CN105543265A - 一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-l-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法。其中，生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统是指，在生物细胞内利用脯氨酸-4-羟化酶在α-酮戊二酸及亚铁离子存在的情况下，将游离的L-脯氨酸转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸的生产方法。提高脯氨酸转化率的方法为：打断生物细胞内脯氨酸的降解途径。通过使用这种方法，顺式-3-羟基-L-脯氨酸的转化率达到了100％。

Description

一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法
技术领域
一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)为亚氨基酸，是脯氨酸羟基化后的产物，根据其羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。自然界中反式-4-羟脯氨酸较为常见，顺式-3-羟基-L-脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。顺式-3-羟基-L-脯氨酸广泛应用于医药、营养和美容业等方面。
目前，国内外生产羟脯氨酸的方法主要有3种：水解法，化学合成法以及生物合成法。水解法主要用于提取动物骨胶原中的反式-4-羟脯氨酸[16]，由于顺式-3-羟脯氨酸在骨胶原中含量极少，因而无法通过常见的水解法获得。已有的研究报道中，获取顺式-3-羟脯氨酸的方法主要是化学合成法和微生物转化法。
生物合成法能将游离的脯氨酸通过脯氨酸-3-羟化酶的催化，转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸，但在生物细胞中，游离的脯氨酸也是一种可以被利用的碳源，所以有必要打断生物细胞的脯氨酸降解途径，以阻止菌体降解脯氨酸。
本发明所提供的使含有重组DNA的顺式-3-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，具有重要的工业应用价值。
发明内容
针对生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸时，需降解脯氨酸会限制顺式-3-羟脯氨酸合成等缺点，本发明的目的是提供一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中能够有效提高脯氨酸转化率的方法。
本发明是一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法。其特征是：在利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程中，通过打断生物细胞内的脯氨酸降解途径来提高脯氨酸的有效转化率及顺式-3-羟基-L-脯氨酸的产量。
本发明所述重组细胞的构建方法：
1.含有脯氨酸-3-羟化酶基因的载体的构建
根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础上，消除低使用率的密码子，优化脯氨酸-3-羟化酶基因，使得其更有利于在大肠杆菌中得到表达。同时，选用色氨酸串联启动子作为其启动子，对其进行优化，使得羟化酶基因得到更为高效的表达。
2.通过敲除基因putA打断细胞内的脯氨酸降解途径
putA(EC:1.5.99.81.5.1.12)基因编码的蛋白PutA同时具有脯氨酸脱氢酶(PRODH)和Δ-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(P5C)两个催化区域，从而将脯氨酸氧化为谷氨酸。首先，通过PRODH的作用，脯氨酸被氧化为吡咯啉-5-羧酸(P5C)同时耦合着辅酶Q的还原，之后，P5C与水自发反应生成谷氨酸-γ-半醛，再在Δ-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的催化作用下，转变为谷氨酸。同时PutA蛋白也是一种多功能的DNA结合转录因子，在脯氨酸供应不足的情况下会作为转录阻遏子从而阻遏基因putA和putP(表达的PutP是主要的脯氨酸转运体)的表达。
敲除putA基因，可以有效的打断细胞内由L-脯氨酸降解为谷氨酸的过程，从而积累更多的L-脯氨酸，有利于羟脯氨酸的产生。
3.重组大肠杆菌的发酵实验
35℃、220rpm培养24h，包括BL21(DE3)△putA(pET21a-ptrp2-H3p)，取发酵液测定顺式-3-羟脯氨酸的含量。
附图说明
图1.顺式-3-羟脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。
图2.色氨酸启动子质粒图谱。
图3.表达质粒pET21a-ptrp2-H3p图谱。
具体实施方式
LB培养基:1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl，pH7.0-7.2。
Amp(Kan)抗性平板：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂糖，氨苄青霉素(卡那霉素)50μg/mL。
5×KCM(大肠杆菌转化缓冲液):0.5MKCl，0.15MCaCl2，0.25MMgCl2。
顺式-3-羟脯氨酸的定量测定：将发酵液离心后，取上清，稀释到2.5mL后加于10mL试管中，之后加入0.2mLCuSO4·5H2O(CuSO4·5H2O浓度：0.05M)，然后依次加入0.5mLNaOH(NaOH浓度：2.5M)、0.5mLH2O2(0.5％)、0.8mLH2SO4(H2SO4浓度：4M)、2mL显色剂(显色剂：称取5g对二甲氨基苯甲醛，用45mL去离子水，缓慢加入55mL正丙醇)摇匀后迅速将试管移至70℃水浴锅中，保温3min，再用冷水冷却，最后用紫外分光光度计在560nm波长处测定吸光值。
实施例1：色氨酸串联启动子序列的设计
色氨酸串联启动子来源于ptrpL1质粒，质粒图谱如说明书附图2，该质粒的色氨酸启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子，在SD序列跟起始密码子序列之间有ClaI酶切位点，同时，色氨酸启动子的-35区上游有HindⅢ酶切位点，这样便于将启动子连接到其他的表达载体上。由于两个色氨酸启动子串联起来可提高表达强度，因此，根据ptrpL1质粒的色氨酸启动子序列，全基因合成色氨酸串联启动子。
通过优化色氨酸串联启动子，将HindⅢ酶切位点AAGCTT修改为EcoRI酶切位点GAATTC，同时，为了使串联启动子内部的酶切位点单一，因此将两个色氨酸启动子的结合部位的ClaI酶切位点ATCGAT修改为ATGTCGAC，使得连接处变为SalI酶切位点，同时，在第二个色氨酸启动子序列的ClaI酶切位点后面加入一个HindⅢ酶切位点AAGCTT，这样可利用酶切等分子操作来优化SD序列与起始密码子之间的距离，使得目的基因得到高效表达。
本实施方式中色氨酸启动子基因序列的原始序列，见SEQIDNO:1。本实施方式中优化的色氨酸串联启动子序列为人工合成；优化的色氨酸串联启动子序列见SEQIDNO:2。
实施例2：脯氨酸-3-羟化酶基因序列的设计
根据大肠杆菌的密码子使用频率来优化基因密码子，消除低使用率的密码子，同时利用同义转化方法消除EcoRI酶切位点，将原始序列中的终止子修改为TAAT强终止子，为了便于将脯氨酸-3-羟化酶基因连接到其他质粒载体上，因此在终止子后面插入一个酶切位点BamHI(GGATCC)。
还要考虑到mRNA的二级结构，首先要保证ATG起始密码子及其后的几个碱基组成的密码子翻译口袋呈打开状态，降低核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。
本实施方式中优化的脯氨酸3-羟化酶基因序列为人工合成；优化的脯氨酸3-羟化酶序列见SEQIDNO:3。
实施例3:脯氨酸3-羟化酶基因表达载体的构建
先分别合成设计好的色氨酸串联启动子与脯氨酸3-羟化酶基因，由于色氨酸串联启动子基因序列5’端序列带有EcoRI(GAATTC)酶切位点，3’端有HindⅢ(AAGCTT)酶切位点，而脯氨酸3-羟化酶基因5’端序列带有HindⅢ(AAGCTT)酶切位点，而3’端有BamHⅠ(GGATCC)酶切位点。
将色氨酸串联启动子基因序列用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切，将脯氨酸3-羟化酶基因用HindⅢ和BamHI双酶切，同时，将质粒载体pET21a也分别用EcoRI和BamHI消化处理。将双切酶后的色氨酸串联启动子基因序列、脯氨酸3-羟化酶基因以及pET21a质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将三个基因片段连接起来，将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
转化过程为：将6μL连接液加入至50μL的BL21(DE3)感受态细胞中，然后再加入10μL的5×KCM缓冲液，混匀后，在冰上放置30min后，42℃热激90s，然后在冰上放置5min后，加入500μL的SOC培养基，37℃，200rpm培养60min后，涂布至Amp抗性平板上，培养12h后。
然后提取质粒进行验证，进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的pET21a-ptrp2-H3p重组质粒，质粒图谱如说明书附图3，同时获得重组大肠杆菌BL21(DE3)pET21a-ptrp2-H3p。
实施例4：putA基因敲除
由NCBI获得putA的基因序列，采用短同源臂，设计引物对P1(TTAACCTATAGTCATTAAGCTGGCGTTACCGCCAGCGGCAGCGGTATTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)P2(ATGGGAACCACCACCATGGGGGTTAAGCTGGACGACGCGACGCGTGAGCGCATATGAATATCCTCCTTAG)以pKD4为模板，获得含有putA上下游同源臂和抗性基因(Kan)的打靶片段。通过化学转化法获得含有质粒pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)，之后将其制备为电转感受态，利用电转仪将打靶片段导入到电转感受态中，在质粒pKD46表达的三个蛋白的作用下，利用Red重组系统完成基因重组。电转后，30℃复苏3h，涂布含有卡那霉素的平板。之后转入质粒pCP20，用于消除抗性基因，将菌株分别点种于无抗性、Amp抗性平板、Kan抗性平板，选择只在无抗性平板上生长的单菌落。利用引物对Y1(CGAGCTCGAGAATAGCCATCTAAAGTCTCCA)和Y2(CCGCATATGTGGGCTTCCACTCAACATTAC)，菌落PCR验证基因是否敲除，从而获得敲除基因putA缺失型的菌株——BL21(DE3)△putA。
实施例5：重组菌株的发酵实验
摇瓶培养：挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，37℃、220rpm培养8h后，按8％(V/V)接种量接入含有30mL发酵培养基(1％(W/V)葡萄糖，0.5％(W/V)甘油，0.8％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)硫酸铵，0.1％(W/V)磷酸氢二钾，0.2％(W/V)氯化钠，3mM硫酸亚铁，0.2g/L硫酸镁，0.015g/L氯化钙，30mML-脯氨酸，pH7.5)的250mL摇瓶中，在旋转式摇床中30℃、220rpm培养24h。取发酵液检测顺式-3-羟脯氨酸浓度。顺式-3-羟脯氨酸的测定方法详见实施方式一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌BL21(DE3)△putA/pET21a-ptrp2-H3p的顺式-3-羟脯氨酸产量达到0.36mM，脯氨酸转化率约为百分之百。

Claims (4)

1.一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法，其特征在于，在利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程中，通过打断生物细胞内的脯氨酸降解途径来提高脯氨酸的有效转化率及顺式-3-羟基-L-脯氨酸的产量。
2.如权利要求1所述，利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程是指，生物细胞利用外源添加或者自身积累的脯氨酸，在脯氨酸-3-羟化酶及α-酮戊二酸和亚铁离子存在的情况下，将游离的L-脯氨酸转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
3.如权利要求1所述，打断生物细胞内的脯氨酸降解途径的方法：包括生物细胞内与脯氨酸降解途径的相关酶不能被表达或者不能行使功能的方法，如基因敲除、RNA干扰等。
4.如权利要求1和2所述，生物细胞包括任何能够表达脯氨酸-3-羟化酶，自主产生α-酮戊二酸，将脯氨酸转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸的有机体，如大肠杆菌、酵母、动植物细胞等。
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