CN105920583B - 183aa小分子多肽的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了183aa小分子多肽在制备抗癌药物中的应用。本发明利用生物工程技术，基因重组一段183个氨基酸多肽对应的DNA序列到p3×FLAG‑CMV‑14真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此重组多肽转染到多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞中，免疫印迹检测多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗多发性骨髓瘤功能进行了研究，细胞学实验表明此多肽具有促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的重要抗癌功能。为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及183aa小分子多肽的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤是一种不能治愈的恶性浆细胞疾病，发病率占肿瘤的1-2％，占血液肿瘤的10-15％。至今，多发性骨髓瘤仍是第二大恶性血液肿瘤。尽管，改善了传统的治疗方法，多发性骨髓瘤仍然是无法治愈的，5年的生存率只有31％。目前，化学疗法是治疗多发性骨髓瘤最有效的疗法之一。然而，尽管使用了新颖的化疗药物、改善了治疗手段，药物耐受性仍然是治疗多发性骨髓瘤存在的主要问题。
多肽药物是目前生物医药领域最具成长性的崭新领域，以其高效、安全、特异性强等特点逐渐用于癌症，传染病等预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物——蛋白质来实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功能的蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。在全球范围内，据初步统计，现有的大约65个肽类药物，市场规模约为200亿美元，并且每年以15～20％的速度递增。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种183aa小分子多肽的应用，具有抗骨髓瘤的应用价值。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
183aa小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的183aa小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述的183aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
含有所述的183aa小分子多肽的编码基因的DNA序列的载体。
所述的载体，将183aa小分子多肽的DNA序列连接进p3×FLAG-CMV-14真核表达载体，构建出重组表达质粒。
有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段183个氨基酸多肽对应的DNA序列到p3×FLAG-CMV-14真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此重组多肽转染到多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞中，免疫印迹检测多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗多发性骨髓瘤功能进行了研究，细胞学实验表明此多肽具有促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的重要抗癌功能。为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
附图说明
图1是p3×FLAG-CMV-14载体图；
图2是183aa多肽的PCR、酶切鉴定结果，免疫印迹检测结果图；
图3是CCK-8实验检测结果图；
图4是PI染色流式细胞术检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1 183aa多肽重组
1)重组肽的克隆载体构建：提取人的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，上游引物为5’-GGGGTACCATGCACCTGCTCCCTCTCTGG-3’(含KPN I酶切位点)；下游引物为5’-CGGGATCCTACTGTGTTCATCATACTGTC GAA-3’(含Bamh I酶切位点)。
应用PCR技术成功扩增出183aa对应的552bp的mRNA序列，如SEQ ID NO.2所示，表达的183aa小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。扩增得到的片段与p3×FLAG-CMV-14载体连接(图1)，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以KPN I、Bamh I酶切鉴定。
以上操作主要过程如下：
STAT1质粒购自吉凯公司，以STAT1cDNA为模板，分别取上下游引物各5μL，加入1μLpfuDNA聚合酶，10×bnuffer 5μL，10×dNTP5μL，加双蒸水总体积为50μL进行PCR反应，起始变性94℃5min，然后执行如下反应条件：94℃30s，65℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸10min。
取PCR产物10μL，进行1.2％普通琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约552bp的片段。取余下PCR产物40μL，进行1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化552bp的cDNA片段。
将STAT1质粒和Flag质粒分别用KPN I和Bamh I双酶切，前者回收552bp的cDNA片段，后者回收线性化的Flag片段，然后行1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，将552bp的cDNA片段和线性化的Flag片段分别切下混在一起进行纯化。纯化后cDNA片段和Flag片段混合物用4μL双蒸水溶解，加入T4DNA连接缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，总反应体积为10μL，室温连接4h。将10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，并铺在含氨苄青霉素(100μg/mL)的琼脂培养基上生长12h，挑选单个菌落接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)TB培养基中培养12h，少量提取质粒，通过KPN I和Bamh I双酶切鉴定。然后行大量提取、纯化，用40μL消毒三蒸水溶解沉淀，命名为“pCMV-Flag-STA T1”，-20℃保存以备用。
从40μL pCMV-Flag-STAT1中取10μL，由上海铂尚测序公司进行测序，获得最终序列。
2)重组肽的真核表达载体构建及其表达鉴定
将含有183aa多肽核酸片段的p3×FLAG-CMV-14质粒经KPN I酶切后，利用回收试剂盒获得该片段，同时用相同的酶处理质粒pcDNA3.1，然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体p3×FLAG-CMV-14在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体。将正确连接的183aa多肽真核表达载体转染RP MI8226细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹结果证明了多肽的表达，如图2所示，从左到右依次为183aa多肽的PCR、酶切鉴定结果，免疫印迹检测结果。
以上操作主要过程如下：
转染前一天，将0.5-1.5×10RPMI 8226细胞用1640培养基传代至6cm培养皿中，使得第二天转染时融合度在80-90％左右；将2-4μg的质粒加入200μL的无血清培养基中，混匀；将Lipofectamine 2000取出，轻柔摇匀，再将质粒量1-3倍量的Lipofectamine 2000用另一200μL的无血清培养基稀释，吹打混匀，静置5min；将质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温静置20min；将混合物加入培养皿中，轻柔地摇匀，静置，36-48h后收集细胞；RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹检测多肽的表达。
实施例2 重组肽抗多发性骨髓瘤功能的检测
1)CCK-8实验证明重组肽细胞水平的抗多发性骨髓瘤细胞增殖效应
CCK-8细胞增殖实验：在RPMI 8226细胞中，转染野生型，183aa片段截短的STAT1载体48h后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)，37℃孵育2h，到达时间点后换液，向每孔加入100μL含10μL CCK-8溶液的细胞培养基(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。(不同时间点要保持相同的时间)用酶标仪测定(测定波长490，参照波长630)处的吸光度。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图3所示，转染183aa的多肽片段STAT1Δ的细胞增殖速度低于与对照组。
2)PI染色流式细胞术实验证明重组肽细胞水平的抗多发性骨髓瘤细胞增殖效应
PI染色流式细胞分析术检测细胞周期：在RPMI8226细胞中，转染野生型、183aa片段截短的STAT1载体48h后收集到5mL EP管中离心后弃掉培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤3次，离心，弃掉PBS，用70％乙醇重悬，置于-20℃固定至少24h。检测前，1200rpm离心5min，弃乙醇，用PBS洗涤3次，并用含1％triton X-100的PBS 4℃通透10min，每管200μL。加入RNase A，与triton X-100的PBS比例为1:1000，避光4℃反应20min，每管300-400μL。加入200μL PI染色剂，避光4℃染色20min，每管200μL，过滤(400目筛子)。置于冰盒内，流式细胞仪检测。如图4示，对照组细胞停滞在G1期的为66.62％，而转染183aa的多肽片段STAT1Δ的细胞停滞在G1期的为67.39％，并且进入S期的细胞由23.84％逐渐减低到23.22％。与对照组相比，转染183aa的多肽片段STAT1Δ后能够将细胞周期阻滞在G0/G1期，有明显的细胞周期抑制作用。
Claims (4)
1. 183aa小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的183aa小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的肿瘤为多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞。
2.编码权利要求1所述的183aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述的183aa小分子多肽的编码基因的DNA序列的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：将183aa小分子多肽的DNA序列连接进p3×FLAG-CMV-14真核表达载体，构建出重组表达质粒。
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