CN102719435B

CN102719435B - 抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN102719435B
Application number: CN 201210183751
Authority: CN
Inventors: 费嘉; 谷景义; 朱雪娇; 骆小闯; 李育敏
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2012-06-05
Filing date: 2012-06-05
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-06-05
Also published as: CN102719435A

Abstract

本发明公开了一种抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用，所述的siRNA的正义链序列为：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，反义链序列为：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'。本发明抑制PDCD4基因表达的siRNA为研究PDCD4基因的功能提供了新的技术方案，用该siRNA沉默PDCD4后可显著降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。

Description

抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种抑制PDCD4基因表达的siRNA及其在研究PDCD4基因功能中的应用。

背景技术

程序性细胞死亡因子4（Programmed cell death4,PDCD4）是近年来发现的一种新的抑癌基因，研究报道其在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤和肝细胞癌等多种恶性肿瘤细胞中表达缺失或低表达。Chen等（Chen Y，Knosel T,Kristiansen G.J Pathol,2003,(5):640-646.）通过研究124例不同亚型的原发性肺癌样本，结果显示，83%的肿瘤样本中PDCD4蛋白表达缺失，相对于肺部正常组织中PDCD4mRNA的表达，肺癌组织中PDCD4mRNA的表达水平比正常肺部组织中显著降低。Afonja等（Afonja O,Juste D,Das S,et al.Oncogene,2004,23:8135.）在对乳腺癌细胞系的研究中发现，通过转染PDCD4到T-47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞系，可以诱导细胞凋亡的发生。Zhang等（Zhang H,Ozaki I,Mizuta T,et al.Oncogene,2006,25(45):6101-6112.）发现PDCD4也可以诱导肝癌细胞系Huh7的凋亡。PDCD4的表达产物可调节细胞的程序性死亡，也可通过抑制凋亡相关基因的转录或翻译从而抑制肿瘤的生成或肿瘤细胞的生长。

肿瘤细胞中PDCD4的表达水平与药物对细胞的敏感性之间存在一定的关系。通过转染反义PDCD4可以明显减弱肾癌细胞系UO-31对药物葛尔德霉素的敏感性，说明细胞中下调PDCD4的表达会减弱药物的细胞毒性（Bohm,M.,Sawicka,K.,Siebrasse,J.P.,Brehmer-Fastnacht,A.,Peters,R.,& Klempnauer,K.H.(2003).Oncogene,22(31),4905-4910.）。此外，通过转染全长PDCD4cDNA的质粒到人胃腺癌细胞系BGC-823中，增强PDCD4蛋白在细胞中的表达，发现其可相应的增强BGC-823细胞对药物羟基喜树碱（HCPT）的敏感性（王汉卿，孙震晓。世界华人消化杂志，2009，（7）：647-651.）。Jansen等（Jansen,A.P.,Camalier,C.E.,Stark,C.,& Colburn,N.H.Mol Cancer Ther,2004,3(2),103-110.）。研究发现PDCD4的表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，肿瘤细胞中PDCD4的表达水平与细胞对抗肿瘤药物的敏感性正相关，上调PDCD4的表达会增加细胞对某些化疗药物的敏感性，反之，下调PDCD4的表达则会引起某些药物对细胞毒性的减弱。

然而PDCD4在白血病中的功能研究较少，最近的研究发现，在急性髓性白血病（Acute myelogenous leukemia,AML）中，PDCD4的表达可促进维A酸诱导的粒细胞分化（Ozpolat B,Akar U,Steiner M,et al.Mol Cancer Res,2007,5:95.）。近期的报道表明，在白血病中PDCD4基因直接被miRNA-21调控，抑制miRNA-21可以导致PDCD4的表达水平显著升高，并展示出显著的抗白血病作用（①Yumin Li,Xujiao Zhu,et al.Cancer Science.2010,101(4):948-954;②HaiyanHu,Yumin Li,Jingyi Gu,et al.Leuk Lymphoma.2010,51(4):694-701;③Jingyi Gu,Xujiao Zhu,Yumin Li,et al.Med Oncol.2011,28(1):211-218.），这提示抑癌基因PDCD4在白血病中也有重要作用。

近年RNA干扰技术迅速发展，不仅广泛用于肿瘤基因治疗，而且也是研究基因功能的有用工具。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种抑制PDCD4基因表达的siRNA。

本发明的另一目的在于提供上述抑制PDCD4基因表达的siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制PDCD4基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，

反义链：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'；

优选为，所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA序列（包括正义链和反义链）的3'端垂悬有dTdT，dTdT结构有利于保护RNA免受酶解；

所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA以GenBank基因库中PDCD4已知序列（Gene ID：27250，NM_145341，NM_014456）为基础，按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch^TM siRNA Design针对编码区的siRNA靶点位置设计。

上述的抑制PDCD4基因表达的siRNA在研究PDCD4基因功能中的应用，特别是用于进行PDCD4基因与白血病细胞对抗白血病化疗药物敏感性的相关性研究。

本发明具有如下的优点：

(1)本发明提供的抑制PDCD4基因表达的siRNA能有效沉默PDCD4基因，下调PDCD4基因的表达量，为研究PDCD4基因的功能提供了新的技术方案。

(2)通过研究白血病K562细胞中PDCD4对抗白血病化疗药物敏感性的影响，发现在白血病细胞中下调PDCD4的表达可以降低抗白血病化疗药物对白血病细胞的敏感性，减弱细胞毒性，从而恢复白血病细胞生长。这为进一步研究PDCD4在白血病中的功能及关系提供理论依据。

附图说明

图1是Real-time PCR检测K562细胞内PDCD4 mRNA的相对表达水平图，*P＜0.05。

图2是Western bloting检测K562细胞内PDCD4和β-actin蛋白的表达水平图。

图3是Western bloting检测K562细胞内PDCD4蛋白相对内参β-actin的相对表达水平图，*P＜0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

使用的材料：

白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞所；新生牛血清购自杭州四季青生物工程科技有限公司；1640培养基购自GIBCO公司；Lipofectamine^TM 2000购自Invitrogen公司；MTT及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Trizol试剂购自天根生物公司；Real-time PCR相关试剂购自Takara公司，引物由上海生工合成；细胞裂解液（RIPA）和Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，PVDF膜购自Millipore公司，β-actin一抗购自武汉博士德公司，PDCD4一抗购自Cell Signaling Technology公司，二抗分别购自北京博奥森公司和AsbioTechnology公司；三氧化二砷购自北京双鹭药业股份有限公司，小檗碱（Bererine,BB）购自Sigma公司，阿糖胞苷（Arabinosylcytosine,Ara-C）购自赛德萨公司。

统计学处理：

SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差表示，采用完全随机设计的单因素方差分析法（one-way ANOVA）分析各组数据间差异的显著性。以P＜0.05为有显著性差异。

金正均Q值法判断PDCD4 siRNA与药物联合使用后的效果Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea和Eb分别为单用PDCD4 siRNA和单用药物的抑制率，Ea+b为两者联合用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”，Q值为两者之比，Q<0.85为拮抗作用，0.85≤Q<1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用。

实施例1

（一）PDCD4 siRNA的设计与合成

根据GenBank基因库中PDCD4已知序列（Gene ID：27250，NM_145341，NM_014456），按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch^TM siRNA Design针对编码区不同的siRNA靶点位置设计了以下三条序列：

PDCD4 siRNA序列一：

正义链：5'-CACCAAUCAUACAGGAAUA-3'，

反义链：5'-UAUUCCUGUAUGAUUGGUG-3'；

PDCD4 siRNA序列二：

正义链：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，

反义链：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'；

PDCD4 siRNA序列三：

正义链：5'-GGUGGAAAGCGUAAAGAUA-3'，

反义链：5'-UAUCUUUACGCUUUCCACC-3'；

上述的各siRNA序列的3'端垂悬有dTdT；

随机对照采用siRNA通用对照（siRNA通用对照BLAST后与NCBI上所有已知的哺乳动物都有至少5个碱基的差异）；PDCD4 siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成，siRNA通用对照购自广州锐博生物技术有限公司（产品编号为：siN05815122147-1-2）。

（二）白血病K562细胞的培养

将白血病K562细胞接种于含体积分数10%的新生牛血清、无抗生素的1640培养基中，置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱，饱和湿度下培养，每2天换液传代，选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率>95%的细胞进行实验。

（三）Real-time PCR法筛选PDCD4 siRNA有效序列

（1）实验分PDCD4 siRNA序列一组、PDCD4 siRNA序列二组、PDCD4siRNA序列三和随机对照组（Negative Control，NC）；将设计合成的三个PDCD4siRNA序列及随机对照分别以100nmol/L的终浓度转染到K562细胞（转染方法参照Invitrogen公司Lipofectamine^TM 2000说明书）；

（2）转染后的K562细胞培养48h后，提取各组细胞总RNA（提取细胞总RNA的方法参照Trizol试剂说明书），提取的总RNA用微量核酸测定仪进行定量，测得A₂₆₀/A₂₈₀及其浓度；

（3）利用SYBR Green ⅠReal-time PCR以GAPDH为内参检测K562细胞内PDCD4mRNA的表达水平：将步骤2）提取的总RNA进行逆转录PCR和Real-timePCR，逆转录PCR条件：70℃持续5min，42℃持续60min；Real-time PCR条件：①94℃持续5min，②94℃持续30s，③PDCD4 60℃、GAPDH 57.5℃持续30s，④72℃持续30s，⑤读板，⑥步骤②～⑤循环39次，⑦融解曲线分析，从55℃到95℃，每1℃读一次板，停留2秒，PDCD4 mRNA的相对表达水平用△C_T和2^-△△CT计算；其中PCR引物由上海生工合成，PDCD4上游引物：5'-GTTGGCAGTATCCTTAGCAT-3'，下游引物：5'-CATCTCCTTCGCTTACAAA-3'；GAPDH上游引物：5'-CAACGGATTTGGTCGTATT-3'，下游引物：5'-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。

Real-time PCR检测结果如图1所示，其中PDCD4siRNA序列二（即本发明提供的抑制PDCD4基因表达的siRNA）组的PDCD4mRNA表达水平与随机对照组相比显著下降（P<0.05），而其余两个序列组与随机对照组的PDCD4 mRNA表达水平无明显变化，表明本发明提供的PDCD4 siRNA能有效抑制PDCD4mRNA的表达。

（四）Western bloting检测PDCD4 siRNA（抑制PDCD4基因表达的siRNA）对细胞内PDCD4蛋白表达水平的影响

（1）实验分为三组，空白对照组（Blank），随机对照组（Negative control,NC），PDCD4 siRNA组；将PDCD4 siRNA组和随机对照组分别以100nmol/L的终浓度按Lipofectamine^TM 2000说明书的方法转染到K562细胞；

（2）经过转染的K562细胞培养48h后收集细胞，按细胞裂解液（RIPA）说明书的方法提取细胞蛋白并用Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据定量结果对各蛋白质样本进行校正，加入loading buffer，置沸水中煮10min；

（3）将步骤（2）处理过的蛋白质样本进行不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶），电压80V，待样本进入分离胶后电压改为120V，电泳50min；

（4）将凝胶上的蛋白条带转到PVDF膜上，电压10V半干转膜25min；TBST洗膜5min；用质量百分比5%的脱脂奶粉封闭缓冲液将膜室温封闭1h；TBST洗膜3次，每次5min；4℃过夜孵育一抗；TBST洗膜3次，每次5min；室温孵育二抗1h；TBST洗膜3次，每次5min；ECL化学发光，成像系统拍照；Image J图像分析软件分析PDCD4和β-actin的灰度，以β-actin作为内参照计算PDCD4蛋白的相对表达水平；其中，10×TBS缓冲液：1mol/L Tris·HCl（pH7.5）10mL、NaCl 8.8g加蒸馏水至1000mL，TBST缓冲液：20％Tween201.65mL、TBS 700mL，混匀后即可使用，最好现用现配。

转染终浓度为100nmol/L的PDCD4 siRNA于K562细胞48h后，结果如图2和图3所示PDCD4的蛋白表达明显下调。其中转染PDCD4 siRNA组，PDCD4蛋白的表达水平相对于随机对照组显著下降（P<0.05）；而转染随机对照组的PDCD4蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显变化，表明本发明提供的PDCD4 siRNA能有效抑制PDCD4蛋白的表达。

（五）抑制PDCD4基因表达的siRNA（PDCD4 siRNA）对药物敏感性的影响

（1）实验分空白对照组、随机对照组、PDCD4 siRNA组、药物组、随机对照+药物组和PDCD4 siRNA+药物组，PDCD4 siRNA和随机对照的转染终浓度为100nmol/L；

其中，所述的药物分别为三氧化二砷（ATO）、阿糖胞苷（Ara-c）或小檗碱（BB）；

（2）取对数生长期K562细胞，各组细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板，每孔50μL，按Lipofectamine^TM 2000说明书的方法转染PDCD4 siRNA或随机对照，空白对照组和药物组用无血清Opti-MEM培养基替代siRNA，转染终体积100μL（含细胞液50μL）；

（3）转染6h后，加入100μL含体积百分比20%的新生牛血清以及相应浓度的药物（药物浓度分别为2μM ATO、2μM Ara-c和120μM BB）的1640培养基（药物组、随机对照+药物组和PDCD4 siRNA+药物组加入100μL含药物和体积百分比20%的新生牛血清的1640培养基，其余组加入100μL含体积百分比20%的新生牛血清的1640培养基），终体积200μL，继续培养72h后每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，于培养箱中培养4h后，37℃、1000rpm/min离心10min，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO）；

（4）震荡使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A_570nm，以A_630nm作为参照，可间接反映细胞存活率；实验重复三次，计算增殖抑制率，增殖抑制率=[1-（A_实验组/A_对照组）]×100%。

PDCD4 siRNA对As₂O₃(ATO)作用K562细胞敏感性的影响如表1所示：

表1：各组K562细胞增殖抑制率的比较

As₂O₃(ATO)对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4基因的表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入As₂O₃，72h后检测细胞的增殖抑制率，siRNA可明显减弱As₂O₃对细胞药物毒性，恢复K562细胞的生长。其中（ATO+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（ATO+NC）组下降了8.56%，两者联用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；（ATO+NC）组的细胞增殖抑制率相对于单独ATO组无明显变化（P>0.05），其两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤1.15）。

PDCD4 siRNA对Ara-c作用K562细胞敏感性的影响如表2所示：

表2：各组K562细胞增殖抑制率的比较

Ara-c对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4基因的表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入Ara-c，72h后检测细胞的增殖抑制率，siRNA可明显减弱Ara-c对细胞药物毒性，恢复K562细胞的生长。其中（Ara-c+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（Ara-c+NC）组下降了11.42%，两者联用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；（Ara-c+NC）组的细胞增殖抑制率相对于单独Ara-c组无明显变化（P>0.05），两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤1.15）。

PDCD4 siRNA对BB作用K562细胞敏感性的影响如表3所示：

表3：各组K562细胞增殖抑制率的比较

BB对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4基因的表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入BB，72h后检测细胞的增殖抑制率，siRNA可明显减弱BB对细胞药物毒性，恢复K562细胞的生长。其中（BB+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（BB+NC）组下降了10.2%，两者联用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；而（BB+NC）组的细胞增殖抑制率相对于单独BB组无明显变化（P>0.05），两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤1.15）。

以上数据表明下调PDCD4的表达可以降低抗白血病化疗药物三氧化二砷、阿糖胞苷或小檗碱对K562细胞的敏感性，减弱细胞毒性，从而恢复K562细胞生长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抑制PDCD4基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，

反义链：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'。

2.根据权利要求1所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA，其特征在于：所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA序列的3'端垂悬有dTdT。