CN105506187A - 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针 - Google Patents

小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针 Download PDF

Info

Publication number
CN105506187A
CN105506187A CN201610091937.3A CN201610091937A CN105506187A CN 105506187 A CN105506187 A CN 105506187A CN 201610091937 A CN201610091937 A CN 201610091937A CN 105506187 A CN105506187 A CN 105506187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
quantitative pcr
sequence
mice
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610091937.3A
Other languages
English (en)
Inventor
钱学敏
姜东秀
刘大钧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Apptec Suzhou Testing Technology Co Ltd
Wuxi Apptec Biopharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Apptec Suzhou Testing Technology Co Ltd
Wuxi Apptec Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Apptec Suzhou Testing Technology Co Ltd, Wuxi Apptec Biopharmaceuticals Co Ltd filed Critical Wuxi Apptec Suzhou Testing Technology Co Ltd
Priority to CN201610091937.3A priority Critical patent/CN105506187A/zh
Publication of CN105506187A publication Critical patent/CN105506187A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，步骤包括：1)提取待测样品DNA；2)制备包含Master？mix、上下游引物、探针的PCR反应液；3)梯度稀释标准品；4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；5)PCR反应。本发明还公开了上述方法所用的引物对和探针的序列。本发明采用TaqMan探针的定量PCR方法检测小鼠细小病毒，相比传统的MVM检测方法，不仅具有更高的特异性和灵敏性，而且简单易操作，检测耗时短，结果稳定性和重复性好，适合生物生产过程中各个阶段的MVM感染测试。

Description

小鼠细小病毒定量PCR检测方法及其引物与探针
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及小鼠细小病毒的定量PCR检测，及其所用的引物和探针。
背景技术
随着生物医药技术的飞速发展，人们越来越重视疫苗等生物制品的安全性，加强了对其的质量控制。生物制品的质量控制不仅仅是对终产品的质量控制，还是对整个生产过程的质量控制。因此，全球各国监管当局要求生产企业在临床试验被批准前及生物药和疫苗终产品释放前，生产流程的各个环节都必须通过繁复的安全测试以证明产品的一致性、稳定性及纯度。
啮齿类动物及衍生的传代细胞系CHO，广泛应用于生产疫苗和治疗性生物制品。CHO细胞高度易感于小鼠细小病毒(MinuteVirusofMice，MVM)，MVM曾在日常生物药生产过程中引起原液的污染。MVM基因组为单链线状DNA，约5.2kb，存在两个开放阅读框，一个编码衣壳蛋白，另一个编码非结构(non-structure，NS)蛋白。MVM可以致先天性胎儿畸形，从而导致流产。因此，提供一种合适的检测MVM的方法，从而拥有一个高效的细胞基质、原液病毒感染的排除机制，变得非常必要。
目前常用的检测MVM方法有酶联免疫吸附试验方法、免疫酶试验方法和免疫荧光试验方法，但这些方法都存在操作复杂、检测时间长、特异性和稳定性差等缺点。
定量PCR，又称定量即时聚合酶链锁反应(Quantitativerealtimepolymerasechainreaction)，是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，它简单，高效，结果稳定，重复性好。
为解决上述技术问题，本发明的小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，步骤包括：
1)提取待测样品DNA；
2)制备包含Mastermix、上下游引物、探针的PCR反应液；
3)梯度稀释标准品；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)PCR反应。
步骤1)，待测样品DNA模板的浓度为0.1μg/μL。
步骤3)，至少5个以上十倍梯度稀释标准品。标准品浓度范围一般为10～105拷贝。
步骤5)，PCR反应体系为25微升，正反向引物的终浓度分别为100nM，探针的终浓度为250nM。反应条件为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，45个循环。所述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或其互补序列，所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。
本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于上述小鼠细小病毒定量PCR检测方法的引物对。所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或其互补序列。
本发明要解决的技术问题之三是提供一条用于上述小鼠细小病毒定量PCR检测方法的探针。所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。
本发明采用TaqMan探针的定量PCR方法检测小鼠细小病毒，相比传统的MVM检测方法，不仅具有更高的特异性和灵敏性，而且简单易操作，检测耗时短，结果稳定性和重复性好，适合生物生产过程中各个阶段的MVM感染测试，例如动物来源的原辅料、原液和临床试验产品批次，特别是原料测试中包含的主细胞库(Mastercellbank，MCB)、工作细胞库(Workingcellbank，WCB)、最终生产细胞(EndofProduction，EPC)等等。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明详述如下：
本实施例的小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，具体步骤为：
步骤1，用蛋白酶K/SDS消化、多次酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法，或者使用其它商业化试剂盒，提取待测样品的DNA，并将DNA模板的浓度调整为0.1μg/μL。如果DNA浓度很低，则以最小体积的1×TE缓冲液重悬DNA。
步骤2，制备包含有1×Mastermix、上游引物(终浓度为100nM)、下游引物(终浓度为100nM)、探针(终浓度为250nM)的PCR反应液。所用引物和探针的序列如下：
MVM正向引物：TTACAACGAGGAGCGGAAACTAC(SEQIDNO.1)
MVM反向引物：CTGTGGTTTCCCATTCCATGT(SEQIDNO.2)
MVM探针：TGGGACCAAAGCGAG(SEQIDNO.3)
步骤3，稀释标准品。至少5个十倍梯度稀释，一般标准品浓度范围为10～105拷贝。本实施例使用含有MVM基因组NS-1基因区域的、自定义合成(载体pUC57-Amp，载体大小约2700bp，克隆位点为5’EcoRV、3’EcoRV)的质粒DNA作为标准品。
步骤4，上样。包括：试剂的阴性对照(指含有除DNA模板以外所有组分的反应孔)，测试样品的阴性对照(一般为从H9和HEK293细胞中纯化的DNA)，阳性对照(即标准品)，以及加入了标准品的测试品(用来监控PCR的干扰情况)。
步骤5，采用ABI7500实时PCR系统进行PCR反应。通常反应体系为25微升，反应条件为50℃2分钟，95℃10分钟，其后的95℃15秒和60℃1分钟共45个循环。
步骤6，结果分析。在结果符合以下标准时，认为检测是有效的：
1)掺杂了1000拷贝MVMDNA标准品的H9或HEK293(对照)DNA，必须显示高于背景的荧光信号；
2)100拷贝的MVMDNA标准品，必须显示高于背景的荧光信号；
3)高于等于检测极限(LOD)的荧光信号，在试剂对照里必须不可检测到；
4)高于等于检测极限(LOD)的荧光信号，在没有掺杂的H9或HEK293(对照)的DNA样品里必须不可检测到；
5)标准曲线的R2，必须大于等于0.90。
在检测有效的情况下，按照不同情况给出不同的结果报告：
1)如果在PCR扩增的没有掺杂的测试样品DNA的所有重复(孔)中，荧光信号都低于LOD，表明在该样品里，对所用引物和探针特异的MVM序列没有达到可检测量的存在。结果将报告为“阴性”。
2)如果在PCR扩增的没有掺杂的测试样品DNA的任意二个重复(孔)中，特异的荧光信号等于或高于LOD；相比之下，阴性对照没有这样的荧光信号，表明在该样品里，存在MVMDNA。结果报告为“阳性”。
3)如果等于或高于LOD的特异荧光信号，只在PCR扩增的没有掺杂的测试样品DNA的一个重复(孔)中检测到，结果将报告为“阳性候选：要求确认”。
4)如果在掺杂了100和1000拷贝MVMDNA标准品的测试样品中，都没有检测到高于背景的荧光信号，结果报告为：“测试品干扰PCR反应”。

Claims (9)

1.小鼠细小病毒的定量PCR检测方法，其特征在于，步骤包括：
1)提取待测样品DNA；
2)制备包含Mastermix、正向引物、反向引物和探针的PCR反应液；
3)梯度稀释标准品；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)PCR反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，待测样品DNA模板的浓度为0.1μg/μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，5个以上十倍梯度稀释标准品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)，标准品浓度范围为10～105拷贝。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)，PCR反应体系为25微升，引物的终浓度为100nM，探针的终浓度为250nM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)，PCR反应条件为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，45个循环。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或其互补序列，所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。
8.用于小鼠细小病毒定量PCR检测方法的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或其互补序列。
9.用于小鼠细小病毒定量PCR检测方法的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQIDNO.3所示的序列或其互补序列。
CN201610091937.3A 2016-02-19 2016-02-19 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针 Pending CN105506187A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610091937.3A CN105506187A (zh) 2016-02-19 2016-02-19 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610091937.3A CN105506187A (zh) 2016-02-19 2016-02-19 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105506187A true CN105506187A (zh) 2016-04-20

Family

ID=55714476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610091937.3A Pending CN105506187A (zh) 2016-02-19 2016-02-19 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105506187A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106167836A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN106367530A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 广东省实验动物监测所 一种快速鉴别四种大鼠细小病毒株的引物组及检测方法
CN114934136A (zh) * 2022-05-24 2022-08-23 武汉珈创生物技术股份有限公司 同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450968A (zh) * 2014-12-22 2015-03-25 福建农林大学 用于猪细小病毒5型实时荧光定量pcr方法的引物及探针
CN105063043A (zh) * 2015-09-21 2015-11-18 山东农业大学 一种鸭细小病毒Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450968A (zh) * 2014-12-22 2015-03-25 福建农林大学 用于猪细小病毒5型实时荧光定量pcr方法的引物及探针
CN105063043A (zh) * 2015-09-21 2015-11-18 山东农业大学 一种鸭细小病毒Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEJIN ZHAN, ET AL.: "Detection of Minute Virus of Mice Using Real Time Quantitative PCR in Assessment of Virus Clearance During the Purification Of Mammalian Cell Substrate Derived Biotherapeutics", 《BIOLOGICALS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106167836A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN106367530A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 广东省实验动物监测所 一种快速鉴别四种大鼠细小病毒株的引物组及检测方法
CN106167836B (zh) * 2016-08-30 2018-07-06 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN114934136A (zh) * 2022-05-24 2022-08-23 武汉珈创生物技术股份有限公司 同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Read et al. LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system
Munro et al. Comparison of a multiplex real-time PCR assay with a multiplex Luminex assay for influenza virus detection
CN104195268B (zh) 检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法
CN106319055B (zh) 一种三联核酸检测试剂盒
CN105506187A (zh) 小鼠细小病毒定量pcr检测方法及其引物与探针
CN103614489A (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
Khan et al. CRISPR-cas13 enzymology rapidly detects SARS-CoV-2 fragments in a clinical setting
CN103397105A (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN101805802B (zh) 荧光定量pcr检测马秋波病毒的方法
CN103074428B (zh) 一种结核分枝杆菌tb检测试剂盒
CN100352944C (zh) 快速检测细小脲原体的荧光定量pcr试剂盒
Xu et al. Branched RCA coupled with a NESA-based fluorescence assay for ultrasensitive detection of miRNA
CN103740864A (zh) 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒
CN106222301A (zh) 一种精确定量检测诺如病毒ⅱ型的试剂盒及检测方法
CN105039598A (zh) 一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒
CN103898240A (zh) 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法
Parida et al. Rapid and real-time assays for detection and quantification of chikungunya virus
CN101565741A (zh) 实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒
CN104328209B (zh) 白血病微小残留病wt1基因快速检测方法的引物和试剂盒
CN103555859B (zh) 一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN102031314A (zh) 一种用于检测人偏肺病毒核酸的引物和探针序列
CN105648102A (zh) 检测疫苗中mdck细胞dna残留的试剂盒
CN103602756A (zh) 一种新城疫病毒的检测方法
CN109468412A (zh) 一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的引物、试剂盒及方法
Zhang et al. A CRISPR/Cas12a-assisted array for Helicobacter pylori DNA analysis in saliva

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 215104 North Side of Wuzhong Avenue, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: SUZHOU YAOMING KANGDE INSPECTION TESTING CO., LTD.

Applicant after: Wuxi Yaoming Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 215104 North Side of Wuzhong Avenue, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: SUZHOU YAOMING KANGDE INSPECTION TESTING CO., LTD.

Applicant before: WUXI APPTEC BIOPHARMACEUTICALS CO., LTD.

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 215104 North Side of Wuzhong Avenue, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: Suzhou Pharmacopoeia Testing and Inspection Co., Ltd.

Applicant after: Wuxi Yaoming Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 215104 North Side of Wuzhong Avenue, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: SUZHOU YAOMING KANGDE INSPECTION TESTING CO., LTD.

Applicant before: Wuxi Yaoming Biotechnology Co., Ltd.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160420