CN105467039A - 一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的hplc测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，该方法采用高效液相色谱（HPLC）法，以混合对照溶液为对照，并以延胡索乙素为参照，同时测定了元胡止痛滴丸中7个主要成分原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素。该方法一测多评，利用成分间的相对校正因子实现多成分的测定，对中药多成分的质量进行控制，实现了元胡止痛滴丸的多指标质量评价。该方法操作简便、快捷，大幅度降低了检测成本和时间，提高了工作效率和方法的实用性，能够更有效、更全面、更准确地控制中药成品的质量，确保产品质量的稳定均一，从而达到保证产品服用安全有效的目的。

Description

一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法
技术领域
本发明属于中成药含量测定技术领域，具体涉及一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法。
背景技术
中药及其制剂均为多组分复杂体系，单一成分和指标难以准确、全面地体现药物的内在质量。中药质量控制正展现出从简单的单成分含量测定转向以先进技术为手段，对多组分、多指标进行综合评价和含量控制的趋势。然而，中药多指标质量控制和评价模式需要有各种成分的对照品，但部分中药对照品分离难度大、单体不稳定、难以供应或供应价格高等问题的存在，使其不能满足中药质量监控和新药研发等方面的需求。
元胡止痛滴丸由延胡索（CorydalisRhizoma）和白芷（AngelicaedahuricaeRadix）两味中药组成，具有理气、活血、止痛的作用，用于气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及月经痛等，现已被列入国家医保甲类药品、国家中药保护品种目录。元胡止痛滴丸现行质量标准收载于《中国药典》（2010年版）第二增补本，其中仅规定了白芷和延胡索的薄层色谱鉴别方法，以及延胡索乙素和欧前胡素含量的HPLC测定方法，难以全面反映元胡止痛滴丸的质量，严重制约了本产品的市场拓展、临床应用及其国际化进程。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种操作简便，实用性高，节约检测成本和时间，能够更有效、全面和准确地控制药物质量的元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，该方法包括以下步骤：
（1）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：254-300nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.1-1.0%的冰醋酸溶液，调冰醋酸溶液pH值为5.0，采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0-10min，20%-22%；10-30min，22%-30%；30-60min，30%-80%；60-65min，80%-100%；流速：0.5-1.0mL/min；柱温：20-40℃；
（2）混合对照品溶液的制备：取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得；
（3）供试品溶液的制备：取元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
（4）待测成分相对校正因子测定：以混合对照品溶液中延胡索乙素为参照，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算出原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分对延胡索乙素的相对校正因子；
式中As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度；Ak为混合对照品溶液中某单一待测成分的色谱峰面积，Ck为混合对照品溶液中某单一待测成分的质量浓度；
（5）元胡止痛滴丸中7种成分的HPLC测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定并确定各待测成分的色谱峰，以混合对照品溶液中延胡索乙素的峰面积为对照，按照公式Ckx=fs/k×Cs×Akx/As分别计算供试品溶液中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量；
式中Akx为供试品溶液中某待测成分的色谱峰面积，Ckx为供试品溶液中某待测成分的质量浓度，As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度，fs/k为待测成分对延胡索乙素的相对校正因子。
优选地，所述步骤（1）中色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，所述步骤（1）中检测波长为280nm。
优选地，所述步骤（1）中流动相B相为体积浓度为0.2%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0。
优选地，所述步骤（1）中流速为1.0mL/min。
优选地，所述步骤（1）中柱温为35℃。
优选地，所述步骤（4）中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素对于延胡索乙素的相对校正因子分别为1.25、4.17、3.69、0.96、1.76、1.31。
优选地，所述步骤（5）中确定各待测成分的色谱峰是根据原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素的保留时间，结合原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素与延胡索乙素的相对保留时间以及各个色谱峰的形状和峰高确定原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的峰位。
本发明相对现有技术具有以下有益效果：
（1）本发明采用高效液相色谱（HPLC）法，以混合对照溶液为对照，并以延胡索乙素为参照，同时测定了元胡止痛滴丸中7个主要成分原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素。该方法一测多评，利用成分间的相对校正因子实现多成分的测定，对中药多成分的质量进行控制，实现了元胡止痛滴丸的多指标质量评价。该方法操作简便、快捷，大幅度降低了检测成本和时间，提高了工作效率和方法的实用性，能够更有效、更全面、更准确地控制中药成品的质量，确保产品质量的稳定均一，从而达到保证产品服用安全有效的目的。
（2）本发明采用高效液相色谱（HPLC）法对元胡止痛滴丸中多指标成分的含量进行测定时，采用特定的色谱条件，即色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：254-300nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.1-1.0%的冰醋酸溶液，调冰醋酸溶液pH值为5.0，采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0-10min，20%-22%；10-30min，22%-30%；30-60min，30%-80%；60-65min，80%-100%；流速：0.5-1.0mL/min；柱温：20-40℃。该色谱条件是经过大量实践和实验并经过创造性劳动得到的，只有达到并严格控制该色谱条件才能实现元胡止痛滴丸的一测多评，才能保证准确测定各成分的含量，该色谱条件是实现一次就能测定元胡止痛滴丸中各成分含量的前提。
（3）本发明的测定结果通过外标法进行试验结果验证，结果表明，本发明的测定结果与外标法测定结果相似度极高，无显著性差异，是一种全新的且具有显著进步的测定元胡止痛滴丸中7个主要成分原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的方法。验证结果还表明，本发明对元胡止痛滴丸成品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性、重复性、准确性均较高，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，对中药质量监控和新药研发具有重要的推动作用，有很好的应用前景和使用价值。
（4）元胡止痛滴丸是国家医保甲类药品、国家中药保护品种，本发明的一测多评方法有效解决了现有测定方法难以全面反映元胡止痛滴丸质量的问题，对于元胡止痛滴丸的市场拓展、临床应用及其国际化进程具有重要意义。
附图说明
图1为混合对照品溶液的HPLC色谱图；
图2为元胡止痛滴丸供试品溶液的HPLC色谱图；
图3为元胡止痛滴丸（缺延胡索）阴性供试品的HPLC色谱图；
图4为元胡止痛滴丸（缺白芷）阴性供试品的HPLC色谱图；
上述图1至图4中，1为原阿片碱，2为黄藤素，3为去氢延胡索甲素，4为延胡索乙素，5为延胡索甲素，6为欧前胡素，7为异欧前胡素；
图5为原阿片碱的标准曲线；
图6为黄藤素的标准曲线；
图7为去氢延胡索甲素的标准曲线；
图8为延胡索乙素的标准曲线；
图9为延胡索甲素的标准曲线；
图10为欧前胡素的标准曲线；
图11为异欧前胡素的标准曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明内容，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实验：元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法
1.仪器、试剂和材料
仪器：Agilent1100型HPLC色谱仪，自动进样器，UV检测器，Agilent1100色谱工作站；AB204-N型电子天平；AutoscienceAS3120型超声仪。
试剂：乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；甲醇(分析纯，天津市凯信化学工业有限公司)；冰醋酸、三乙胺（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）。
材料：延胡索乙素（批号110726-201414）、原阿片碱（批号110853-201404）、欧前胡素（批号110726-201414）、异欧前胡素（批号110853-201404）均购自中国食品药品检定研究院；黄藤素（批号J140303）和去氢延胡索甲素（批号131220）购自上海融禾医药科技有限公司；延胡索甲素（批号MUST-1302010）购自成都曼思特生物科技有限公司；元胡止痛滴丸样品4批（批号：20131215、20140241、20140510、20141013），由甘肃陇神戎发制药有限公司提供。
2.色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.2%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0；采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0-10min，20%-22%；10-30min，22%-30%；30-60min，30%-80%；60-65min，80%-100%；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：280nm。
3.溶液制备
3.1混合对照品溶液的制备
取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得。
3.2供试品溶液的制备
取元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
3.3白芷阴性样品溶液的制备
按元胡止痛滴丸的制备工艺制成白芷阴性样品滴丸，再按供试品溶液的制备工艺制成白芷阴性样品溶液。
3.4延胡索阴性样品溶液的制备
按元胡止痛滴丸的制备工艺制成延胡索阴性样品滴丸，再按供试品溶液的制备工艺制成延胡索阴性样品溶液。
4.系统适用性实验
分别取“3”中制备的混合对照品溶液、供试品溶液、白芷阴性样品溶液、延胡索阴性样品溶液20μl，按上述的色谱条件进样测定，记录HPLC色谱图，如图1至图4所示。各成分色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性无干扰，理论塔板数按延胡索乙素色谱峰计算不低于7000。
5.方法学考察
5.1线性关系考察试验精密吸取“3.1”制备的混合对照品溶液，分别制成6个质量浓度的混合对照品溶液，按上述“2”中的色谱条件进行测定。记录相应的峰面积，以峰面积Y为纵坐标，浓度X（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线（如图5-图11所示）并进行线性回归。7个成分的回归方程和线性范围见表1。结果表明，原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素溶液的浓度均与峰面积呈良好的线性关系。
表1元胡止痛滴丸中7种指标成分的线性回归方程及线性范围
5.2精密度试验取批号为20131215的元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，按本发明的方法制备供试品溶液，按“2”中的色谱条件进行测定，连续进样6次，记录原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个化合物的色谱峰面积，并计其RSD（%）值，结果见表2。结果表明，上述7个化合物的色谱峰面积RSD均小于2%，仪器精密度良好。
表2精密度试验结果
5.3稳定性试验取“5.2”的供试品溶液置于密闭容器中，于室温下分别在0、3、6、9、12、24h按“2”中色谱条件取样检测，记录原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个化合物的色谱峰面积，并计算其RSD（%）值，结果见表3。结果表明，供试品溶液放置24h后，上述7个化合物的色谱峰面积RSD均小于3%，供试品溶液室温放置24h内稳定。
表3稳定性试验结果
5.4重复性试验取批号为20131215的元胡止痛滴丸细粉6份，每份1g，精密称定，按本发明的方法制备供试品溶液，分别按“2”中的色谱条件进行测定，记录原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个化合物的色谱峰面积，并计算6个化合物的含量，并计算其RSD（%）值，结果见表4。结果表明，上述7个化合物的含量RSD均小于3%，本发明的方法重现性良好。
表4重复性试验结果
5.5加样回收率试验取批号为20131215的元胡止痛滴丸细粉9份，每份0.5g，精密称定，分成三组，每组依次按样品中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个化合物的含量的80%、100%和120%加入相应的对照品，按本发明的方法制备供试品溶液，按“2”中色谱条件测定。记录原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个化合物的色谱峰面积，计算7个化合物的含量，并计算各化合物的加样回收率及RSD（%），结果见表5。结果表明，上述7个化合物的回收率均在95%-105%之间，RSD小于3%，本发明准确度良好。
表5加样回收率试验结果
6.相对校正因子的计算
分别精密吸取“3.1”中混合对照品溶液1、2、3、4、5、6μl，按“2”中色谱条件测定，每个样品进样2次，记录色谱峰面积，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分的相对校正因子，结果见表6。
表6各待测成分相对于延胡索乙素的校正因子
7、相对校正因子的耐用性考察
精密吸取“3.1”中混合对照品溶液，在不同仪器不同色谱柱分别进样10μl，按“2”中色谱条件平行测定2次。计算原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分相对于延胡索乙素的相对校正因子，结果见表7。结果表明，6个成分相对校正因子的RSD均小于3.0%，说明利用延胡索乙素为得到的其余6个成分的相对校正因子耐用性良好，可以适用于不同的仪器和色谱柱。
表7相对校正因子在不同品牌仪器和色谱柱中使用的耐用性考察
8.待测成分色谱峰的定位
精密吸取“3.1”中混合对照品溶液10μl，在不同仪器不同色谱柱上按“2”中色谱条件分别进样测定，记录各色谱峰的保留时间。计算原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分相对于延胡索乙素的的保留时间，结果见表8。结果表明，上述6个成分的相对保留时间波动较小，RSD均小于5％。相对保留时间的平均值分别为0.38、0.69、0.80、1.39、1.44、1.50，可作为定位的参考依据。最终本实验选择相对保留时间与各成分色谱峰峰型、峰高等特征相结合的方法进行各个成分色谱峰的定位。
表8不同品牌仪器和色谱柱的相对保留时间
9.本发明的一测多评法与外标法测定结果比较
分别精密吸取“3.1”中混合对照品溶液和“3.2”中供试品溶液各10μL，按“2”中色谱条件分别进样测定，记录原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个成分的色谱峰面积，分别用外标法和本发明的一测多评法计算其含量，结果见表9。
表9元胡止痛滴丸中7种成分的外标法和本发明一测多评法测定结果
为了进一步以确认一测多评法的准确性，对上述结果进行Pearson相关性分析。结果表明外标法和一测多评法的相关系数均大于0.9999，说明两种方法结果的相似性极高；同时经方差分析，其p值远大于0.05，说明二者的计算结果无显著性差异。综上，本发明的一测多评法可同时测定元胡止痛滴丸中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个成分的含量，可有效、全面地控制元胡止痛滴丸成药的质量。
实施例1
一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，该方法包括以下步骤：
（1）色谱条件：色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：280nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.2%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0；采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0min，20%；10min，22%；30min，30%；60min，80%；65min，100%；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。
（2）混合对照品溶液的制备：取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得。
（3）供试品溶液的制备：取批号为20131215的元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
（4）待测成分相对校正因子测定：以混合对照品溶液中延胡索乙素为参照，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算出原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分对延胡索乙素的相对校正因子；
式中As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度；Ak为混合对照品溶液中某单一待测成分的色谱峰面积，Ck为混合对照品溶液中某单一待测成分的质量浓度；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素对于延胡索乙素的相对校正因子分别为1.25、4.17、3.69、0.96、1.76、1.31。
（5）元胡止痛滴丸中7种成分的HPLC测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，并根据原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素的保留时间，结合原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素与延胡索乙素的相对保留时间，原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个成分相对保留时间值分别为0.399、0.707、0.803、1.00、1.341、1.356、1.434，再用各待测成分色谱峰与延胡索乙素色谱峰的相对保留时间结合各个色谱峰的形状及峰高确定原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的峰位，以混合对照品溶液中延胡索乙素的峰面积为对照，按照公式Ckx=fs/k×Cs×Akx/As分别计算供试品溶液中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量；
式中Akx为供试品溶液中某待测成分的色谱峰面积，Ckx为供试品溶液中某待测成分的质量浓度，As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度，fs/k为待测成分对延胡索乙素的相对校正因子；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量分别为0.222、0.117、0.938、0.505、0.518、0.283、0.083mg/g。
实施例2
一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，该方法包括以下步骤：
（1）色谱条件：色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：300nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为1.0%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0；采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0min，20%；10min，22%；30min，30%；60min，80%；65min，100%；流速：1.0mL/min；柱温：40℃。
（2）混合对照品溶液的制备：取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得。
（3）供试品溶液的制备：取批号为20131215的元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
（4）待测成分相对校正因子测定：以混合对照品溶液中延胡索乙素为参照，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算出原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分对延胡索乙素的相对校正因子；
式中As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度；Ak为混合对照品溶液中某单一待测成分的色谱峰面积，Ck为混合对照品溶液中某单一待测成分的质量浓度；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素对于延胡索乙素的相对校正因子分别为1.25、4.17、3.69、0.96、1.76、1.31。
（5）元胡止痛滴丸中7种成分的HPLC测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，并根据原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素的保留时间，结合原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素与延胡索乙素的相对保留时间，原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个成分相对保留时间值分别为0.366、0.663、0.774、1.000、1.338、1.347、1.431，再用各待测成分色谱峰与延胡索乙素色谱峰的相对保留时间结合各个色谱峰的形状及峰高确定原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的峰位，以混合对照品溶液中延胡索乙素的峰面积为对照，按照公式Ckx=fs/k×Cs×Akx/As分别计算供试品溶液中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量；
式中Akx为供试品溶液中某待测成分的色谱峰面积，Ckx为供试品溶液中某待测成分的质量浓度，As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度，fs/k为待测成分对延胡索乙素的相对校正因子；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量分别为0.216、0.115、0.922、0.514、0.519、0.290、0.083mg/g。
实施例3
一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，该方法包括以下步骤：
（1）色谱条件：色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：254nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.1%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0；采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0min，20%；10min，22%；30min，30%；60min，80%；65min，100%；流速：1.0mL/min；柱温：20℃。
（2）混合对照品溶液的制备：取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得。
（3）供试品溶液的制备：取批号为20131215的元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
（4）待测成分相对校正因子测定：以混合对照品溶液中延胡索乙素为参照，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算出原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分对延胡索乙素的相对校正因子；
式中As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度；Ak为混合对照品溶液中某单一待测成分的色谱峰面积，Ck为混合对照品溶液中某单一待测成分的质量浓度；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素对于延胡索乙素的相对校正因子分别为1.25、4.17、3.69、0.96、1.76、1.31。
（5）元胡止痛滴丸中7种成分的HPLC测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，并根据原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素的保留时间，结合原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素与延胡索乙素的相对保留时间，原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素7个成分相对保留时间值分别为0.399、0.707、0.803、1.00、1.341、1.356、1.434，再用各待测成分色谱峰与延胡索乙素色谱峰的相对保留时间结合各个色谱峰的形状及峰高确定原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的峰位，以混合对照品溶液中延胡索乙素的峰面积为对照，按照公式Ckx=fs/k×Cs×Akx/As分别计算供试品溶液中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量；
式中Akx为供试品溶液中某待测成分的色谱峰面积，Ckx为供试品溶液中某待测成分的质量浓度，As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度，fs/k为待测成分对延胡索乙素的相对校正因子；
原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量分别为0.218、0.115、0.931、0.518、0.510、0.294、0.085mg/g。

Claims (8)

1.一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：254-300nm；流动相：A相为乙腈，B相为体积浓度为0.1-1.0%的冰醋酸溶液，调冰醋酸溶液pH值为5.0，采用梯度洗脱，乙腈占流动相体积比为：0-10min，20%-22%；10-30min，22%-30%；30-60min，30%-80%；60-65min，80%-100%；流速：0.5-1.0mL/min；柱温：20-40℃；
（2）混合对照品溶液的制备：取原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每mL含原阿片碱20μg、黄藤素10μg、去氢延胡索甲素80μg、延胡索乙素40μg、延胡索甲素40μg、欧前胡素20μg、异欧前胡素10μg的混合溶液，摇匀，即得；
（3）供试品溶液的制备：取元胡止痛滴丸并研细，取元胡止痛滴丸细粉1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50ml，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量后摇匀、过滤；精密量取续滤液25ml，蒸至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
（4）待测成分相对校正因子测定：以混合对照品溶液中延胡索乙素为参照，按照相对校正因子计算公式fs/k＝（As×Ck）/（Ak×Cs）分别计算出原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素6个成分对延胡索乙素的相对校正因子；
式中As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度；Ak为混合对照品溶液中某单一待测成分的色谱峰面积，Ck为混合对照品溶液中某单一待测成分的质量浓度；
（5）元胡止痛滴丸中7种成分的HPLC测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定并确定各待测成分的色谱峰，以混合对照品溶液中延胡索乙素的峰面积为对照，按照公式Ckx=fs/k×Cs×Akx/As分别计算供试品溶液中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的含量；
式中Akx为供试品溶液中某待测成分的色谱峰面积，Ckx为供试品溶液中某待测成分的质量浓度，As为混合对照品溶液中延胡索乙素的色谱峰面积，Cs为混合对照品溶液中延胡索乙素的质量浓度，fs/k为待测成分对延胡索乙素的相对校正因子。
2.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中色谱柱为DiamonsilC18柱。
3.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中检测波长为280nm。
4.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中流动相B相为体积浓度为0.2%的冰醋酸溶液，采用三乙胺调节pH冰醋酸溶液为5.0。
5.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中流速为1.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中柱温为35℃。
7.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（4）中原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素对于延胡索乙素的相对校正因子分别为1.25、4.17、3.69、0.96、1.76、1.31。
8.根据权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸中多指标成分含量的HPLC测定方法，其特征在于：所述步骤（5）中确定各待测成分的色谱峰是根据原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素的保留时间，结合原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素、异欧前胡素与延胡索乙素的相对保留时间以及各个色谱峰的形状和峰高确定原阿片碱、黄藤素、去氢延胡索甲素、延胡索甲素、欧前胡素和异欧前胡素的峰位。
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