CN105532473B - 一种金钗石斛种苗的组培方法 - Google Patents

Abstract

本专利公开了一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇浸没液体培养系统的系列步骤：步骤一MS培养液的配置与灭菌消毒：MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.5～5.0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L、蔗糖30g/L，调节pH值为5.70～6.00，配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，采用湿热灭菌法进行灭菌后备用；步骤二利用湿热灭菌法对间歇浸没式生物反应器进行灭菌；步骤三、将外植体接种到含有MS培养液的间歇浸没式生物反应器中；步骤四、设定间歇浸没式生物反应器的相关参数。使用该发明技术方案繁殖金钗石斛种苗，具有增殖率高、自动化程度高、劳动量小、组培苗质量好、适应性强的有益技术效果。

Description

一种金钗石斛种苗的组培方法

技术领域

本发明涉及药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种金钗石斛种苗组织培育繁殖的方法。

背景技术

金钗石斛为兰科多年生草本植物，别名为扁金钗、扁黄草、扁草、黄草等。金钗石斛种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽；若以分株或腋芽繁殖，耗时长且繁殖系数低，金钗石斛赖以生存的自然环境发生变化，野生资源锐减，加之长期采挖，种质资源稀缺，已濒临灭绝，已不能满足市场需求。

应用植物组织培育方法在一定程度上解决了金钗石斛种苗短缺的现象，有关金钗石斛的快速繁殖技术国内多有报道。然而，以琼脂为支持物进行固体或半固体培养的传统植物组织培养方法已日益凸显出不能适应产业呼吁低耗、高效的现实和发展需要。传统的组培方法培养基的营养成分单一，培养需要耗费大量琼脂，在灌装以及清洗时需处理大量容器，也需耗费大量劳动力，具有高人工成本、高能耗、高物料的缺点。同时，金钗石斛种苗的传统组培方法，一般一瓶最多能生长30株，产量少，移栽时需手工轻柔清洗掉根部的固体培养基，工作量大且容易损伤幼嫩根；在提取有效的次生代谢产物时，必须从琼脂中提取，工作量大。这些不利因素限制了传统组培技术的产业化利用，亟需对现有的主流组培方法和装置进行节约型、自动化的技术升级。

发明内容

本发明针对上述存在的技术问题，提供一种繁殖迅速、周期短、种苗产量高；自动化程度高的金钗石斛种苗方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.5～5.0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L和蔗糖30g/L，调节pH值为5.70～6.00，MS培养液配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；间歇浸没式生物反应器的灭菌：取间歇浸没式生物反应器在湿热高压灭菌锅内进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；

步骤二、制备金钗石斛外植体；

步骤三、接种：在无菌环境下将步骤一的MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将金钗石斛外植体接种到间歇浸没式生物反应器中；

步骤四、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为3～20min/4～12h，培养时间为60～180d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

本发明的有益效果为：步骤一增殖率高。本发明技术方案将制得的MS培养液消毒后倒入间歇浸没式生物反应器中，建立了间歇浸没液体培养系统，在无菌条件下利用无菌空气产生的压力将MS培养液与外植体间歇接触，结合了固体培养最大化气体交换和液体培养营养充分利用的优点，本发明方案金钗石斛培养的增殖率是传统的固体培养的10倍以上，是普通液体培养的3～7倍。

步骤二自动化程度高、劳动量小。间歇浸没液体培养系统实现了半自动化控制，整个培养过程只需要一次接种，同一间歇浸没式生物反应器中仅需更换一次MS培养液，省去了现有技术中频繁转接和大批量组培瓶的灌装清洗等的操作，大大的减少了劳动量，降低了生产成本。

步骤三、组培苗质量好，适应性强。同传统的固体培养基相比减少了继代次数，降低了变异率，并且在培养过程中进行了充分的气体交换，减少甚至避免了种苗玻璃化，繁殖得到的种苗更健壮；种苗环境适应能力强、移栽成活率高。

进一步，步骤二所述金钗石斛外植体为金钗石斛原球茎、金钗石斛组培苗中的一种。

进一步，步骤二金钗石斛外植体还可为金钗石斛腋芽，所述金钗石斛腋芽的制备方法为：第一步：制备MS固体培养基：MS、NAA0.5～5.0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；混合配置后备用；第二步：采用金钗石斛植株，用浓度为0.1～1.0%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株5～30min，然后用流动的水清洗30～60min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡15～30s，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1%的升汞浸泡10～20min，最后再用无菌水清洗3～7次；第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得腋芽并接种到步骤三的间歇浸没式生物反应器中。

进一步，步骤三中外植体的接种密度为：每升MS培养液中接种35～80个外植体。通过实验证实，当每升MS培养液中外植体接种量低于35个时，外植体没有充满整个间歇浸没式生物反应器反应器，空间利用率低，当每升MS培养液中外植体接种量高于80个时，间歇浸没式生物反应器中的外植体拥挤，出现畸形苗；每升MS培养液中接种35～80个外植体时，既能充分利用间歇浸没式生物反应器的空间及MS培养液中的营养，有不会导致外植体拥挤出现畸形苗的情况。

进一步，步骤一中马铃薯汁液为马铃薯研磨或榨汁方式制得。鲜物研磨、煎煮汁或榨汁获得马铃薯汁液既能满足破坏组织和细胞获得细胞内含物的目的，又不会破坏细胞内大分子结构。

进一步，步骤四中所述浸没频率为5～12min/8～10h。此浸没频率在最大限度节约能源消耗的基础上，既能够满足金钗石斛对营养的需求，又不会因营养过剩而出现缺氧、徒长等不健康生长等现象。

附图说明

图1为本发明一种金钗石斛种苗的组培方法实施例3接种时的初始状态图；

图2为对比例1接种时的初始状态图；

图3为本发明一种金钗石斛种苗的组培方法实施例3培养2周后的金钗石斛种苗的生长状态图；

图4为对比例1培养2周后的金钗石斛种苗的生长状态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步说明：

实施例1：一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇式浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、制备马铃薯汁液：选择完好无腐烂的马铃薯块茎，研磨或压碎榨汁，过滤取汁液，备用；

步骤二、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA1.0mg/L、马铃薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L，调节pH值在5.70～6.00范围内，配置完成后，将MS培养液倒入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；

步骤三、间歇浸没式生物反应器的灭菌：利用湿热灭菌法，将间歇浸没式生物反应器放入湿热高压灭菌锅内，在温度121℃、压力1.0MPa条件下对间歇浸没式生物反应器进行灭菌20min后备用；

步骤四、金钗石斛腋芽的制备：

第一步：制备MS固体培养基：MS固体培养基的组分及组分用量为：MS、NAA1.0mg/L、马铃薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；调节pH值为5.70～6.00范围内，静置，备用；

第二步：采用金钗石斛植株，用浓度为0.1%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株30min，然后用流动的水清洗60min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡30s，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1%的升汞浸泡20min，最后再用无菌水清洗7次；

第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得金钗石斛腋芽；

步骤五、接种：将MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将步骤四得到的金钗石斛腋芽接种到间歇浸没式生物反应器中，每升MS培养液中接种80个金钗石斛腋芽；

步骤六、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数：浸没频率为12min/10h，即间歇浸没式生物反应器工作12min后停止10h，然后再工作12min后再停止10h，如此重复，以下解释相同；培养时间定为90d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

金钗石斛培养增殖系数为26.1，将种苗移栽3个月后，植株成活率96.0%，且植株生长健康。

实施例2：一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇式浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、制备马铃薯汁液：选择完好无腐烂的马铃薯块茎，研磨或压碎榨汁，过滤取汁液，备用；

步骤二、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.7mg/L、马铃薯汁液150g/L、蔗糖30g/L，调节pH值在5.70～6.00范围内，配置完成后，将MS培养液倒入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；

步骤三、间歇浸没式生物反应器的灭菌：利用湿热灭菌法，将间歇浸没式生物反应器放入湿热高压灭菌锅内，在温度121℃、压力1.0MPa条件下对间歇浸没式生物反应器进行灭菌20min后备用；

步骤四、金钗石斛腋芽的制备：

第一步：制备MS固体培养基：MS固体培养基的组分及组分用量为：MS、NAA0.7mg/L、马铃薯汁液150g/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；调节pH值为5.70～6.00范围内，静置，备用；

第二步：采用金钗石斛植株，用浓度为1.0%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株5min，然后用流动的水清洗45min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡20s，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1%的升汞浸泡15min，最后再用无菌水清洗6次；

第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得制得金钗石斛腋芽；

步骤五、接种：将MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将步骤四得到的金钗石斛腋芽接种到间歇浸没式生物反应器中，每升MS培养液中接种50个金钗石斛腋芽；

步骤六、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为20min/12h，培养时间为150d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

此实施例：金钗石斛培养增殖系数为29.4，将种苗移栽3个月后，植株成活率98.2%，且植株生长健康。

实施例3：一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇式浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、制备马铃薯汁液：选择完好无腐烂的马铃薯块茎，研磨或压碎榨汁，过滤取汁液，备用；

步骤二、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg/L、马铃薯汁液100g/L、蔗糖30g/L，调节pH值在5.70～6.00范围内，配置完成后，将MS培养液倒入试剂瓶中，采用湿热灭菌法，在121℃、0.5MPa条件下灭菌20min后备用；

步骤三、间歇浸没式生物反应器的灭菌：利用湿热灭菌法，在121℃、0.5MPa条件下对间歇浸没式生物反应器进行灭菌20min后备用；

步骤四、金钗石斛腋芽的制备：

第一步：制备MS固体培养基：MS、NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg/L、马铃薯汁液100g/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；

第二步：采用金钗石斛植株，用浓度为0.5%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株20min，然后用流动的水清洗30min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡15s，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1%的升汞浸泡10min，最后再用无菌水清洗5次；

第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得制得金钗石斛腋芽；

步骤五、接种：将MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将步骤四得到的金钗石斛腋芽接种到间歇浸没式生物反应器中，每升MS培养液中接种35个金钗石斛腋芽；

步骤六、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为5min/8h，培养时间为60d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

此实施例：金钗石斛培养增殖系数为30.0，将种苗移栽3个月后，植株成活率100%，且植株生长健康。

实施例4：一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇式浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、制备马铃薯汁液：选择完好无腐烂的马铃薯块茎，研磨或压碎榨汁，过滤取汁液，备用；

步骤二、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA5.0mg/L、6-BA1.0mg/L、马铃薯汁液200g/L、蔗糖30g/L，调节pH值在5.70～6.00范围内，配置完成后，将MS培养液倒入试剂瓶中，

采用湿热灭菌法，在121℃、0.5MPa条件下灭菌20min后备用；

步骤三、间歇浸没式生物反应器的灭菌：利用湿热灭菌法，在121℃、0.5MPa条件下对间歇浸没式生物反应器进行灭菌20min后备用；

步骤四、金钗石斛腋芽的制备：

第一步：制备MS固体培养基：MS、NAA5.0mg/L、6-BA1.0mg/L、马铃薯汁液200g/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；

第二步：采用金钗石斛植株，用新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株25min，然后用流动的水清洗45min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡20s，用无菌水清洗2次，再用浓度为0.1%的升汞浸泡15min，最后再用无菌水清洗5次；

第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得制得金钗石斛腋芽；

步骤五、接种：将MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将步骤四得到的金钗石斛腋芽接种到间歇浸没式生物反应器中，每升MS培养液中接种50个金钗石斛腋芽；

步骤六、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为3min/4h，培养时间为180d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

此实施例：金钗石斛培养增殖系数为27.0，将种苗移栽3个月后，植株成活率97%，且植株生长健康。

实施例5：

与实施例3的区别在于：使用金钗石斛原球茎为外植体，并删除步骤四。

实施例6：

与实施例3的区别在于：使用金钗石斛组培苗为外植体，并删除步骤四。

对比例1：

与实施例3的区别在于：MS培养液和MS固体培养基中均不加入马铃薯汁液；但MS固体培养基中加入琼脂7g/mL。

实施例3与对比例1均培养满30天后，比较两组得到的金钗石斛种苗的长势情况，结果见表1。

表1

由表1可知：本发明技术方案的MS培养液中加入马铃薯汁液后，MS培养液中含的微量元素丰富，含有金钗石斛生长过程中不可缺少的微量元素成分，营养价值增高，与对比例1得到的金钗石斛种苗相比，本发明方案的金钗石斛种苗更健壮。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (4)

1.一种金钗石斛种苗的组培方法，其特征在于：建立间歇浸没液体培养系统，包括以下步骤：

步骤一、MS培养液的配置与灭菌消毒：

MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0 .5～5 .0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L和蔗糖30g/L，调节pH值为5 .70～6 .00，MS培养液配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0 .1～1 .0MPa，灭菌20min后备用；间歇浸没式生物反应器的灭菌：取间歇浸没式生物反应器在湿热高压灭菌锅内进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0 .1～1 .0MPa，灭菌20min后备用；

步骤二、制备金钗石斛外植体；

步骤三、接种：在无菌环境下将步骤一制得的MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将金钗石斛外植体接种到间歇浸没式生物反应器中；

步骤四、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为3～20min/4～12h，培养时间为60～180d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃；

所述金钗石斛外植体为金钗石斛腋芽，所述金钗石斛腋芽的制备方法为：

第一步：制备MS固体培养基：MS、NAA0 .5～5 .0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；混合配置后备用；

第二步：采用金钗石斛植株，用浓度为0 .1～1 .0%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株5～30min，然后用流动的水清洗30～60min；在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡15～30s，用无菌水清洗2次，再用浓度0 .1%的升汞浸泡10～20min，最后再用无菌水清洗3～7次；

第三步：将完成了第二步的金钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3～5d后取出，制得腋芽并接种到步骤三的间歇浸没式生物反应器中。

2.如权利要求1中任一项所述的金钗石斛种苗的组培方法，其特征在于：步骤三中外植体的接种密度为：每升MS培养液中接种35～80个外植体。

3.如权利要求1所述的金钗石斛种苗的组培方法，其特征在于：步骤一中马铃薯汁液为马铃薯研磨或榨汁方式制得。

4.如权利要求1所述的金钗石斛种苗的组培方法，其特征在于：步骤四中所述浸没频率为5～12min/8～10h。