CN116660417A - 原料药中r-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用 - Google Patents

原料药中r-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及原料药物残留测定技术领域，具体涉及原料药中R‑3‑氨基哌啶双盐酸盐的衍生试剂和检测方法。本发明采用柱前衍生对R‑3氨基哌啶双盐酸盐进行前处理，在其结构上引入具有紫外吸收的基团，采用高效液相色谱仪在线衍生程序衍生后进行检测，解决了R‑3氨基哌啶双盐酸盐在常规高效液相色谱仪‑紫外检测器上无响应的问题，且柱前衍生采用自动进样程序，操作简便，自动化程度高、方法重现性好、检测灵敏度高。

Description

原料药中R-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用
技术领域
本发明涉及原料药物残留测定技术领域，具体涉及原料药中R-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用。
背景技术
琥珀酸曲格列汀是一种超长效二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂。每周口服一次的用药优势无疑将为糖尿病患者提供了更为方便的治疗选择，有望大幅改善患者的便利性和依从性。
R-3-氨基哌啶双盐酸盐为琥珀酸曲格列汀原料药(API)的起始物料，根据合成路线(如图1所示)，R-3-氨基哌啶双盐酸盐(SM3)为第三步引入，为控制API的质量，需要对其残留进行测定。
目前，氨基哌啶类物质多采用气相色谱法(GC法)进行测定，氨基哌啶盐酸盐类物质主要采用衍生化方法进行测定，而R-3-氨基哌啶双盐酸盐沸点高，不适用于气相色谱分析；且分子中无共轭结构，无紫外吸收，常规高效液相色谱仪无法进行测定；并且R-3-氨基哌啶双盐酸盐(氨基哌啶类物质)柱前衍生产物不唯一，难以定量；常规衍生化反应过程繁琐，操作不便，重现性、准确度不佳。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供原料药中R-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用。
本发明提供了邻苯二甲醛在R-3-氨基哌啶双盐酸盐衍生中的应用。
本发明提供了试剂盒，其包括邻苯二甲醛衍生试剂、硼酸盐缓冲溶液、流动相A、流动相B、对照品溶液和/或系统适用性溶液中的至少一种；
所述邻苯二甲醛衍生试剂为含有甲醇或乙醇中的任意一种、邻苯二甲醛、和3-巯基丙酸的硼酸盐缓冲液；
所述邻苯二甲醛衍生试剂中，
邻苯二甲醛的终浓度为5mg/mL～55mg/mL；
3-巯基丙酸的终浓度为0.5mg/mL～5mg/mL；
所述对照品溶液为含有R-3-氨基哌啶双盐酸的硼酸盐缓冲溶液；
所述系统适应性溶液为含有R-3-氨基哌啶双盐酸和琥珀酸曲格列汀的硼酸盐缓冲溶液；
所述流动相A的pH范围4～8，所述流动相A包括水、磷酸氢二钠和四硼酸钠；
所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液，其中，乙腈和甲醇的体积比为1:1。
本发明中，所述衍生试剂的制备方法为：称取邻苯二甲醛后利用甲醇或乙醇溶解，随后加入含有3-巯基丙酸的硼酸缓冲液，然后利用硼酸缓冲液定容。采用乙醇或甲醇溶解邻苯二甲醛，乙醇或甲醇的使用量根据溶解情况调整。
所述硼酸盐缓冲溶液为pH 9.8的10mM的硼酸盐缓冲液。
进一步的，所述试剂盒中，
所述对照品溶液为含有0.1mg/mL R-3-氨基哌啶双盐酸的硼酸盐缓冲溶液；
所述系统适应性溶液为含有0.1mg/mL R-3-氨基哌啶双盐酸和10mg/mL琥珀酸曲格列汀的硼酸盐缓冲溶液；
所述邻苯二甲醛衍生试剂为含有甲醇、邻苯二甲醛、和3-巯基丙酸的硼酸盐缓冲液；
所述邻苯二甲醛衍生试剂中，
邻苯二甲醛的终浓度为10.17mg/mL；
3-巯基丙酸的终浓度为0.86mg/mL；
采用低浓度的衍生试剂可以节省试剂，同时降低浓度可以减少衍生试剂的残留，在实际应用中邻苯二甲醛在10mg/ml左右即可满足要求，3-巯基丙酸的终浓度为1mg/mL左右即可满足要求，具体实施例中可以为0.86mg/mL。
所述流动相A的pH为6.1，所述流动相A中，磷酸氢二钠的浓度为10mM，四硼酸钠的浓度为10mM。
本发明提供如下i)～ii)所示中的至少一种在R-3-氨基哌啶双盐酸盐的检测和/或琥珀酸曲格列汀原料药的质量评估中的应用：
i)、邻苯二甲醛；
ii)、本发明所述的试剂盒。
本发明提供了R-3-氨基哌啶双盐酸盐的检测方法，其包括利用本发明所述的试剂盒对样品进行衍生和液相色谱进行检测。
进一步的，所述的检测方法中，所述衍生包括如下步骤：
样品与硼酸盐缓冲液混匀获得第一混合物，第一混合物与邻苯二甲醛衍生试剂混匀获得第二混合物；第二混合物与硼酸盐缓冲液混匀后等待，完成样品衍生。
本发明中，所述混匀的参数设置包括空气混匀和不与空气混匀，本发明设置为空气混匀，实验结果表明，与空气混匀后进样能够显著改善残留问题，减少干扰，结果更加准确。
进一步的，所述样品、第一混合物中的硼酸盐缓冲液、邻苯二甲醛衍生试剂、第三混合物中的硼酸盐缓冲液的体积比为2：5：(1～2)：(11～12)；
所述等待的时间为0～1min。
本发明中，所述的衍生为利用液相色谱进行衍生，衍生方法简单，操作方便快捷，有助于自动化衍生和检测程序的实现，可节约大量时间和人力成本。
本发明所述的检测方法中，所述液相色谱的检测条件包括：
色谱柱为Waters XTerra RP18；
流动相A；
流动相B；
柱温25～45℃，优选35℃；
流速0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min；
检测波长230～330nm，优选330nm；
进样量5～20μl，优选10μl；
进一步的，本发明中，所述液相色谱检测的条件还包括如下所示的洗脱程序：
第0～10min，流动相A的体积分数为80％；
第10min～20min，流动相A的体积分数由80％至65％；
第20min～20.1min，流动相A的体积分数由65％至45％；
第20.1min～30min，流动相A的体积分数为45％；
第30min～30.1min，流动相A的体积分数由45％至80％；
第30.1min～40min，流动相A的体积分数为80％。
R-3-氨基哌啶结构中含有一个伯胺、一个仲胺结构，α-甲基-2-萘乙酰氯等作为衍生试剂，伯胺仲胺均能与其发生衍生化反应，反应产物不单一，不能完成R-3-氨基哌啶双盐酸盐(R-3-氨基哌啶)的精确测定，除此以它们为衍生试剂需要控制衍生物与目标物的摩尔浓度比，控制只发生单衍生化反应，控制单衍生化理论上可行，实际操作困难。因此，与本发明的衍生试剂相比，上述试剂用于R-3-氨基哌啶双盐酸盐的衍生，操作复杂，不易控制，难以对目标物进行精准定量。
本发明对衍生试剂和洗脱程序进行了优化，结果表明，利用衍生试剂进行柱前衍生结合优化的液相洗脱流程后获得的检测结果更好；进一步的，本发明对液相色谱柱进行了筛选，结果表明，利用Waters XTerra RP18时SM3衍生物峰对称性好；更进一步的，本发明对检测波长进行了优化，结果表明在230nm～330nm波长范围内，330nm为最优检测波长；除此，本发明对衍生后等待时间进行了优化，将等待时间确定为1min，有助于降低后续复杂样品的检测风险。因此，本发明中，涉及的试剂、参数、步骤均对检测效果产生影响，应作为一个整体进行保护。
本发明采用柱前衍生方法对R-3氨基哌啶双盐酸盐进行前处理，在其结构上引入具有紫外吸收的基团，采用高效液相色谱仪在线衍生程序衍生后进行检测，解决了R-3氨基哌啶双盐酸盐在常规高效液相色谱仪-紫外检测器上无响应的问题，且柱前衍生采用自动进样程序，操作简便，自动化程度高、方法重现性好、检测灵敏度高。
附图说明
图1示R-3-氨基哌啶双盐酸盐为琥珀酸曲格列汀(API)原料药的起始物料的合成路线；
图2示所述R-3-氨基哌啶双盐酸结构；
图3示API的结构；
图4示色谱条件1典型色谱图；
图5示色谱条件2典型色谱图；
图6示色谱条件3典型色谱图；
图7示供试品加标溶液(检测波长230nm)典型图谱；
图8示供试品加标溶液(检测波长330nm)典型图谱；
图9示空白溶液典型图谱；
图10示加标供试品溶液典型图谱；
图11示定量限溶液典型图谱。
具体实施方式
本发明提供了原料药中R-3-氨基哌啶双盐酸盐的测定方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明创新性采用OPA对氨基哌啶类物质进行柱前在线衍生，HPLC进行测定，开发了适用于氨基哌啶类物质的含量测定方法。
本发明的目的在于提出一种可以检测原料药中R-3-氨基哌啶双盐酸残留量的液相方法，并且具有操作简便、灵敏度高的优点，并进行了初步方法学验证。所述R-3-氨基哌啶双盐酸结构如图2；所述API的结构如图3。
本发明的第一方面，提出了检测R-3-氨基哌啶双盐酸的高效液相实施方法，根据本发明的实施例，所述方法包括高效液相方法的开发和衍生物柱前制备工艺。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明实施例1～2，所述流动相梯度洗脱程序选择过程如下：
在表3所示的梯度洗脱程序下，SM3衍生物峰峰形好，无空白干扰，可提高方法的专属性；
根据本发明的实施例2～3，所述色谱柱的选择过程如下：分别考察了WatersXBridge C18(250×4.6mm,5μm)和Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)色谱柱，其中Waters XTerra RP18色谱柱上SM3衍生物峰对称性好。
根据本发明的实施例4，所述检测波长选择过程如下：在230nm～330nm波长范围内空白均无干扰，330nm波长基线较平缓，为最优的检测波长，因此确定检测波长为330nm。
根据本发明的实施例5，所述衍生试剂的用量选择过程如下：衍生试剂用量1～2μl回收率均能满足要求，确定1μl的衍生试剂用量为最优选择。
根据本发明的实施例6，所述衍生后等待进样时间选择如下：结果显示，该衍生反应速度快，等待0min与等待1min回收率结果无差异，考虑到增加等待时间有助于降低后续复杂样品的检测风险，故确定衍生程序中进样等待时间为1min。
根据本发明的实施例1～6，所述衍生方法及色谱条件确定如下：
色谱柱：Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
波长：330nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如下；
在线衍生进样程序如下：
函数 参数
抽取 5μL硼酸盐缓冲液
抽取 2μL样品溶液
混合 将7μL溶液以默认速度与空气混合
抽取 1μL OPA衍生试剂
混合 将8μL溶液以默认速度与空气混合
抽取 12μL硼酸盐缓冲液
混合 将20μL溶液以默认速度与空气混
等待 1min
进样 -
根据本发明的实施例，所述衍生试剂的制备过程为：称取邻苯二甲醛(OPA)约10mg，加甲醇80μl使溶解完全，加20μl 3-巯基丙酸，加0.9ml硼酸盐缓冲液，混匀，即得；其中目标物与衍生试剂反应式为：
根据本发明的实施例7，所述分析方法的回收率考察结果如下：三个浓度水平的两份平行样品回收率在90％～108％之间，回收率RSD为1.42％，满足分析要求，该方法准确度良好。
根据本发明的实施例8，所述分析方法的定量限考察结果如下：6针LOQ1溶液S/N值均符合符合要求，峰面积RSD为3.37％，LOQ2溶液S/N值同样符合要求。该方法定量限能达到2ng/ml，方法灵敏度高。
根据本发明的实施例9，所述分析方法的进样精密度考察结果如下：6针TS+STD溶液峰面积RSD为3.03％，符合要求，自动衍生程序进样精密度好。
实施例1色谱条件1
色谱柱：Waters XBridge C18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
PDA检测器：检测波长330nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表1：
表1.梯度洗脱程序1
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 78 22
20 78 22
20.1 46 54
26 46 54
26.1 78 22
32 78 22
在线衍生进样程序如表2：
表2.在线衍生进样程序1
函数 参数
抽取 5μL硼酸盐缓冲液
抽取 2μL样品溶液
混合 将7μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 1μL OPA溶液
混合 将8μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 1μL 3-巯基丙酸衍生试剂
混合 将9μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 11μL流动相A
混合 将20μL溶液以默认速度与空气混合8次
进样 -
硼酸盐缓冲溶液：称取氢氧化钠1.14g+硼酸2.48g，加水溶解稀释至100mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至9.8，即得；
OPA溶液：称取邻苯二甲醛(OPA)54.16mg，加乙醇1ml使溶解完全，混匀，即得；
3-巯基丙酸溶液：称取3-巯基丙酸42.96mg，加1ml硼酸盐缓冲液混匀，既得；
对照溶液配制：称取SM3约10mg置于10ml量瓶中，加硼酸盐缓冲溶液溶解稀释至刻度，摇匀，得对照贮备液，取对照贮备液1ml置10ml量瓶，加硼酸盐缓冲溶液稀释至10ml刻度，摇匀，既得。
系统适用性溶液：称取API约100mg置10ml量瓶中，加适量硼酸盐缓冲溶液使溶解，加入1ml对照贮备液，用硼酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，即得；
取供试品溶液、对照溶液、对照贮备液、系统适用性溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，如图4所示。
图中结果显示，SM3衍生物出峰为23.509min，峰形一般。
实施例2色谱条件2
色谱柱：Waters XBridge C18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
PDA检测器：检测波长230nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表3：
表3.梯度洗脱程序2
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 80 20
10 80 20
25 50 50
30 50 50
30.1 80 20
35 80 20
在线衍生进样程序如表4：
表4.在线衍生进样程序2
OPA衍生试剂：称取邻苯二甲醛(OPA)53.47mg，加甲醇0.3ml使溶解完全，加0.1ml3-巯基丙酸溶液(此处的3-巯基丙酸为实施例1中配制的溶液，其浓度为42.96mg/ml；此步骤中制备的衍生试剂中，3-巯基丙酸的最终浓度为4.296mg/ml)，加0.6ml硼酸盐缓冲液，混匀，即得；
其他溶液配制同实施例1。
取对照溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，如图5所示。
图中结果显示，该色谱条件下色谱峰峰形有所改善。
实施例3色谱柱选择
色谱条件3如下所示：
色谱柱：Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
PDA检测器：检测波长230nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表5(同实施例2的表3)：
表5.梯度洗脱程序
在线衍生进样程序如表6(实施例2的表4)：
表6.在线衍生进样程序
函数 参数
抽取 5μL硼酸盐缓冲液
抽取 2μL样品溶液
混合 将7μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 2μL OPA衍生试剂
混合 将9μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 11μL硼酸盐缓冲液
混合 将20μL溶液以默认速度与空气混合8次
等待 1min
进样 -
取对照溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，所得色谱图，如图6所示，图中结果显示，SM3衍生物峰峰形良好。
实施例4检测波长的确定
采用实施例3中的色谱条件，分别提取不同检测波长下的图谱进行比较，如图7～图8所示：在230nm～330nm波长范围内空白均无干扰，330nm波长基线较平缓，为最优的检测波长，因此确定检测波长为330nm。
实施例5衍生试剂用量考察，衍生后等待时间考察
色谱条件4(衍生试剂用量考察，衍生后等待时间考察)：
色谱柱：Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
波长：330nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表7：
表7.梯度洗脱程序
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 80 20
10 80 20
20 65 50
20.1 45 50
30 45 20
30.1 80 20
40 80 20
在线衍生进样程序如表8：
表8.在线衍生进样程序探索1
函数 参数
抽取 5μL硼酸盐缓冲液
抽取 2μL样品溶液
混合 将7μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 2μL OPA衍生试剂(1～2μL)
混合 将9μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 11μL硼酸盐缓冲液(11～12μL)
混合 将20μL溶液以默认速度与空气混合8次
等待 1min(0～0.5min)
进样 -
衍生进样程序一：抽取2μL OPA衍生试剂，11μL硼酸盐缓冲液，衍生后等待0min进样；
衍生进样程序二：抽取1μL OPA衍生试剂，12μL硼酸盐缓冲液，衍生后等待0min进样；
衍生进样程序三：抽取1μL OPA衍生试剂，11μL硼酸盐缓冲液，衍生后等待0.5min进样；
OPA衍生试剂：称取邻苯二甲醛(OPA)22.01mg，加甲醇0.1ml使溶解完全，加50μl3-巯基丙酸溶液(所有实施例中的3-巯基丙酸溶液均为实施例1中制备的3-巯基丙酸溶液，此时OPA衍生试剂中3-巯基丙酸得到浓度为2.148mg/ml)，加0.85ml硼酸盐缓冲液，混匀，即得；
供试品溶液：称取API约100mg置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
对照溶液配制：称取杂质R约10mg置于10ml量瓶中，加稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀，取1ml置10ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，得对照贮备液，取对照贮备1ml置10ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性溶液：称取API约100mg置10ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，加入1ml对照品贮备液，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；配置两份；
取供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图结果如表9所示(回收率计算公式为加标供试品峰面积除以对照品峰面积(供试品中无目标物检出)：
表9.回收率
STD-1 STD-2 Mean
32755 32379 32567
TS+STD-1 TS+STD-2 Mean 回收率％
34746 34859 34802.5 106.86％
等待时间/衍生试剂量 STD TS+STD 回收率％
0min，2μl 33405 34842 104.30
0min，1μl 34024 35104 103.17
0.5min，1μl 33328 35009 105.04
结果表明，减少衍生试剂的用量，回收率能够满足分析要求。可减少衍生试剂的用量；等待时间。
实施例6衍生时间考察
色谱条件5(衍生时间考察)
色谱柱：Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
波长：330nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表10(同实施例5的表5)：
表10.梯度洗脱程序
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 80 20
10 80 20
20 65 50
20.1 45 50
30 45 20
30.1 80 20
40 80 20
在线衍生进样程序如表11：
表11.在线衍生进样程序探索2
函数 参数
抽取 5μL硼酸盐缓冲液
抽取 2μL样品溶液
混合 将7μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 1μL OPA衍生试剂
混合 将8μL溶液以默认速度与空气混合5次
抽取 12μL硼酸盐缓冲液
混合 将20μL溶液以默认速度与空气混合8次
等待 0～1min
进样 -
OPA衍生试剂：称取邻苯二甲醛(OPA)10.17mg，加甲醇80μl使溶解完全，加20μl 3-巯基丙酸，加0.9ml硼酸盐缓冲液，混匀，即得；后续实施例6、7、8的溶液配制按照实施例6，采用低浓度的衍生试剂可以节省试剂，同时降低浓度可以减少衍生试剂的残留。因此确定采用低浓度的衍生试剂进行实验。
取对照溶液、系统适用性溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，结果如表12所示：
表12.回收率
上表结果显示，该衍生反应速度快，等待0min与等待1min回收率结果无差异，考虑到增加等待时间有助于降低后续复杂样品的检测风险(若遇到浓度较大的样品，等待时间能够有助于样品混合及反应更加完全。因此确定等待时间1min)，故确定衍生程序中进样等待时间为1min。
实施例7回收率考察
色谱条件如下：
色谱柱：Waters XTerra RP18(250×4.6mm,5μm)；
流动相A：10mM磷酸氢二钠+10mM四硼酸钠(pH＝6.1)；
流动相B：乙腈：甲醇＝1：1；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
波长：330nm；
稀释剂：流动相A；
梯度洗脱程序如表13(同实施例5中的表5)：
表13.梯度洗脱程序3
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 80 20
10 80 20
20 65 50
20.1 45 50
30 45 20
30.1 80 20
40 80 20
在线衍生进样程序如表14：
表14.在线衍生进样程序
采用上述色谱条件，分别配制50％，100％，150％限度浓度加标供试品溶液，按上述方法分析，进样测定，考察回收率，空白及加标溶液(系统适应性溶液)典型图谱如图9、图10所示，结果如表15：
表15
表16
上述结果显示，各浓度回收率在90％～108％之间，回收率RSD为1.42％，满足分析要求，该方法准确度良好。
实施例8定量限考察
采用实施例7中的色谱条件，配制LOQ1和LOQ2溶液(同一浓度的定量限溶液，两份平行样)，按上述方法分析，LOQ1进6针，LOQ2进1针，记录色谱图，如图11所示，结果如表17：
表17.定量限
上述结果显示，6针LOQ1溶液S/N值均符合符合要求，峰面积RSD为3.37％，LOQ2溶液S/N值同样符合要求。该方法定量限能达到2ng/ml，方法灵敏度高。
实施例9进样精密度考察
采用实施例7中的色谱条件，配制TS+STD溶液，按上述方法分析，连进6针，考察进样精密度，结果如表18：
表18.进样精密度
上述结果显示，6针TS+STD溶液峰面积RSD为3.03％，符合要求，说明仪器进样精密度良好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.邻苯二甲醛在R-3-氨基哌啶双盐酸盐衍生中的应用。
2.试剂盒，其特征在于，包括邻苯二甲醛衍生试剂、硼酸盐缓冲溶液、流动相A、流动相B、对照品溶液和/或系统适用性溶液中的至少一种；
所述邻苯二甲醛衍生试剂为含有甲醇或乙醇中的任意一种、邻苯二甲醛、和3-巯基丙酸的硼酸盐缓冲液；
所述邻苯二甲醛衍生试剂中，
邻苯二甲醛的终浓度为5mg/mL～55mg/mL；
3-巯基丙酸的终浓度为0.5mg/mL～5mg/mL；
所述对照品溶液为含有R-3-氨基哌啶双盐酸的硼酸盐缓冲溶液；
所述系统适应性溶液为含有R-3-氨基哌啶双盐酸和琥珀酸曲格列汀的硼酸盐缓冲溶液；
所述流动相A的pH为4～8，所述流动相A包括水、磷酸氢二钠和四硼酸钠；
所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液，其中，乙腈和甲醇的体积比为1:1。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述邻苯二甲醛衍生试剂为含有甲醇、邻苯二甲醛、和3-巯基丙酸的硼酸盐缓冲液；
所述邻苯二甲醛衍生试剂中，
邻苯二甲醛的终浓度为10.17mg/mL；
3-巯基丙酸的终浓度为0.86mg/mL；
所述流动相A的pH为6.1，所述流动相A中，磷酸氢二钠的浓度为10mM，四硼酸钠的浓度为10mM。
4.如下i)～ii)所示中的至少一种在R-3-氨基哌啶双盐酸盐的检测和/或琥珀酸曲格列汀原料药的质量评估中的应用：
i)、邻苯二甲醛；
ii)、权利要求2或3所述的试剂盒。
5.R-3-氨基哌啶双盐酸盐的检测方法，其特征在于，包括利用权利要求2或3所述的试剂盒对样品进行衍生和液相色谱进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述衍生包括如下步骤：
样品与硼酸盐缓冲液混匀获得第一混合物，第一混合物与邻苯二甲醛衍生试剂混匀获得第二混合物；第二混合物与硼酸盐缓冲液混匀后等待，完成样品衍生；
所述混匀的参数设置为空气混匀。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，
所述样品、第一混合物中的硼酸盐缓冲液、邻苯二甲醛衍生试剂、第三混合物中的硼酸盐缓冲液的体积比为2：5：(1～2)：(11～12)；
所述等待的时间为0～1min。
8.根据权利要求5～7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的检测条件包括：
色谱柱为Waters XTerra RP18；
柱温25～45℃；
流速0.8～1.2ml/min；
检测波长230nm～330nm；
进样量5～20μl。
9.根据权利要求5～8任一项所述的检测方法，其特征在于，
所述柱温为35℃；
流速为1.0ml/min；
检测波长为330nm；
所述进样量为10μl。
10.根据权利要求5～9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测的条件还包括如下所示的洗脱程序：
第0～10min，流动相A的体积分数为80％；
第10min～20min，流动相A的体积分数由80％至65％；
第20min～20.1min，流动相A的体积分数由65％至45％；
第20.1min～30min，流动相A的体积分数为45％；
第30min～30.1min，流动相A的体积分数由45％至80％；
第30.1min～40min，流动相A的体积分数为80％。
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