方法：

肝癌细胞HepG2购自美国American Type Culture Collection并培养在DMEM培养基（Invitrogene），添加5%小牛血清（Invitrogene），2mM谷氨酰胺，37℃，10% CO₂培养箱。

四甲基偶氮唑盐（简称MTT法）检测药物对肿瘤细胞增殖的影响：选择对数生长期细胞，以1×10⁴的密度接种于96孔板中，置37℃，10%培养箱中培养4小时后加入不同浓度的药物，每个浓度设复孔3个，培养48小时，吸出孔板中培养液，往每孔中加入浓度为1mg/ml的MTT 50μl，放入培养箱中继续培养4小时，取出加过MTT的96孔板，每孔加入150μl的DMSO，轻轻震荡孔板10min，待孔底部的结晶物完全溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在570nm的各孔的光吸收值，记录结果，实验重复三次。

clitocine溶解在DMSO中配成1mg/ml母液，置于-20℃冰箱，实验时用培养液稀释成所需浓度供用。

实验结果见附图2。图2A为HepG2细胞以不同浓度的TRAIL处理48小时，利用MTT实验检测细胞对TRAIL的敏感性。结果显示即使在较高浓度如200 ng/μl的剂量下，也只有不到40%的细胞生长抑制率，说明HepG2细胞对TRAIL表现出比较高的耐药性。图2B为HepG2细胞经clitocine和TRAIL单独处理或者配伍处理48小时，利用MTT实验检测细胞的存活情况。结果显示，0.2 μM剂量的clitocine和100 ng/μl剂量的TRAIL都不能有效抑制细胞的生长，然而两者配伍使用则能显著抑制肿瘤细胞的体外生长，抑制率接近70%。可见clitocine对于HepG2细胞而言是一个有效的TRAIL增敏剂。

实施例3 人乳腺癌细胞MCF-7对TRAIL耐药性以及clitocine与TRAIL配伍使用抑制MCF-7细胞的体外生长的检测

实验材料和方法：细胞来源和MTT法同实施例2。

实验结果见附图3，图3A为MCF-7细胞以不同浓度的TRAIL处理48小时，利用MTT实验检测细胞对TRAIL的敏感性。结果显示在200 ng/μl的高剂量下，TRAIL对细胞生长几乎没有受到抑制，说明MCF-7细胞对TRAIL表现出很强的耐药性。图3B为MCF-7细胞经clitocine和TRAIL单独处理或者配伍处理48小时，利用MTT实验检测细胞的存活情况。结果显示，0.2 μM剂量的clitocine和100 ng/μl剂量的TRAIL都不能抑制细胞的生长，然而两者配伍使用则能显著抑制肿瘤细胞的体外生长，抑制率接近30%。可见虽然MCF-7 对TRAIL的耐药性很强，但是对于MCF-7细胞而言，clitocine仍是一个有效的TRAIL增敏剂。

实施例4 人结肠癌细胞SW620对TRAIL耐药性以及clitocine与TRAIL配伍使用抑制SW620细胞的体外生长的检测

实验材料和方法：细胞来源和MTT法同实施例2。

实验结果见附图4，图4A为SW620细胞以不同浓度的TRAIL处理48小时，利用MTT实验检测细胞对TRAIL的敏感性。结果显示在200 ng/μl的TRAIL几乎不影响的细胞生长， MCF-7细胞对TRAIL表现出较强的耐药性。图4B为SW620细胞经不同浓度clitocine单独处理或者与100 ng/μl TRAIL配伍处理48小时，利用MTT实验检测细胞的存活情况。结果显示，在0.2 μM剂量的clitocine和100 ng/μl剂量的TRAIL配伍使用下能显著抑制肿瘤细胞的体外生长，抑制率超过60%。可见对于SW620细胞而言，clitocine是一个较为有效的TRAIL增敏剂。

实施例5 人结肠癌细胞LS411N对TRAIL耐药性以及clitocine与TRAIL配伍使用抑制LS411N细胞的体外生长的检测

实验材料和方法：细胞来源和MTT法同实施例2。

实验结果见附图5，图5A为LS411N细胞以不同浓度的TRAIL处理48小时，利用MTT实验检测细胞对TRAIL的敏感性。结果显示在200 ng/μl的TRAIL对细胞的体外生长产生接近10%的抑制率，LS411N细胞对TRAIL表现为较强的耐药性。图5B为LS411N细胞经不同浓度clitocine单独处理或者与100 ng/μl TRAIL配伍处理48小时，利用MTT实验检测细胞的存活情况。结果显示，在0.2 μM剂量的clitocine和100 ng/μl剂量的TRAIL配伍使用下能显著抑制肿瘤细胞的体外生长，抑制率超过70%。可见对于LS411N细胞而言，clitocine是一个有效的TRAIL增敏剂。

实施例6 人结肠癌细胞HCT116对TRAIL耐药性以及clitocine与TRAIL配伍使用抑制HCT116细胞的体外生长的检测

实验材料和方法：细胞来源和MTT法同实施例2。

实验结果见附图6，图6A为HCT116细胞以不同浓度的TRAIL处理48小时，利用MTT实验检测细胞对TRAIL的敏感性。结果显示HCT116细胞对TRAIL较为敏感，在25 ng/μl的剂量下，TRAIL对细胞的体外生长产生接近50%的抑制率。图6B为HCT116细胞经0.2 μM clitocine与不同浓度的TRAIL配伍处理48小时，利用MTT实验检测细胞的存活情况。结果显示，在0.2 μM剂量的clitocine和5 ng/μl剂量的TRAIL配伍使用下能显著抑制肿瘤细胞的体外生长，抑制率超过50%。

可见对于HCT116细胞而言，虽然该细胞对TRAIL非常敏感，然而clitocine能够在很低剂量的TRAIL（5 ng/μl）配伍作用下，有效抑制细胞生长。因此clitocine是HCT116细胞的有效的TRAIL的增敏剂。

综上实施例显示，本发明提供的clitocine对多种人的以及小鼠的肝癌细胞、结肠癌和乳腺癌细胞都有较强的TRAIL增敏效果。表明clitocine是一广谱的有效的TRAIL增敏剂。目前临床上缺乏能有效逆转肿瘤对TRAIL耐药性的药物，因此clitocine具有很好的应用前景。

Claims

1.一种克力托辛在制备逆转肿瘤TRAIL耐药性的增敏剂中的应用，所述克力托辛的分子式为C₉H₁₃N₅O₆，分子量287，其特征在于，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体制成，所述肿瘤为肝癌、结肠或乳腺癌。

2. 根据权利要求1所述的一种克力托辛在制备逆转肿瘤TRAIL耐药性的增敏剂中的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式选用液体制剂、固体制剂或胶囊剂。