CN102676638B

CN102676638B - 检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒

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Publication number: CN102676638B
Application number: CN201110054421.9A
Authority: CN
Inventors: 沈宏杰; 何军; 邱桥成; 岑建农
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2031-03-08
Also published as: CN102676638A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1或如SEQ ID No.2所示，下游引物核苷酸如SEQID No.3所示。本发明还公开一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒。本发明经一步法PCR扩增CML患者的BCR/ABL融合基因，再用特异性测序引物进行测序，在一个反应体系中可以检测二十多种常见的BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变，降低了实验的成本，极大的提高了基因测序结果的准确性和灵敏度，有着大规模推广应用的前景。

Description

检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病(Chronic Myelognous Leukemia，CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病，在我国的发病率为36/10万人，其中90％以上病例均具有BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因是由人体细胞第9号染色体上的ABL原癌基因与第22号染色体上的BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起蛋白激酶持续性激活，使白细胞过分增殖而出现慢性粒细胞白血病。

人ABL基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2～11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，形成两种转录本，每种转录本由11个外显子组成，合成的两种蛋白质分子量均约为145kD，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。ABL蛋白参与细胞周期调节。人BCR基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。BCR蛋白的1～63个氨基酸参与BCR蛋白多聚体的形成。

BCR/ABL融合基因见于95％以上CML患者，也见于20％～25％成人ALL和2％～4％儿童ALL患者。约6％成人急性髓细胞性白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)、1％儿童AML和10％急性混合细胞型白血病(acute mixed lineage leukemia，AMLL)患者中也可检测到BCR/ABL融合基因。

不同的BCR/ABL融合基因类型与疾病表型相关。BCR/ABL融合基因中，主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。

BCR基因常见的断裂点有三个，如图1所示：

(1)M-BCR区，位于外显子b1～b5之间5.8kb的区域，转录成b2a2或b3a2型mRNA，编码210kD的BCR/ABL融合蛋白(p210)，见于90％以上的CML和33％的Ph+成人ALL患者。

(2)m-BCR区，位于外显子e2′和e2之间的54.4kb的区域，转录成e1a2型mRNA，编码190kD的融合蛋白(p190)，见于2/3的Ph+成人B-ALL、3％的非典型CML和慢性粒细胞-单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)患者。

(3)μ-BCR区，位于外显子19下游，转录成e19a2型mRNA，编码p230kD的融合蛋白，主要见于Ph+的慢性中性粒细胞白血病(chromic neutrophilic leukemia，CNL)。

慢性粒细胞白血病的BCR基因断裂点常位于M-BCR，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。因断裂点不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。目前世界上已报道的常见27个位点33种常见BCR/ABL融合基因耐药突变如M244V、L248V、G250E、Q252H/R、Y253F/H、E255K/V、D276G、T277A、E279K、F311L、T315I、F317L、L324Q、M343T、A344V、A350V、M351T、E355G、F359C/V、V379I、F382L、L387M/F、M388L、H396R、A397P、E450G/K、E459K，具有这些突变的慢性粒细胞白血病患者预后差，生存率低，其中，激酶区P-Loop片段中L248V，G250E，Q252H/R，Y253F/H，E255K/V突变预后较其它突变预后差，T315I预后最差。

ABL基因N端具有酪氨酸激酶活性。ABL激酶区位于AA第235～509(M14752：1067bp～1891bp)区，由P环结构(P-loop)，激酶催化区(kinase domain)及A环结构(A-loop)三部分组成。因此，当染色体发生t(9，22)易位，即BCR与ABL形成融合基因时，能够导致患者骨髓细胞内多种蛋白酪氨酸激酶水平紊乱，进而导致疾病的发生。

靶向治疗药物格列卫(imatinib)为BCR/ABL融合基因阳性CML患者带来了福音，但是临床治疗后发现，约50％的CML患者由于其BCR/ABL融合基因ABL激酶区存在多种类型突变而造成对格列卫耐药，甚至部分CML患者还存在对格列卫的原发耐药。2010年美国国立综合癌症网络(NCCN)指出，BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变对CML患者治疗效果及病情进展具有重要的提示作用。

检测BCR/ABL融合基因的分子生物学方法前期主要进行定性检测，目前荧光定量PCR(RQ-PCR)方法被更多地应用，RQ-PCR进一步提供了定量监测肿瘤细胞水平的准确方法，BCR/ABL融合基因的水平与临床疗效有很好的相关性，并能预先对临床病情变化提出警示，对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义。由于ABL激酶区突变存在跨越片段长，突变种类多达二十几种且还存在未知突变类型，目前对于检测BCR/ABL基因耐药突变，只有针对某一个已知突变位点用传统的RQ-PCR方法进行检测，远远无法满足临床医生对患者的全面认识而做出正确的诊断并实施个体化的治疗方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种能检测多种BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一组用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1或如SEQ ID No.2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.3所示。其中BCR/ABL融合基因P190形的扩增引物为：P190F、ABLR

P190F(BCR1号外显子)：如SEQ ID No.1所示：

5′-TCCCTCGCAGAACTCGCAAC-3′(NM_004327：1703～1722)

ABLR(AB L11号外显子)：如SEQ ID No.3所示：

5′-CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3′(M14752：2065～2085)

BCR/ABL扩增引物P210型的扩增引物：P210F、ABLR

P210F(BCR11号外显子)：如SEQ ID No.2所示：

5′-GCTGTCGGAGCAGGAGTCAC-3′(NM_004327：3047～3066)

ABLR(ABL11号外显子)：如SEQ ID No.3所示

5′-CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3′(M14752：2065～2085)

作为优选，本发明所述用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的两组扩增引物同时使用，上游引物核苷酸序列如SEQID No.1和如SEQ ID No.2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.3所示。

本发明主要针对常见的M-bcr和m-bcr融合基因耐药突变检测，其中M-bcr断裂位点主要集中在BCR第12～16号外显子，分别命名为b1～b5，表达P210融合蛋白；m-bcr断裂位点主要集中在BCR第1号内含子内。目前，国际上大多数M-bcr引物都是设计在第13号外显子或14号外显子上，虽然能扩增大多数的b2，b3型，但是并不能将所有的P210都扩增出来。本发明将上游引物设计在BCR第11号外显子，位于12号外显子前端，在保证扩增效率及特异性上，能够覆盖所有的M-bcr，即第12到第16号外显子(b1～b5)发生融合都能扩增出来，增加检测范围。

本发明还提供用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的一组测序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.5所示。上游测序引物ABL1E4F(4号外显子)：5′-CCGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3′(M14752：951～973)

下游测序引物ABL1E8R(8号外显子)：

5′-GCAATACTCCAAATGCCCAGACG-3′(M14752：1627～1649)

本发明还提供用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的另一组测序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.7所示。

上游测序引物ABL1E8F(8号外显子)：

5′-CTGGGCATTTGGAGTATTGCTTTG-3′(M14752：1630～1653)

下游测序引物ABL1E10R(10号外显子)：

5′-TGGAGTGAGGCATCTCAGGCAC-3′(M14752：2003～2024)

作为优选，本发明用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的测序引物两组同时使用，且BCR/ABL融合基因P190和P210应用相同的测序引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法：

步骤1：取DNA样品进行PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQID No.1或/和如SEQ ID No.2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.3所示；

步骤2：取PCR扩增产物分别用两组测序引物进行测序分析，第一测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.5所示；第二测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.7所示。

本发明的另一个目的是提供检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的试剂盒，包含：

扩增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1或如SEQ IDNo.2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.3所示；

第一测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.5所示；

第二测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No.7所示。

作为优选，本发明所述试剂盒还包含HotStarTaq DNA多聚酶。

作为优选，本发明所述试剂盒还包含BigdyeV3.1。

更优选地，本发明所述试剂盒还包含扩增缓冲液和dNTPs。

BCR/ABL融合基因有P210(b2a2，b3a2)，P190(e1a2)亚型，本发明将下游引物设计在ABL1第11号外显子，保证对BCR/ABL融合基因P210型和P190型的扩增效率，再针对其中ABL激酶区设计测序引物，从而达到特异性检测BCR/ABL融合基因中ABL激酶区核苷酸序列的目的。

本发明采用一步法PCR反应扩增CML患者的BCR/ABL融合基因，用特异性的测序引物检测扩增产物中ABL激酶区所有常见突变位点，在一个反应体系中可以检测二十多种常见的BCR/ABL耐药突变，降低了实验的成本，极大的提高了基因测序结果的准确性和灵敏度，有着大规模推广应用的前景。

附图说明

图1为BCR/ABL融合基因BCR断裂位点结构说明图；

图2为本发明所述BCR/ABL扩增引物与BCR/ABL融合基因P190型的示意图；

图3为本发明所述BCR/ABL扩增引物与BCR/ABL融合基因210型的示意图；

图4为本发明所述BCR/ABL测序引物与BCR/ABL融合基因(P190型、210型)的示意图；

图5为本发明所述引物扩增产物的凝胶电泳图；

图6为ABL1E4F(4号外显子)第1061～1560bp正向测序图：

图7为ABL1E8F(8号外显子)第1701～1900bp正向测序图：

图8为本发明所述方法检测到ABL激酶区第1061～1560bpG1499A(V379I)突变的正向测序图；

图9为本发明所述方法检测到ABL激酶区第1061～1560bpC1308T(T315I)突变的正向测序图；

图10为已报道引物PCR扩增产物的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明公开了一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：本发明所述试剂盒组成：

PCR扩增反应体系、高保真热启动酶HotStarTaq DNA多聚酶、消化酶、测序反应体系，分别详述如下：

基因序列参照美国国家生物技术信息中心NCBI专业网站数据库，BCR基因登陆号为：NM_004327，ABL基因登陆号为：M14752。以下引物方向均从5’到3’；

BCR/ABL扩增引物(P190、P210型)：

P190F扩增引物：P190F、ABLR

P210扩增引物：P210F、ABLR

P190F(BCR1号外显子)：如SEQ ID No.1所示

5′-TCCCTCGCAGAACTCGCAAC-3′(NM_004327：1703～1722)

P210F(BCR11号外显子)：如SEQ ID No.2所示

5′-GCTGTCGGAGCAGGAGTCAC-3′(NM_004327：3047～3066)

ABLR(ABL11号外显子)：如SEQ ID No.3所示

5′-CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3′(M14752：2065～2085)

本发明所述BCR/ABL扩增引物与BCR/ABL融合基因P190型的示意图见图2，与BCR/ABL融合基因P210型的示意图如图3所示，数字代表外显子序列号。

优化的PCR扩增反应体系(PCR Amplification Mixture)

最佳的PCR扩增反应条件：

第一步：95℃ 15min

第二步：94℃ 0.5min

56℃ 0.5min

72℃ 2.5min

40cycles

第三步：72℃ 7min

第四步：4℃保存

测序反应体系

ABL激酶区测序引物(P190和P210应用相同的测序引物)：

上游测序引物ABL1E4F(4号外显子)：如SEQ ID No.4所示

5′-CCGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3′(M14752：951～973)

下游测序引物ABL1E8R(8号外显子)：如SEQ ID No.5所示

5′-GCAATACTCCAAATGCCCAGACG-3′(M14752：1627～1649)

上游测序引物ABL1E8F(8号外显子)：如SEQ ID No.6所示

5′-CTGGGCATTTGGAGTATTGCTTTG-3′(M14752：1630～1653)

下游测序引物ABL1E10R(10号外显子)：如SEQ ID No.7所示

5′-TGGAGTGAGGCATCTCAGGCAC-3′(M14752：2003～2024)

优化的测序反应体系(Sequencing Mixture)

测序反应条件

实施例2：用本发明所述方法进行BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点检测

取纯化的CML患者患者细胞抽取RNA后经逆转录酶逆转至cDNA，用本发明所述扩增引物进行常规PCR扩增；如已知为BCR/ABL融合基因P190型，则用P190F扩增引物：P190F、ABLR进行扩增；已知为BCR/ABL融合基因P210型，则用P210扩增引物：P210F、ABLR进行扩增；如患者融合基因类型未知，则用两套引物P190F扩增引物、P210扩增引物进行扩增。

优化的PCR扩增反应体系(PCR Amplification Mixture)

最佳的PCR扩增反应条件：

第一步：95℃ 15min

第二步：94℃ 0.5min

56℃ 0.5min

72℃ 2.5min

40cycles

第三步：72℃ 7min

第四步：4℃ 保存

P210、P190PCR产物电泳图见图5所示，因每例患者BCR/ABL融合基因融合位点不同，PCR产物片段大小为1815bp(P190型)和1899bp(P210中b3a2型)，PCR产物会根据基因断裂融合位点不同而略有上下浮动。

BCR/ABL融合基因ABL基因激酶区(参考基因登陆号M14752)，正常测序图如图6-图7所示，图中黑色下划线代表一个AA密码子，黑色箭头代表可能的突变碱基位点，数字1～27代表可以检测的27种常见耐药突变：1-M244V 2-L248V 3-G250E 4-Q252H/R5-Y253F/H 6-E255K/V 7-D276G 8-T277A 9-E279K10-F311L 11-T315I 12-F317L 13-L324Q 14-M343T15-A344V 16-A350V 17-M351T 18-E355G 19-F359C/V20-V379I 21-F382L 22-L387M/F 23-M388L 24-H396R25-A397P 26-E450G/K 27-E459K

取PCR扩增产物进行测序，检测到ABL激酶区第1061～1560bpG1499A(V379I)突变，其正向测序图见图8所示，反向测序图略。

实施例3：用本发明所述方法进行BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点检测

参照实施例2所述方法，取PCR扩增产物进行测序，检测到ABL激酶区第1061～1560bpC1308T(T315I)突变，其正向测序图见图9所示，反向测序图略。

实施例4：本发明所述扩增引物与已报道引物比较实验：

P190F：5’-FCGCAAGACCGGGCAGAT-3’(NM_004327：1818～1834)

P210F：5’-GCATTCCGCTGACCATCAA-3’(NM_004327：3277～3295)

ABLR：5’-GCCATAGGTAGCAATTTCCC-3’(M14752：1653～1672)

参照实施例2所述方法，用已报道的上述引物进行扩增实施例2相同的DNA样品，其扩增产物电泳结果图如图10所示。因每例患者BCR/ABL融合基因融合位点不同，PCR产物片段大小约1287bp(P190型)和1256bp(P210中b3a2型)，PCR产物会根据基因断裂融合位点不同而略有上下浮动。

取上述PCR产物用本发明所述测序引物进行测序，未检测到ABL激酶区突变。

实施例5：用本发明所述方法进行BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点检测

参照实施例2所述方法，用本发明所述引物扩增DNA样品，取PCR扩增产物进行测序，检测到ABL激酶区Y253H、Q252H、F317I突变，其测序图略。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，包含：

扩增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1和如SEQ IDNo.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

第一测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

第二测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含HotStarTaqDNA多聚酶。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含BigdyeV3.1。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含扩增缓冲液和dNTPs。