CN105486763B - 一种坤灵丸的质量检测方法及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了一种坤灵丸的质量检测方法，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分进行鉴别，包括对牡丹皮、当归‑川芎‑藁本、延胡索、白芍、红参、香附的鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中有效成分丹皮酚的含量进行测定，本发明具有方法简便、速度快、重现性好等特点，所建立的鉴别及含量测定方法经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种坤灵丸的质量检测方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐瘀生新。用于月经不调，或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾亏腰痛。
坤灵丸的处方如下：
【处方】
(一)香附(制)37g 甘草7g 白薇14g 益母草14g 黄芪14g 鸡冠花14g 麦冬14g 北五味子14g 地黄14g 红花14g 木通10g 白术(炒)14g 赤石脂14g茯苓14g 厚朴10g 肉苁蓉(制)14g 白芍(酒炒)14g
(二)香附(制)37g 荆芥10g 牡丹皮14g 阿胶14g 当归14g 藁本10g 红参14g 鹿角胶14g 川贝母14g 没药(炒)14g 砂仁14g 延胡索14g 小茴香(盐制)14g 龟甲胶14g 川芎14g
【制法】以上处方(一)十七味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。以上处方(二)十五味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量稳定性，坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册，标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，发明人对坤灵丸的有效成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对这些成分进行了研究，建立了一种坤灵丸的检测方法，对生产中的坤灵丸进行质量监督，以确保产品质量。
发明内容
本发明目的在于提供一种坤灵丸的质量检测方法，为该制剂的质量控制提供更完善的检测方法。
本发明所述的质量检测方法，包括鉴别方法和含量测定方法。
本发明首先提供一种坤灵丸的鉴别方法，该方法包括对以下中药的鉴别：
A 牡丹皮鉴别
B 当归-川芎-藁本鉴别
C 延胡索鉴别
D 白芍鉴别
E 红参鉴别
F 香附鉴别
本发明的鉴别方法采用薄层色谱法，共有6项，可以使用其中一项作为对坤灵丸的鉴别方法，也可以多项组合使用作为对坤灵丸的鉴别方法，优选的是多项组合使用，最优选的是6项组合使用。
其次，本发明还包括对坤灵丸中的有效成分丹皮酚进行含量测定，含量测定方法采用高效液相色谱法。
本发明的鉴别方法，优选采用以下方法：
A牡丹皮鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g～12g、糖衣丸12～18g，采用研细方式，加稀盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0.8～1.2g，加稀盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，摇匀，即得。
阴性样品溶液的制备：通过查询文献，白芍中也含有微量的丹皮酚，故按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5～3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液(每100ml 5％三氯化铁乙醇溶液中，加入盐酸1～5滴，混匀，即得)。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(1)。
B当归-川芎-藁本鉴别
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备。
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各0.8～1.2g，分别加乙醚20～50ml，水浴回流15～40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(95～70：5～30：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(2)。
C延胡索鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5～2.5g，加0.1～0.3mol/L的氢氧化钠溶液5～15ml，超声15～25min后，加入乙酸乙酯5～20ml，振摇萃取，2000～3000转/min离心3～10min，取上清液，即得。
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.3～1.0g于20～100ml圆底烧瓶中，加氨水0.3～0.8ml浸润，加二氯甲烷5～15ml，50℃～70℃水浴回流0.5～1h，滤过，挥干，用甲醇1～3ml溶解，即得。
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15～0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨(5～8∶2～5∶0.5～1.5∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(3)。
D白芍鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12～18g(糖衣丸15～20g)，加甲醇30～70ml，加热回流0.5～1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15～25ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次15～25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3～8ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2～3次，每次10～20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1～3ml溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白芍同属毛茛科植物，其主要成分中亦含芍药苷，故按处方配比，取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(30～45:3～6:5～15:0.4)为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(4)。
E红参鉴别
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液。
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备：取红参对照药材0.8～1.2g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板(烟台板)上，以三氯甲烷-甲醇-水(50～70:20～40:5～20)5～10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5～10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(5)。
F香附鉴别
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液。
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8～1.2g，加入稀盐酸1～3ml，加乙醚20～40ml回流20～40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1～3ml复溶，即得。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板(Macherey-Nagel F254高效薄层板)上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(85～95：3～8：3～8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(6)。
本发明的含量测定方法，所述的丹皮酚含量测定方法，步骤如下：
①供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50～70％甲醇溶液中，超声处理后加50～70％甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得；
②对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加50％～70％甲醇溶液制成每1ml含14～18μg丹皮酚的溶液，即得；
③含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量，必要时可以使用阴性对照品溶液以排除干扰；
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为以下填充剂的一种Shimadzu VP-ODS150×4.6mm色谱柱、Dikma Diamomsil-C185μm,250×4.6mm色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C185μm,250×4.6mm，色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA；以30～60∶70～40的甲醇-水为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
优选的，本发明的含量测定方法如下：
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％～70％甲醇水溶液制成每1ml约含14～18μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.4～0.6g，精密称定，置10～25ml容量瓶中，加入50～70％甲醇溶液适量，超声(功率120W，频率40kHz)处理15～30min，放冷至室温，加50～70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、牡丹皮-白芍阴性供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shimadzu VP-ODS(150×4.6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA)；以甲醇-水(30～60∶70～40)为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
其中优选：高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-C185μm，4.6×250mm)；以甲醇-水(30～60∶70～40)为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
最优选，以50∶50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
测定结果见图(7)、(8)、(9)、(10)。结果显示，阴性样品无干扰。
本发明含量测定方法的验证：
1仪器与试药
Waters 2695-2489高效液相色谱仪及紫外检测器；Empower2液相色谱工作站；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，250×4.6mm)；甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；水为超纯水(公司自制，MilliQ)；对照品：丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110708-200506)。
2线性关系考察
取丹皮酚对照品适量，精密称定(实际称样量：12.73mg)，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇溶解，稀释并定容至刻度，摇匀即得对照品母液(0.1273mg/ml)。将丹皮酚对照品母液依次稀释得到浓度为0.0636mg/ml、0.0318mg/ml、0.0159mg/ml、0.0080mg/ml、0.0040mg/ml、0.0020mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液及对照品母液各10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以丹皮酚的对照品浓度(mg/ml)为横坐标，丹皮酚峰面积为纵坐标，求得回归方程：y＝48644921.31x+10376.05，r＝0.9999。结果表明丹皮酚在0.0020mg/ml～0.1273mg/ml浓度范围内，线性良好。
3精密度试验
取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，按照“实施例7”项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述两种供试品溶液10μl，连续进样6针，测得薄膜衣丸峰面积平均值为779400，RSD为0.47％；糖衣丸峰面积平均值为867291，RSD为0.42％。结果表明，供试品溶液在该色谱条件下进行丹皮酚含量测定时，精密度良好。
4重复性试验
取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，研细，取0.5g，精密称定，共6份，照“实施例7”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液及对照品溶液各10μl，进样分析。记录色谱图，并计算丹皮酚的含量。结果薄膜衣丸样品中丹皮酚平均含量为0.8220mg/g，RSD为1.10％；糖衣丸样品中丹皮酚平均含量为0.8958mg/g，RSD为0.24％。结果表明，方法的重复性良好。
5稳定性试验
取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，照“实施例7”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，分别于0、2、8、12、16、24h进样分析，计算峰面积的相对平均偏差RSD，薄膜衣丸、糖衣丸RSD分别为0.66％、0.47％。结果表明供试品溶液在24h内稳定。
6加样回收率试验
取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，研细，取0.25g，精密称定。向已知丹皮酚含量的样品中加入该样品所含丹皮酚含量的80％、100％、120％的丹皮酚对照品，每个浓度各3份，共9份，按“实施例7”项下供试品溶液制备方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，进样分析，记录色谱图，计算回收率，薄膜衣丸平均回收率为103.4％，RSD为0.67％；糖衣丸平均回收率为102.2％，RSD为1.19％。见表1、表2，结果符合含量测定有关要求，说明该方法准确度良好。
表1 薄膜衣丸加样回收率试验
注：薄膜衣丸中丹皮酚含量按照重复性项下含量0.8220mg/g计算。
表2 糖衣丸加样回收率试验
注：糖衣丸中丹皮酚含量按照重复性项下含量0.8958mg/g计算。
7样品测定
分别选取坤灵丸样品三批(薄膜衣丸，批号：20121001、20121101、20130112；糖衣丸，批号：20120901、20120904、20130101)，按“实施例7”项下供试品溶液制备方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，进样分析，记录色谱图，计算含量，结果见表3、4。
表3 薄膜衣丸样品测定
表4 糖衣丸样品测定
本发明的有益效果在于：
本发明中涉及的8味药材的薄层鉴别，除延胡索鉴别需单独处理供试品外，其中牡丹皮、当归、川芎、藁本、香附5味药材鉴别可采用同一供试品溶液，白芍、红参2味药材鉴别可采用同一供试品溶液，本方法既节省样品取样量，又节省溶剂、环保经济、污染小。
丹皮酚含量测定方法考察中，考虑不同厂家色谱柱及不同实验室的仪器设施因素，另分别考察了Shimadzu VP-ODS(150×4.6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA高效液相色谱仪的分离情况，结果均满足要求。
本发明所提供的坤灵丸的质量检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到的，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性好，且方法简便快捷、经济实用、结果快速。含量测定方法中通过对供试品处理方法及色谱条件的考察，证明本方法具有良好的重复性、稳定性、专属性及耐用性，该含量测定方法可有效的对产品进行质量分析，保证了该产品的质量稳定性。
附图说明
图1、从左到右：糖衣丸样品(20120903)、牡丹皮阴性样品、丹皮酚对照品(中检院)、牡丹皮对照药材(中检院)、薄膜衣丸样品(20120809)、薄膜衣丸样品(20121002)、薄膜衣丸样品(20121102)、薄膜衣丸样品(20130103)；
图2、从左到右：薄膜衣丸20121002、薄膜衣20120809、当归对照药材(中检院)、川芎对照药材(中检院)、藁本对照药材(中检院)、薄膜衣丸20121102、糖衣丸20120903；
图3、从左到右：薄膜衣丸20121101、薄膜衣丸20130102、薄膜衣丸20121001、薄膜衣丸20120809、阴性样品、延胡索乙素(中检院)、延胡索对照药材(中检院)、糖衣丸20120903、薄膜衣20121102、薄膜衣丸20121002；
图4、从左到右：薄膜衣丸20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、芍药苷对照品(中检院)、双阴性样品、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101；
图5、从左到右：薄膜衣20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、红参阴性、人参皂苷Rg1+人参皂苷Rb1+人参皂苷Re混合对照品(中检院)、红参对照药材(中检院)、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101；
图6、从左到右：香附阴性、香附对照药材(中检院)、薄膜衣丸20130101、糖衣丸20120901、α-香附酮对照品；
图7、牡丹皮-白芍阴性供试品溶液；
图8、丹皮酚对照品溶液；
图9、薄膜衣丸供试品溶液；
图10、糖衣丸供试品溶液。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实施例1牡丹皮鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸素丸10g，(薄膜衣丸10g：含牡丹皮、延胡索、当归、川芎、白芍约为0.5g；约含藁本0.35g；糖衣丸15g：含牡丹皮、延胡索、当归、川芎、白芍约为0.4g；约含藁本0.3g)，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.0g，加稀盐酸1ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得。
阴性样品溶液的制备：通过查询文献，白芍中也含有微量的丹皮酚，故按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液(每100ml 5％三氯化铁乙醇溶液中，加入盐酸3滴，混匀，即得)。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(1)。
实施例2当归-川芎-藁本鉴别
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备。
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.0g，分别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按制备工艺制备样品，再供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(90：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(2)。
实施例3延胡索鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即得。
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0.5ml浸润，加二氯甲烷10ml，60℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得。
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨(7.5∶4∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(3)。
实施例4白芍鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g(糖衣丸17g)，加甲醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白芍同属毛茛科植物，其主要成分中亦含芍药苷，故按处方配比，取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.4)为展开剂，展开，取出，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(4)。
实施例5红参鉴别
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液。
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1mg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.0g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照药材溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板(烟台板)上，以三氯甲烷-甲醇-水(60:30:10)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(5)。
实施例6香附鉴别
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液。
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1mg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备：取香附对照药材1g，加入稀盐酸1ml，加乙醚30ml回流30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得。
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板(Macherey-Nagel F254高效薄层板)上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(92：5：5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(6)。
实施例7丹皮酚含量测定
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C185μm，4.6×250mm)；以甲醇-水(50∶50)为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl。
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，超声(功率120W，频率40kHz)处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。见附图(7)～(10)。
实施例8
坤灵丸的质量检测方法
牡丹皮的鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g或糖衣丸12g，采用研细方式，加稀盐酸1ml，加乙醚20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0.8g，加稀盐酸1ml，加乙醚20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.8mg的溶液，摇匀，即得；
阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60℃，5∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各0.8g，分别加乙醚20ml，水浴回流15min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以95：5：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
延胡索薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5g，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液5ml，超声15min后，加入乙酸乙酯5ml，振摇萃取，2000转/min离心3min，取上清液，即得；
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.3g于20ml圆底烧瓶中，加氨水0.3ml浸润，加二氯甲烷5ml，50℃水浴回流0.5h，滤过，挥干，用甲醇1ml溶解，即得；
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶2∶0.5∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，
白芍薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12g或糖衣丸15g，加甲醇30ml，加热回流0.5h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次10ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以30:3:5:0.4三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
红参薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取红参对照药材0.8g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15μl、对照药材溶液及对照品溶液5μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以50:20:5三氯甲烷-甲醇-水5℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
香附薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8g，加入稀盐酸1ml，加乙醚20ml回流20min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1ml复溶，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10μl、糖衣丸供试品溶液20μl、对照品溶液1μl和对照药材溶液10μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以85：3：3的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
实施例9
坤灵丸的质量检测方法
牡丹皮的鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸12g或糖衣丸18g，采用研细方式，加稀盐酸4ml，加乙醚50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯3ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.2g，加稀盐酸4ml，加乙醚50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯3ml使溶解，作为对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1.2mg的溶液，摇匀，即得；
阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90℃，3∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.2g，分别加乙醚50ml，水浴回流40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以70：30：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
延胡索薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2.5g，加0.3mol/L的氢氧化钠溶液15ml，超声25min后，加入乙酸乙酯20ml，振摇萃取，3000转/min离心10min，取上清液，即得；
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1.0g于100ml圆底烧瓶中，加氨水0.8ml浸润，加二氯甲烷15ml，70℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇3ml溶解，即得；
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各10μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8∶5∶1.5∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，
白芍薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸18g或糖衣丸20g，加甲醇70ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液8ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗3次，每次20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇3ml溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20μl、对照品溶液15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以45:6:15:0.4三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
红参薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.2g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20μl、对照药材溶液及对照品溶液20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以70:40:20三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
香附薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取香附对照药材1.2g，加入稀盐酸3ml，加乙醚40ml回流40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇3ml复溶，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液20μl、糖衣丸供试品溶液25μl、对照品溶液10μl和对照药材溶液20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以95：8：8的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
实施例10
坤灵丸的质量检测方法
牡丹皮鉴别方法为：
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸10g或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.0g，加稀盐酸1ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的3∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
当归、川芎、藁本鉴别
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备；
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.0g，分别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90：15：1正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。
延胡索鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即得；
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0.5ml浸润，加二氯甲烷10ml，60℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得；
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7.5∶4∶1∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
白芍鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以40:5:10:0.4的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
红参鉴别
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液；
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.0g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以60:30:10的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰
香附鉴别
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取香附对照药材1g，加入稀盐酸1ml，加乙醚30ml回流30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以92：5：5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
实施例11
丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为Shimadzu VP-ODS150×4.6mm，色谱柱；以30∶70的甲醇-水为流动相；检测波长为270nm；流速0.6ml/min；柱温25℃，进样量5μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含14μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.4g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理15min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
实施例12
丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为，Dikma Diamomsil-C185μm,250×4.6mm 3色谱柱；以60∶40的甲醇-水为流动相；检测波长为278nm；流速1.5ml/min；柱温35℃，进样量15μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加70％甲醇水溶液制成每1ml约含18μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.6g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理30min，放冷至室温，加70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
实施例13
丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体为Agilent ZORBAXSB-C185μm，4.6×250mm；
以50∶50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
Claims (7)
1.一种坤灵丸的检测方法，其特征在于，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分牡丹皮、当归、川芎、藁本、延胡索、白芍、红参和香附进行鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中有效成分丹皮酚的含量进行测定；
所述牡丹皮薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g～12g或糖衣丸12～18g，采用研细方式，加稀盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0.8～1.2g，加稀盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，摇匀，即得；
阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以，5～3∶1的60～90℃的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
所述当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各0.8～1.2g，分别加乙醚20～50ml，水浴回流15～40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以95～70：5～30：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
所述延胡索薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5～2.5g，加0.1～0.3mol/L的氢氧化钠溶液5～15ml，超声15～25min后，加入乙酸乙酯5～20ml，振摇萃取，2000～3000转/min离心3～10min，取上清液，即得；
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.3～1.0g于20～100ml圆底烧瓶中，加氨水0.3～0.8ml浸润，加二氯甲烷5～15ml，50℃～70℃水浴回流0.5～1h，滤过，挥干，用甲醇1～3ml溶解，即得；
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15～0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5～8∶2～5∶0.5～1.5∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，
所述白芍薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12～18g或糖衣丸15～20g，加甲醇30～70ml，加热回流0.5～1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15～25ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次15～25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3～8ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2～3次，每次10～20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1～3ml溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以30～45:3～6:5～15:0.4的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
所述红参薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取红参对照药材0.8～1.2g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以50～70:20～40:5～20的三氯甲烷-甲醇-水5～10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5～10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
所述香附薄层鉴别，步骤如下：
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8～1.2g，加入稀盐酸1～3ml，加乙醚20～40ml回流20～40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1～3ml复溶，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以85～95：3～8：3～8的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
①供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50～70％甲醇溶液中，超声处理后加50～70％甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得；
②对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加50％～70％甲醇溶液制成每1ml含14～18μg丹皮酚的溶液，即得；
③含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量，必要时可以使用阴性对照品溶液以排除干扰；
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30～60∶70～40的甲醇-水为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
3.根据权利要求1检测方法，其特征在于，
牡丹皮鉴别方法为：
供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸10g或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.0g，加稀盐酸1ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以的3∶1的60～90℃的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
当归、川芎、藁本鉴别
供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备；
对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.0g，分别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90：15：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。
4.根据权利要求1检测方法，其特征在于，
延胡索鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即得；
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0.5ml浸润，加二氯甲烷10ml，60℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得；
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7.5∶4∶1∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
白芍鉴别
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以40:5:10:0.4的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
5.根据权利要求1检测方法，其特征在于，
红参鉴别
供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液；
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.0g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照药材溶液；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以60:30:10的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
香附鉴别
供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1mg的溶液，作为对照品溶液；
对照药材溶液的制备：取香附对照药材1g，加入稀盐酸1ml，加乙醚30ml回流30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得；
阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以92：5：5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
6.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，所述的丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体选自以下规格中的一种：5μm 150×4.6mm、5μm 250×4.6mm；以30～60∶70～40的甲醇-水为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％～70％甲醇水溶液制成每1ml含14～18μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.4～0.6g，精密称定，置10～25ml容量瓶中，加入50～70％甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理15～30min，放冷至室温，加50～70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
7.根据权利要求5的检测方法，其特征在于，步骤如下：
高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
以50∶50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl；
对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
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