CN105510263B - 一种3-氨基哌啶异构体的hplc分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3‑氨基哌啶异构体的HPLC分析方法。该方法以(R)‑α‑甲基‑2‑萘乙酰氯为衍生化试剂与3‑氨基哌啶进行快速双衍生化反应，通过反相高效液相色谱与紫外检测器联用对3‑氨基哌啶异构体进行测定，属于药物分析技术领域。该方法衍生反应条件温和、快速，检测灵敏度高、重复性好、易于标准化操作，可用于有效地检测3‑氨基哌啶异构体，适用于工业化生产3‑氨基哌啶过程中对3‑氨基哌啶异构体的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法。
背景技术
(R)-3-氨基哌啶是Ⅱ型糖尿病新药利拉利汀、阿格列汀的重要中间体。利拉利汀、阿格列汀分子结构中只有一个手性中心，由中间体(R)-3-氨基哌啶引入，因此(R)-3-氨基哌啶的光学纯度直接决定了利拉利汀、阿格列汀的光学纯度和药效。
相比示差折光检测器，紫外检测器具有更高的灵敏度和稳定性。但由于3-氨基哌啶及其手性异构体紫外吸收很弱，使用常规的紫外检测存在末端吸收干扰等问题，通常采用衍生化方法使之紫外吸收增强从而提高检测灵敏度，再通过手性色谱进行分析检测。
Meek等采用CrownpakTM CR+(150×4.6mm)手性柱，示差折光检测器直接对3-氨基哌啶进行检测，Sakarai等采用二对甲基苯甲酰L-酒石酸为衍生化试剂对3-氨基哌啶进行衍生化，采用GL Science Inertsil ODS-2(150×4.6mm)手性柱，254nm下对衍生物进行分析。Watanabe等人采用氯甲酸丙酯为衍生化试剂对3-氨基哌啶进行衍生，采用CHIRALCELAS-RH (150×4.6mm) 手性柱在254nm下对衍生物进行分析。孙凤霞等(CN104007202ACN104034814A)采用苯甲酰氯为衍生化试剂对3-氨基哌啶分别进行单衍生化和双衍生化，使用CHIRAL-AGP(150×4.6mm)手性柱，在254nm下对衍生物进行分析。示差折光检测器灵敏度低，进样量大，误差较大。而以紫外进行的检测，既衍生化又采用价格昂贵的手性柱。
3-氨基哌啶分子结构中有两个氮原子，由于氮原子的孤对电子能量较低，所以3-氨基哌啶在紫外区几乎无吸收，建立快捷的、准确可靠的光学纯度分析方法难度非常的大。通过与带紫外吸收的手性试剂进行快速双衍生化，得到既有紫外吸收又形成三个手性基团的衍生物，能够直接在反相高效液相与紫外联用上进行异构体的分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，可以快捷准确的实现定性、定量和对映体过量率分析。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，具体包含如下步骤：
步骤一、衍生化
将3-氨基哌啶溶于有机溶剂中，在一定的温度条件下，以(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯为衍生化试剂，控制3-氨基哌啶和(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯的摩尔比，进行双衍生化反应，得到衍生化后的3-氨基哌啶，反应式见式I；
式I
步骤二、分离检测
采用反相高效液相色谱-紫外检测器对衍生化后的3-氨基哌啶进行定性、定量和对映体过量率测定。
所述的有机溶剂选自甲苯、二甲苯、石油醚、四氢呋喃、庚烷和己烷中的一种或两种以上的组合。
所述的有机溶剂与3-氨基哌啶的体积比为0.1~300:1，优选的为1~20:1。
所述的一定温度是指从0℃到回流温度，优选为15~35℃。
本发明的回流温度具体数值与有机溶剂的选择有关，本领域技术人员可以根据溶剂的选择清楚的确定回流温度的范围。
所述的3-氨基哌啶和(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯的摩尔比为1:2~20。
所述的紫外检测器的检测波长为210~300nm，优选220～260nm。
所述的反相高效液相色谱的色谱柱固定相为烷基键合硅胶，优选的色谱柱固定相为十八烷基硅烷键和硅胶，最优的为迪马反相十八烷基硅烷键和硅胶柱（250×4.6mm，5um，pH范围2.0～8.0）。
所述的反相高效液相色谱的流动相由有机溶剂和酸的水溶液组成，有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮和乙腈中的一种或两种；有机溶剂占流动相的体积比例范围为30%～90%，优选范围为40%～80%。
所述的酸的水溶液中的酸选自无机酸或有机酸，包括盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸钠、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氯丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸和十五氟辛酸中的一种或两种及以上的混合物。
所述酸的水溶液中的酸的摩尔浓度为0.01mmol/L～10mmol/L，优选摩尔浓度为0.1mmol/L～1mmol/L 。
所述酸水溶液的pH值为2.0～7.0，优选pH值为3.0～5.0。
所述的流动相流速在0.2～3.0mL/min，优选流速为1.0mL/min。
本发明中，反相高效液相色谱分析条件优选为：
迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
本发明提供一种衍生化方法，利用反相高效液相色谱与紫外联用对衍生化3-氨基哌啶进行异构体分析，并建立了对(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯和3-氨基哌啶衍生物的对映异构体测定的高效液相色谱分析方法。通过对(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯和3-氨基哌啶衍生物异构体分析，从而实现对3-氨基哌啶的异构体分析。
附图说明
图1：(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生化后色谱图；
图2：(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生化后色谱图；
在附图中：1为(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶的衍生物；2为((R)-α-甲基-2-萘乙酰氯-和(S)-3-氨基哌啶的衍生物。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
实施例1：(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与3-氨基哌啶衍生物的液相色谱分析
1-1：(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物的液相色谱分析
取(R)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于30mL甲苯中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯19.67g(0.09mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性纯度分析见表1，其图谱见图1。
1-2：(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶的衍生物的液相色谱分析
取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于30mL甲苯中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯19.67g(0.09mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性纯度分析见表1，其图谱见图2。
表1 (R)-α-甲基-2-萘乙酰氯衍生化后的3-氨基哌啶保留时间和手性e.e. %值
实施例2：3-氨基哌啶和(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯的衍生化反应条件的考察试验
2-1：称取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于40mL二甲苯中，在30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯19.67g(0.09mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL， 保留时间和手性e.e.%值同实施例1-2。
：取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于40mL四氢呋喃中，在60℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯19.67g(0.09mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL,保留时间和手性e.e.%值同实施例1-2。
：取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于30mL石油醚中，60℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯15.30g(0.07mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性e.e.%值同实施例1-2。
：取(R)-3-氨基哌啶3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于900mL（石油醚:四氢呋喃1:1）中，在20℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯131.16g(0.6mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL.，保留时间和手性e.e.%值同实施例1-1。
：取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于80mL（庚烷:己烷体积比1:2）中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯13.12g(0.06mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性e.e.%值同实施例1-2。
：取(R)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于50mL庚烷中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯13.12g(0.06mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(R)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性e.e.%值同实施例1-1。
：取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于80mL（庚烷:己烷1:2）中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯21.86g(0.1mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%乙腈-20%（0.1mmol/L盐酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，保留时间和手性e.e.%值同实施例1-2。
实施例3：色谱条件考察试验
（1）衍生化
取(RS)-3-氨基哌啶3.09g(0.03mol)，溶于30mL甲苯中，30℃下搅拌，缓慢加入(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯19.67g(0.09mol)。TLC监测反应，反应结束后蒸干得(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物。
（2）对(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物采用以下不同色谱条件进行分离检测
A．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为60%甲醇-40%（0.1mmol/L甲磺酸）水溶液，pH值为2.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
B．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为40%乙醇-60%（0.01mmol/L乙酸）水溶液，pH值为3.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
C．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为80%异丙醇-20%（0.01mmol/L苯磺酸）水溶液，pH值为4.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
D．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为60%丙酮-40%（0.5mmol/L三氟乙酸）水溶液，pH值为6.0。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
E．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为40%正丙醇-60%（0.5mmol/L五氟丙酸）水溶液，pH值为3.5。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
F．将(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯与(RS)-3-氨基哌啶衍生物用流动相溶解后采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：迪马C18色谱柱，流动相为60%乙腈-40%（0.1mmol/L磷酸）水溶液，pH值为4.5。紫外检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样体积10μL，手性e.e.%值同实施例1-2。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (10)
1.一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，具体包含如下步骤：
步骤一、衍生化
将3-氨基哌啶溶于有机溶剂中，在一定温度条件下，以(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯为衍生化试剂，控制3-氨基哌啶和(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯的摩尔比，进行双衍生化反应，得到衍生化后的3-氨基哌啶，反应式见式I；
式I
步骤二、分离检测
采用反相高效液相色谱-紫外检测器对衍生化后的3-氨基哌啶进行定性、定量和对映体过量率测定；
所述反相高效液相色谱的反相色谱柱固定相为烷基键合硅胶；
所述的反相高效液相色谱的流动相由酸的水溶液和有机溶剂组成，有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮和乙腈中的一种或两种以上；有机溶剂占流动相的体积比例范围为30%～90%；
所述的酸的水溶液中的酸选自无机酸或有机酸，包括盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸钠、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氯丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸和十五氟辛酸中的一种或两种及以上的混合物，所述酸的水溶液的pH值为2.0～7.0；
所述的一定温度是指从0℃到回流温度；
所述的3-氨基哌啶和(R)-α-甲基-2-萘乙酰氯的摩尔比为1:2~20。
2.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述步骤一的有机溶剂选自甲苯、二甲苯、石油醚、四氢呋喃、庚烷和己烷中的一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述步骤一的有机溶剂与3-氨基哌啶的体积比为0.1~300:1。
4.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述步骤一的有机溶剂与3-氨基哌啶的体积比为1~20:1。
5.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述的一定温度是指15~35℃。
6.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述的紫外检测器的检测波长为210~300nm。
7.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述的紫外检测器的检测波长为220-260nm。
8.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述的反相色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。
9.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述有机溶剂占流动相的体积比例范围为40%～80%。
10.根据权利要求1所述的一种3-氨基哌啶异构体的HPLC分析方法，其特征在于，所述酸的水溶液的pH值为3.0～5.0。
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