CN105524161A - 抗肿瘤小分子多肽piddδ及其载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ及其载体和应用。该抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ为长度306个氨基酸的多肽，能特异性结合Keap1，阻断内源性PIDD-Keap1相互作用；细胞生物学实验表明多肽PIDDΔ具有抑制肺癌细胞活性、促进肺癌细胞凋亡的重要抗癌功能。发明为肺肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肺肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体是一种抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ及其载体和应用。
背景技术
目前，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首，是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。在中国，由于吸烟人数的快速上升，大气污染的日趋严重等因素，近年来肺癌发病率和死亡率一直呈明显攀升趋势。尽管近几年肺癌治疗包括化疗有了长足的进步，但是预后仍然不容乐观。过去25年肺癌患者化疗后的5年生存率仍未见显著提高，仅为15%。因此，加强治疗肺癌的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。
多肽药物是目前生物医药领域最具成长性的崭新领域，以其高效、安全、特异性强等特点逐渐用于癌症，传染病等预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物——蛋白质来实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功能的蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。并且多肽类药物具有分子量小，在人体内不结存，无副作用，免疫原性小，活性好等优点成为一个研究的热点。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ，其具有抑制肺癌细胞增殖的功效。本发明的另一目的是提供一种能表达上述抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的载体。本发明还有一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。
含有所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因的载体。
所述的载体，将抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因克隆到pCMV-HA真核表达载体构建而成。
所述小分子多肽PIDDΔ在制备抗肺癌药物中的应用。
本发明人的前期研究结果表明，PIDD可以通过与Keap1分子相互作用，导致促癌信号通路Nrf2的激活，进而上调多药耐药蛋白MRP1的表达，促进肺癌细胞的耐药存活。因此，阻断内源性PIDD与Keap1相互作用，便可抑制Nrf2信号通路的激活，进而抑制肿瘤细胞的生长及肿瘤细胞的增殖等作用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优点及效果：本发明提供的抗肿瘤小分子多肽能特异性结合Keap1，阻断细胞内源性PIDD与Keap1相互作用，抑制Nrf2信号通路激活，达到抗肿瘤的效果，在抗肿瘤药物制备中具有广泛的应用。
附图说明
图1是载体质粒pCMV-HA的结构示意图；
图2是多肽PIDDΔ重组真核表达载体酶切鉴定结果图；
图3是免疫印迹检测重组多肽PIDDΔ的表达结果图；
图4是CCK-8实验检测306aa多肽PIDDΔ对H1299细胞活性的抑制结果图；
图5是PI染色流式细胞术检测306aa多肽PIDDΔ抑制肺癌细胞进入S期图；
图6是克隆形成实验检测306aa多肽PIDDΔ抑制H1299细胞增殖结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：306aa多肽PIDDΔ重组
1）重组肽的克隆载体构建
提取人的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，上游引物P1为5’-GCGAATTCCTGGCCCATCTGGCCCAC-3’（含EcoRI酶切位点）；下游引物P2为5’-GAAGATCTCTAGAAGTGGGGCACCTGGC-3’（含BglII酶切位点），应用PCR技术成功扩增出306aa（SEQIDNO.1）对应的918bp的mRNA序列（SEQIDNO.2）。扩增得到的片段与pCMV-HA载体连接（载体图见图1），将连接产物（PIDD质粒）转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI、BglII酶切鉴定（图2）。
2）重组肽的真核表达载体构建及其表达鉴定
将含有306aa多肽PIDD核酸片段的pCMV-HA质粒经EcoRI酶切后，利用回收试剂盒获得该片段，同时用相同的酶处理质粒pcDNA3.1（约5kb），然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体pCMV-HA在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体。将正确连接的306aa多肽真核表达载体转染H1299细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹结果证明了多肽的表达（图3），分子量大小34KD。
主要过程如下：
以cDNA为模板，分别取上下游引物P1和P2各5μL，加入1μLpfuDNA聚合酶，10×bnuffer5μL，10×dNTP5μL，加双蒸水总体积为50μL进行PCR反应，起始变性94℃5min，然后执行如下反应条件：94℃30s，65℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸10min。
取PCR产物10μL，进行行1.2%普通琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约918bp的片段。取余下PCR产物40μL，进行1.2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化918bp的PIDDcDNA片段。
将PIDD质粒和HA质粒分别用EcoRI和BglII双酶切，前者回收918bp的PIDD片段，后者回收线性化的HA片段，然后行1.2%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，将918bp的PIDD片段和3800bp的线性化的HA片段分别切下混在一起进行纯化。纯化后PIDD片段和HA片段混合物用4μL双蒸水溶解，加入T4DNA连接缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL（3U/μL），总反应体积为10μL，室温连接4h。将10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，并铺在含氨苄青霉素（100μg/mL）的琼脂培养基上生长12h，挑选单个菌落接种于含氨苄青霉素（100μg/mL）TB培养基中培养12h，少量提取质粒，通过EcoRI和BglII双酶切鉴定。然后进行大量提取、纯化，用40μL消毒三蒸水溶解沉淀，命名为“pCMV-HA-PIDD”，-20℃保存以备用。
从40μLpCMV-HA-PIDD中取10μL，由上海铂尚测序公司进行测序。
pCMV-HA-PIDD重组片段表达鉴定：细胞传代：转染前一天，将0.5-1.5×10H1299细胞用1640培养基传代至6cm培养皿中，使得第二天转染时融合度在80-90%左右；将2-4ug的质粒加入200μL的无血清培养基中，混匀；将Lipofectamine2000取出，轻柔摇匀，再将质粒量1-3倍量的Lipofectamine2000用另一200μL的无血清培养基稀释，吹打混匀，静置5min；将质粒和Lipofectamine2000混匀，室温静置20min；将混合物加入培养皿中，轻柔地摇匀，静置，36-48h后收集细胞；RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹检测多肽的表达。
实施例2：重组肽抗肺癌功能的检测
1）CCK-8实验证明重组肽细胞水平的抗肺癌效应
CCK-8细胞增殖实验：在H1299细胞中，转染野生型，306aa片段截短的PIDD载体48h后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。每孔换液（CCK-8与培养液的比例为1:10），37℃孵育2h，终止培养，酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值，每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸光度值一次，共检测3天，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
主要方法为：在96孔板中接种H1299细胞悬液（100μL/孔），密度为104-105/mL，将培养板在培养箱预培养过夜（在37℃，5%CO2的条件下），刺激细胞。到达时间点后换液，向每孔加入100μL含10μLCCK-8溶液的细胞培养基（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。（不同时间点要保持相同的时间）用酶标仪测定（测定波长490nm，参照波长630nm）处的吸光度。
结果如图4所示，转染306aa的多肽片段PIDDΔ的细胞增殖速度低于与对照组。
2）PI染色流式细胞术实验证明重组肽细胞水平的抗肺癌效应
PI染色流式细胞分析术检测细胞周期：在H1299细胞中，转染野生型、306aa片段截短的PIDD载体48h后收集到5mLEP管中离心后弃掉培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤3次，离心，弃掉PBS，用70%乙醇重悬，置于-20℃固定至少24h。检测前，离心收集的细胞，弃乙醇，用PBS洗涤3次，并用含1%TritonX-100的PBS，4℃通透，每管200μL。后加入RNaseA，避光4℃反应，每管300-400μL。加入200μLPI染色剂，避光4℃染色20min，每管200μL，流式细胞仪检测。
主要过程为：收集细胞：培养细胞到合适时间点，胰酶消化后，用完培终止并收集到5mLEP管中离心，1200rpm离心5min，弃掉培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤2次。固定：再离心，弃掉PBS，用70%乙醇重悬，置于-20℃固定至少24小时。1200rpm离心5min，弃乙醇，用PBS洗涤3次，并用含1%tritonX-100的PBS4℃通透10min，每管200μL。加入RNaseA，与tritonX-100的PBS比例为1:1000，避光4℃反应20min，每管300-400μL。加入200μLPI染色剂，避光4℃染色20min，每管200μL，过滤（400目筛子）。置于冰盒内，流式细胞仪检测。
结果如图5所示，对照组细胞停滞在G1期的为71.52%，而转染306aa的多肽片段PIDDΔ的细胞停滞在G1期的为73.04%，并且进入S期的细胞由21.04%逐渐增加到22.31%。与对照组相比，转染306aa的多肽片段PIDDΔ后能够将细胞周期阻滞在G1/S期，有明显的细胞周期抑制作用。
3）克隆形成实验证明重组肽细胞水平的抗肺癌效应
在H1299细胞中，转染野生型、306aa片段截短的PIDD载体36~48h后，分别将1000个细胞铺与6mm中皿中，培养15-20天，结晶紫染色后拍摄图像。
主要过程为：取对数生长期的H1299细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度（根据增殖能力）接种于培养皿中。以每皿1000个细胞的梯度密度接种含3mL37℃预温培养液的6mm中皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆。
结果如图6所示，相同的培养时间内，转染了54aa多肽的细胞组集落形成的数量明显少于对照组。
SEQUENCELISTING
<110>南通大学
<120>抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ及其载体和应用
<130>100
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>306
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>人的PIDDΔ蛋白
<400>1
SerTrpTyrTrpLeuTrpTyrThrThrLysAsnCysValGlyGlyLeu
151015
AlaArgLysAlaTrpGluArgLeuArgLeuHisArgValAsnLeuIle
202530
AlaLeuGlnArgArgArgAspProGluGlnValLeuLeuGlnCysLeu
354045
ProArgAsnLysValAspAlaThrLeuArgArgLeuLeuGluArgTyr
505560
ArgGlyProGluProSerAspThrValGluMetPheGluGlyGluGlu
65707580
PhePheAlaAlaPheGluArgGlyIleAspValAspAlaAspArgPro
859095
AspCysValGluGlyArgIleCysPheValPheTyrSerHisLeuLys
100105110
AsnValLysGluValSerPheTyrArgGlyAlaValProValArgVal
115120125
ProGluGluAlaGluAlaAlaArgGlnArgLysGlyAlaAspAlaLeu
130135140
TrpMetAlaThrLeuProIleLysLeuProArgLeuArgGlySerGlu
145150155160
GlyProArgArgGlyAlaGlyLeuSerLeuAlaProLeuAsnLeuGly
165170175
AspAlaGluThrGlyPheLeuThrGlnSerAsnLeuLeuSerValAla
180185190
GlyArgLeuGlyLeuAspTrpProAlaValAlaLeuHisLeuGlyVal
195200205
SerTyrArgGluValGlnArgIleArgHisGluPheArgAspAspLeu
210215220
AspGluGlnIleArgHisMetLeuPheSerTrpAlaGluArgGlnAla
225230235240
GlyGlnProGlyAlaValGlyLeuLeuValGlnAlaLeuGluGlnSer
245250255
AspArgGlnAspValAlaGluGluValArgAlaValLeuGluLeuGly
260265270
ArgArgLysTyrGlnAspSerIleArgArgMetGlyLeuAlaProLys
275280285
AspProAlaLeuProGlySerSerAlaProGlnProProGluProAla
290295300
GlnAla
305
<210>2
<211>921
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>人的PIDDΔ基因序列
<400>2
tcctggtactggctctggtacaccaccaagaactgtgtgggaggcctggctcggaaggcc60
tgggagcggctgcggctgcaccgtgtgaacctcatcgctctgcagcggcgccgggaccct120
gagcaggtcctgctgcagtgcctgccccgaaacaaggtggacgccacccttcggcggctg180
ctggagcggtaccggggccccgagccctctgacacggtggagatgttcgagggcgaagag240
ttctttgcggccttcgagcgcggcatcgacgtggatgctgaccgccctgactgtgtggag300
ggcagaatctgctttgtcttctactcgcacctgaagaatgtgaaggaggtgtccttctac360
cgtggcgcggtgcctgtgcgggtgcccgaggaggctgaggctgcccggcagaggaagggc420
gcagacgccctgtggatggccactctgcccatcaagctgccgagacttcgagggtccgag480
gggccacggcggggggctggcctctccttggcacccttgaatctgggagatgccgagacc540
ggctttctgacgcagagcaacctgctgagtgtggctgggcgtctgggtctggactggcca600
gccgtggccctgcacctgggggtgtcctaccgggaggtgcagcgcatccggcacgagttc660
cgggatgatctggatgagcagatccgtcacatgctcttctcctgggctgagcgccaggct720
gggcagccaggggctgtggggctcctggtgcaggccctggagcagagtgaccggcaggac780
gtggctgaagaggtgcgcgcagtcttggagctcggccgccgcaagtaccaggacagcatc840
cgacgcatgggcttggcccccaaggaccccgctctgcctggctcctcggctccacagccc900
ccagagcctgcccaggcctag921
<210>3
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>上游引物P1序列
<400>3
gcgaattcctggcccatctggcccac26
<210>4
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>下游引物P2序列
<400>4
gaagatctctagaagtggggcacctggc28
Claims (5)
1.抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。
3.含有权利要求2所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：将抗肿瘤小分子多肽PIDDΔ的编码基因克隆到pCMV-HA真核表达载体构建而成。
5.权利要求1所述小分子多肽PIDDΔ在制备抗肺癌药物中的应用。
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| CN201610081404.7A CN105524161A (zh) | 2016-02-05 | 2016-02-05 | 抗肿瘤小分子多肽piddδ及其载体和应用 |
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|---|---|---|---|---|
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-
2016
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2003057892A2 (en) * | 2002-01-14 | 2003-07-17 | Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs | Viruses with enhanced lytic potency |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
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| LIN ET AL.: "Pidd, a new death-domain–containing protein, is induced by p53 and promotes apoptosis.", 《NATURE GENETICS》 * |
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| YUNPING LIN ET AL.: "Pidd, a new death-domain–containing protein, is induced by p53 and promotes apoptosis.", 《NATURE GENETICS》 * |
| 无: "p53-induced death domain-containing protein 1 isoform X2 [Homo sapiens]", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE: XP_011518511.1》 * |
| 无: "UniProtKB-Q9HB75(PIDD1_HUMAN)", 《EMBL-EBI》 * |
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