CN114088829A - 脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法及其应用 - Google Patents

脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明关于质谱分析技术与中药分析技术领域，尤其涉及一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法及其应用。本发明采用反相超高效液相色谱/质谱联用分析方法，通过采用三重四极杆‑线性离子阱质谱和离子淌度/四极杆‑飞行时间质谱两种质谱系统的靶向与非靶向数据采集策略，结合特定的质谱条件，可准确、快速地检测脱氢紫堇碱代谢物，并用于全面和精准的表征脱氢紫堇碱代谢物。

Description

脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法及其应用
技术领域
本发明关于质谱分析技术与中药分析技术领域，尤其涉及一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法及其应用。
背景技术
脱氢紫堇碱(DHC)又名去氢延胡索甲素，是从罂粟科紫堇属植物延胡索块茎中提取的一种季铵类生物碱，是延胡索的活性成分之一。近年来，体内外试验、动物实验以及临床试验证明，脱氢紫堇碱是一种具有多种生物活性的高效低毒单体，具有明显的扩张冠状动脉，抗缺氧作用，并能减少心肌缺氧复氧损伤，还具有抑制血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等作用。现代药代动力学表明，DHC在不同器官中的Cmax不同，炮制后Tmax会发生变化。因此，DHC代谢产物的准确、快速鉴定对于更进一步研究DHC的药理作用、药代动力学具有重要意义。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，采用本申请的检测方法可准确、快速地检测脱氢紫堇碱代谢物，并用于全面和精准的表征脱氢紫堇碱代谢物。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，用反相超高效液相色谱/质谱联用分析方法(UHPLC-MS)检测脱氢紫堇碱及其代谢产物；所述质谱为三重四极杆-线性离子阱质谱(QTRAP 4500)和离子淌度/四极杆-飞行时间质谱(Vion IMS-QTOF)；所述质谱的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下采集数据；
所述三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件包括：离子化电压：3500～5500V；源温度：450～550℃；去簇电压：60～120V；碰撞能量20～100eV；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行增强产物子离子扫描，阈值为100000、150000或200000；
所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件包括：离子源的毛细管电压：1.0k～1.5kV；锥孔电压：80～100V；斜坡碰撞能量在低质量端和高质量端分别为：10/30eV、30/50eV、50/70eV、70/90eV或90/110eV；
所述检测方法利用所述三重四极杆-线性离子阱质谱通过靶向扫描获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的一级质谱图和二级质谱图，再利用离子淌度/四极杆-飞行时间质谱通过靶向扫描和非靶向扫描结合数据处理获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的高分辨一级质谱图、二级质谱图和碰撞截面值(collision cross section,CCS)。
该检测方法是一种基于两种质谱系统的靶向与非靶向预测中药代谢产物分子质量和片段模式的分析策略。采用本申请的质谱采集方法，结合反相超高效液相色谱分离，可准确、快速地检测脱氢紫堇碱代谢物，并用于全面和精准的表征脱氢紫堇碱代谢物。
优选地，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件还包括：气帘气：35psi；喷雾气和辅助加热气：45psi；碰撞能量：50eV；碰撞能量扩展：10eV；碰撞气压为High；碰撞室出口电压为8.0V；线性离子阱扫描速率：4000amu/s。其中气帘气为氮气，喷雾气和辅助加热气为空气。
优选地，所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件还包括：源偏移：80V；脱溶剂气温度：500℃；源温度：120℃；去溶剂化气流(N2)：800L/h；锥孔气流(N2)：50L/h；以每次6eV的低能量扫描0.3秒(MS1)；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行增强产物子离子扫描，阈值：200。
优选地，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的离子化电压为5500V，源温度为550℃，去簇电压为80V，碰撞能量为40～60eV，阈值为100000。
优选地，所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的离子源的毛细管电压为1.0kV，锥孔电压为100V，斜坡碰撞能量为30/50eV，在低质量端为30eV，在高质量端为50eV。
优选地，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的扫描方法为多离子监测-信息依赖-增强型子离子(MI-IDA-EPI)扫描。
优选地，所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的扫描方法包括母离子列表-高分辨数据依赖性采集(PIL-HDDDA)和高分辨数据非依赖性采集(HDMSE)结合数据处理的非靶向扫描。
优选地，所述数据处理包括质量亏损过滤(MDF)、子离子过滤(PIF)和中性丢失过滤(NLF)。
优选地，所述反相超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：HSS C18 SB色谱柱；
流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003338256390000031
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：25～35℃。
优选地，所述色谱柱为HSS C18 SB色谱柱；柱温为30℃；流速为0.3mL/min。
以及，本发明还提供上述脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法在脱氢紫堇碱及其代谢产物表征与鉴定中的应用。以上方法能够鉴别出脱氢紫堇碱在不同生物样品中的代谢产物，可用于对其代谢产物的表征与鉴定。
本发明的有益效果在于：本发明提供的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法利用三重四极杆-线性离子阱质谱(QTRAP-MS/MS)多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描(MI-IDA-EPI)的靶向扫描方法获得样品中代谢物成分的保留时间，一级质谱图，二级质谱图；利用离子淌度/四极杆-飞行时间质谱(IM-QTOF-MS/MS)，分别使用包含母离子列表的高分辨数据依赖性采集(PIL-HDDDA)和数据非依赖性采集的高清MSE(HDMSE)非靶向扫描方法，结合数据采集后处理技术：质量亏损过滤(MDF)，子离子过滤(PIF)和中性丢失过滤(NLF)获得药物代谢物成分精确的高分辨一级质谱图、二级质谱图和碰撞截面值(CCS)。采用本申请的质谱采集方法，结合反相超高效液相色谱分离，可实现全面和精准的表征脱氢紫堇碱代谢物，且该检测方法具有获取包括保留时间、CCS、质荷比以及响应强度四维数据的巨大优势。同时，也可用离子淌度质谱构建数据库，进一步促进代谢物或化合物更加精确的结构鉴定。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1中脱氢紫堇碱的二级质谱图及其可能的裂解途径；
图2是本发明实施例1中脱氢紫堇碱与其中一种代谢物之间的二级质谱图比较；
图3是本发明实施例1中假设的脱氢紫堇碱在大鼠体内的主要代谢途径；
图4是本发明实施例2中血浆、胆汁、尿液和粪便中鉴定的代谢物的数量；
图5是本发明实施例2中每个生物样品中重叠代谢物的Venn图；
图6是本发明实施例2中血浆、胆汁、尿液和粪便中常见和特定的代谢物；
图7-1～图7-3是本发明对比例1中QTRAP 4500和Vion IMS-QTOF使用不同方法获得的大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便的总离子色谱图；
图8是本发明对比例2中5根反相色谱柱所得色谱图；
图9是本发明对比例3中QTRAP 4500中不同离子化电压、源温度和去簇电压对检测效果的影响；
图10是本发明对比例4中Vion IMS-QTOF中不同毛细管电压和锥孔电压对检测效果的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
脱氢紫堇碱在不同器官中的Cmax不同，延胡索经炮制后脱氢紫堇碱在不同器官的Tmax会发生变化。通过对脱氢紫堇碱在血液、胆汁、尿液和粪便中的代谢产物进行研究，可以对脱氢紫堇碱的药理作用、药代动力学进行深入研究。
靶向与非靶向表征策略相结合用于中药入血成分及其代谢物表征的研究甚少，大多文献的研究都基于非靶向表征策略。因此，需要开发更加强大的质谱数据分析策略来实现中药入血成分及其代谢物的精准表征与鉴定。
本发明实施例采用了两种质谱系统的靶向与非靶向预测中药代谢产物的分子质量和片段模式的分析策略，利用所述三重四极杆-线性离子阱质谱通过靶向扫描获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的一级质谱图与二级质谱图，利用离子淌度/四极杆-飞行时间质谱通过非靶向扫描和数据处理获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的高分辨一级质谱图，二级质谱图和碰撞截面值，结合反相超高效液相色谱分离，可准确、快速地检测脱氢紫堇碱及其代谢物，并用于全面和精准的表征脱氢紫堇碱及其代谢物。
其中，所述质谱为三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件包括：离子化电压：3500～5500V；源温度：450～550℃；去簇电压：60～120V；碰撞能量：20～100eV；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行增强产物子离子扫描，阈值：100000、150000或200000；
所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件包括：离子源的毛细管电压：1.0k～1.5kV；锥孔电压：80～100V；斜坡碰撞能量在低质量端和高质量端分别为：10/30eV、30/50eV、50/70eV、70/90eV或90/110eV。
三重四极杆-线性离子阱质谱兼具了传统四极杆和线性离子阱的双重功能，使得二者之间可以自由转换，既保留了串联四极杆多反应监测模式的选择性及灵敏度优势，同时还可实现线性离子阱增强二级碎片离子的扫描功能，大大提高了复杂基质中痕量化合物的定性定量能力。此外，其多反应监测模式(MRM)可通过相对分子质量和碎片质量的差异使色谱行为相似的物质得到完全分离，并可同时对多个待测化合物进行定量分析，极大地提高了分析效率，具有高选择性、高通量、高灵敏度的特点。离子淌度/四极杆-飞行时间高分辨质谱同时具有高分辨质谱与离子迁移谱的优点，离子淌度分离技术能够有效降低样品背景信号，降低共流出导致的待测物碎片离子的复杂程度，提高定性分析的准确性。对于短时间内无法进行色谱分离的同分异构体化合物，结合基于离子淌度技术的质谱分析法提供的与离子的电荷、大小、形状等相关的一种物理参数-碰撞截面值，可对其进行准确定量分析。本申请采用离子淌度质谱与色谱技术联用，可获取包括保留时间、碰撞截面值、质荷比和响应强度的四维数据。
结合上述实施例，质谱为三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件还包括：气帘气：35psi；喷雾气和辅助加热气：45psi；碰撞能量：50eV；碰撞能量扩展：10eV；碰撞气压为High；碰撞室出口电压为8.0V；线性离子阱扫描速率：4000amu/s。其中气帘气为氮气，喷雾气和辅助加热气为空气。
离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件还包括：源偏移：80V；脱溶剂气温度：500℃；源温度：120℃；去溶剂化气流(N2)：800L/h；锥孔气流(N2)：50L/h；以每次6eV的低能量扫描0.3秒(MS1)；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行二级扫描，阈值：200。
结合上述实施例，三重四极杆-线性离子阱质谱的离子化电压为5500V，源温度为550℃，去簇电压为80V，碰撞能量为40～60eV，阈值为100000；离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的离子源的毛细管电压为1.0kV，锥孔电压为100V，斜坡碰撞能量为30/50eV，在低质量端为30eV，在高质量端为50eV。
结合上述实施例，三重四极杆-线性离子阱质谱的扫描方法为多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描。三重四极杆-线性离子阱质谱多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描方法靶向获得样品中代谢成分的一级质谱图、二级质谱图，可精准表征目标组分，假阳性少，可显著提高对目标成分的覆盖率。
结合上述实施例，离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的扫描方法包括PIL-DDA和PIL-DIA的高清MSE非靶向扫描。DIA不依赖于一级质谱的离子丰度，在一定的质荷比窗口下，所有离子均被裂解并确定二级质谱，因此，可以获得覆盖范围广的完整代谢物信息。但DIA的数据解析需要进行母离子-子离子匹配，可能会引入假阳性结果。DDA方法根据一级质谱中的离子丰度排序，自动选择前N强离子逐个裂解，得到二级或多级质谱。DDA数据相对容易解析，但当面对非常复杂的化学基质时，其目标组分的覆盖范围可能会受到限制。二者结合可显著弥补对方的缺点，形成优势互补的策略。PIL-DDA依赖一级质谱的离子丰度来获得高质量的质谱信息，可改善共流出次级代谢物的表征；HDMSE不依赖于一级质谱的离子丰度获得高覆盖率的完整代谢物谱图信息。
结合上述实施例，数据处理包括MDF，PIF和NLF。结合数据采集后处理技术MDF，PLF与NLF可用于生成包含目标质量集合的母离子列表，可显著提高代谢物的覆盖率，从而获取精准而完整的代谢物信息。
本申请的质谱在使用时搭配电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下，在QTRAP 4500上采用MI-IDA-EPI扫描方法，Vion IMS-QTOF上分别开启HDDDA和HDMSE扫描方法，同时打开Precursor Ion Inclusion功能，包含根据文献报道以及根据代谢途径等预测的母离子列表(表1)。
表1脱氢紫堇碱代谢物成分数据依赖性采集的母离子列表
Figure BDA0003338256390000081
Figure BDA0003338256390000091
Figure BDA0003338256390000101
Figure BDA0003338256390000111
Figure BDA0003338256390000121
Figure BDA0003338256390000131
本申请实施例将两种质谱系统的靶向与非靶向表征策略相结合，使用QTRAP-MS/MS构建MI-IDA-EPI的靶向扫描方法，分别使用IM-QTOF-MS/MS的包含母离子列表的PIL-DDA和DIA的高清MSE(HDMSE)非靶向扫描方法，以及MDF、PIF和NLF数据采集后处理技术，并结合反相超高效液相色谱分离技术，可预测代谢物分子质量和片段模式，实现脱氢紫堇碱在不同生物样品中的多类别代谢物成分的鉴定与表征，通过离子强度、二级特征碎片质荷比、特征离子碎片等信息，综合分析两种模式采集的数据，进行更加全面且精准的代谢产物鉴定。
以下实施例所采用的试剂和药品：
乙腈(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲醇(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲酸(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)均为LC-MS级。去离子水经Milli-Q系统(Millipore,Bedford,MA,USA)纯化。其他试剂均为分析纯。脱氢紫堇碱对照品由天津中医药大学省部共建组分中药国家重点实验室延胡索干块茎制备而成，其结构经1H-NMR和13C-NMR鉴定。通过带光电二极管阵列检测器(PDA)的HPLC测定，该脱氢紫堇碱的纯度在95.0％以上。其他试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
实验动物：SPF级SD雄性大鼠，体重220g-250g，由北京维通利华公司提供，动物合格证号为1100112011021709。
以下实施例中所采用的分析仪器：
Waters Acquity UPLC I-Class色谱仪(Waters，USA)；QTRAP 4500三重四级杆-线性离子阱质谱仪(Applied Biosystems-SCIEX Scientific，Concord，Canada)；VionTM IMS-QTOF离子淌度/四级杆-飞行时间质谱仪(Waters Corporation，Manchester，UK)。
实施例1
本发明实施例提供了一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，用反相超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测脱氢紫堇碱及其代谢产物。
1、动物实验
实验前将所有大鼠置于SPF实验室，自由摄食、饮水，室温(25±2℃)，相对湿度40％～70％，保持自然明暗循环，适应性饲养7d，所有动物实验过程均符合实验动物伦理学要求。受试前将SD大鼠单独饲养于代谢笼中，自由摄食和饮水，采集空白血和空白尿液及粪便。给药前禁食12h，以100mg/kg的脱氢紫堇碱(混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠中)灌胃给药，分别于给药后15min，30min，1h，3h从眼眶后静脉丛取血0.5mL，置于肝素化离心管中，4000rpm/min于4℃离心10min，取分离出的血浆于聚丙烯离心管中，-80℃冰箱保存备用。在大鼠恢复7d后，再次灌胃给药，收集给药后0-8h、8-24h、24-48h、48-72h和72-96h尿液和粪便。尿液置于聚丙烯离心管中，4000rpm/min于4℃离心10min，取上清液转移至聚丙烯离心管中，-80℃冰箱保存备用。粪便标本置于通风柜中干燥，将干燥的粪便粉碎，在-80℃下保存在离心管中。所有大鼠恢复7d，实施胆管插管手术，收集空白胆汁样本。灌胃给药100mg/kg后，采集0-4h、4-8h、8-24h的胆汁样品，-80℃冰箱保存备用。
2、样品制备：
所有样品在室温下解冻，将每个时间点的血浆、胆汁、尿液和粪便(取样量分别为50μL、50μL、500μL、100mg)分别等量混合在聚丙烯试管中，分别加入三倍量的甲醇，含有血浆、胆汁、尿液的样品分别涡旋混匀3分钟，含有粪便的样品通过超声处理15分钟，分别得到血浆、胆汁、尿液和粪便的预处理样品。将血浆、胆汁、尿液和粪便的预处理样品分别以4000rpm/min、4℃离心10min以除去蛋白沉淀，再将上清液转移到另一个聚丙烯试管中并在N2流下吹干。用150μL甲醇复溶残留物并涡旋1分钟。将复溶物以14000rpm/min、4℃离心10min，取上清液2μL作为待测样品，用于UHPLC-MS分析。
3、UHPLC-MS的色谱条件具体如下：
色谱柱：HSS C18 SB(2.1×100mm，1.8μm)；
流动相：0.1％甲酸-水溶液(A)，乙腈(B)；
柱温：30℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：2μL；
进行线性梯度洗脱，该线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003338256390000151
质谱为QTRAP 4500和Vion TM IMS-QTOF；质谱的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下采集数据；
质谱条件为：
QTRAP 4500的操作参数如下：气帘气：35psi；喷雾气和辅助加热气：45psi；离子化电压：5500V；源温度：550℃；去簇电压：80V；碰撞能量：50eV；碰撞能量扩展：10eV；碰撞气压为High；碰撞室出口电压为8.0V；线性离子阱扫描速率：4000amu/s；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行增强产物子离子扫描，阈值为100000；
Vion IMS-QTOF的LockSpray离子源参数如下：毛细管电压：1.0kV；锥孔电压：100V；源偏移：80V；脱溶剂气温度：500℃；源温度：120℃；去溶剂化气流(N2)：800L/h；锥孔气流(N2)：50L/h；以每次6eV的低能量扫描0.3秒(MS1)，恒定斜坡碰撞能量在低质量端设置为30eV，在高质量端设置为50eV；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行二级扫描，阈值：200。母离子列表驱动的数据依赖性采集和数据非依赖性采集高清MSE非靶向扫描。
DDA扫描模式首先是一级扫描，接着是二级扫描。对于QTRAP质谱，当所选离子检测信号强度阈值大于100000时，会依次触发前三强母离子的EPI，而不受动态排除的影响。当QTOF质谱的TIC(总离子流色谱图)强度超过200个检测器计数时，在m/z 100-1500的质量范围内，以0.2s/次的扫描速度自动触发前三强母离子的二级碎裂。
QTRAP 4500采集的数据由Analyst 1.7.0软件(AB Sciex Scientific，Concord，Canada)分析，Vion IMS-QTOF采集的数据由Waters UNIFI软件(Waters，Milford，MA，USA)分析。
4、数据处理
HDDDA和HDMSE得到的原始数据经UNIFI软件校正，参考质量556.276575，质量偏差小于10ppm，信噪比阈值大于3。提取所有一级离子强度较大的峰，以大于1500.0计数，以二级离子强度大于600.0计数。手动分析处理后的HDDDA数据。此外，校正后的HDMSE数据通过软件智能代谢反应预测结合50mDa质量亏损过滤(MDF)进行处理，以追踪所有可能的代谢物。软件通过搜索自建的DHC标准数据库，自动识别原型组分，并将通过MDF的化合物的二级特征碎片的质荷比与原型组分进行匹配。UNIFI自动筛选化合物是否通过MDF、PIF和NLF。通过MI-IDA-EPI获得的原始数据由Analyst软件处理并手动分析。
5、脱氢紫堇碱代谢物的表征与比较
如图1，高分辨Vion IMS-QTOF检测到的二级质谱图显示，DHC的特征片段为350.138[M-CH4]+、334.106[M-C2H8]+、322.143[M-CH4-CO]+、318.112[M-C2H8O]+及306.111[M-C2H8-CO]+，如图2所示。以M40(m/z558.1972)为例，其理论分子式为C28H32NO11，给药后在胆汁中检出，二级质谱图显示在m/z 382.1641处丢失了176Da，说明中性分子离子丢失了一个C6H8O6分子，此外，检测出一系列与DHC相差16Da特征碎片(m/z382.1641→366.1694和m/z366.133→350.138)(图3)，推断M40是DHC的氧化和葡萄糖醛酸化代谢物。
本研究发现Ⅰ相代谢反应可以发生多次，如双脱甲基反应代谢物(M6、M7和M8)、三种脱甲基反应代谢物(M1、M2和M3)、双氧化代谢物(M22、M23和M24)，与DHC相比，准分子离子峰显示出-28Da、-32Da和+32Da的质量位移。还鉴定出了不同类型Ⅰ相代谢反应共存的代谢物，如去甲基化反应和双氧化反应的代谢物(M20和M21)、去甲基化反应和脱氢反应的代谢物(M10)、三种去甲基化反应和氧化反应的代谢物(M9)，三次去甲基化和双重氧化反应的代谢物(M15)，双重去甲基化和双重氧化反应的代谢物(M16和M17)，双重去甲基化和脱氢反应的代谢物(M4和M5)。Ⅱ相代谢反应发生在去甲基化反应或氧化反应之后，MS2具有[M-SO3]+和[M-C6H8O6]+质谱特征碎片，分别为中性丢失80Da和176Da。
虽然多个代谢物表现出相似的代谢途径，但原型代谢位置可能不同。CCS和保留时间在区分代谢物的同分异构体方面起着关键作用。本申请提出了DHC在大鼠体内的代谢途径，如图3所示。结果表明，甲氧基和母核上的5、6和8位是主要的代谢部位。此外，DHC还经历了去甲基化和氧化代谢，之后进一步进行了葡萄糖醛酸结合和硫酸结合的生物转化。
实施例2
本发明实施例提供了实施例1的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法在不同生物样品中脱氢紫堇碱代谢物的表征与鉴定中的应用。
按实施例1的检测方法对不同生物样品中脱氢紫堇碱代谢物进行检测，如图4所示，分别在胆汁、粪便、血浆和尿液中鉴定出30、16、7、18种代谢物。通过匹配不同生物样品的质荷比和保留时间进行峰识别，发现存在许多重叠的代谢物。绘制维恩图以可视化来自四个生物样品的重叠代谢物，在胆汁中检测到的特异性代谢物种类最多，血浆中检测到的特异性代谢物种类很少(图5)。四种生物样品中有两种常见的代谢物(M14和M16)，在两种或三种生物样本中有18个重叠的代谢产物，仅在一个生物样本中出现的有20种特异性代谢物，表明四种生物样品之间存在显著差异(图6)。研究表明，原型脱氢紫堇碱会迅速从血液中清除，并通过大鼠的胆汁排泄，导致体内血液浓度降低。
对比例1
本对比例列举了不同分析方法对脱氢紫堇碱及其代谢产物检测的影响：
采用两种仪器(QTRAP 4500和Vion IMS-QTOF)和三种方法(MI-IDA-EPI包含PIL、HDDDA包含PIL、HDMSE包含MDF)来鉴定和表征DHC在不同生物样品中的代谢物。在MI-IDA-EPI和HDDDA实验中，使用数据依赖性的MS/MS采集方法获取质谱数据。由于MS扫描速度的限制，IDA和DDA模式不可避免地会遗漏PIL的一些二级碎片，并且由于PIL的限制，无法检测到母离子质量不在预测列表中的代谢物。例如，在同一仪器上，与HDMSE相比，HDDDA漏掉了M4、M25和M9。结果显示，包含MDF的HDMSE数据非依赖性采集方法可以弥补这些缺陷，该方法可快速采集数据，而不需要预先确定母药的MS/MS模式或在数据采集前预测潜在代谢物的质荷比。采用MDF技术对HDMSE数据进行后处理，结合碎片过滤技术(NLF和PIF)检测DHC的代谢产物，可实现对代谢物的全面准确的识别。图7-1～图7-3显示了不同质谱仪和方法收集的总离子流色谱图。
对比例2
本对比例列举了不同色谱柱对脱氢紫堇碱及其代谢产物检测的影响：本实验选择了5根2μm色谱柱，分别为：BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)、Kinetex EVO C18(2.1×100mm，1.7μm)、HSS C18 SB(2.1×100mm，1.8μm)、Zorbax Extend C18(2.1×100mm，1.8μm)和CSHPhenyl-Hexyl(2.1×100mm，1.7μm)。
制备DHC标准品溶液：精密称取脱氢紫堇碱1mg，转移至10mL的容量瓶中，用纯甲醇定容，得到浓度为100μg/mL的母液，稀释获得浓度为100ng/mL的脱氢紫堇碱溶液。使用如下洗脱梯度：0-5min，30％-60％B；5-8min，60％-95％B；8-12min，95％B；12-12.5min，95％-30％B；12.5-15min，30％B。在SIM模式下，通过比较脱氢紫堇碱(m/z 366.1700)的响应值和保留效果可见，HSS C18 SB(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱为最佳色谱柱。如图8所示。
对比例3
本对比例比较了QTRAP 4500中不同离子化电压(3500～5500V)、源温度(450～550℃)和去簇电压(60～140V)对检测效果的影响：如图9所示，在QTRAP 4500上，离子化电压和源温度分别在5500V和550℃时，DHC的峰面积最大。当DP过低(60V)时，溶剂分子的吸附导致离子聚集。当DP过高(100-140V)时，离子发生源内裂解(CID)，80V的去簇电压有效促进了DHC的去溶剂化转化。
对比例4
本对比例考察了Vion IMS-QTOF中不同毛细管电压(1000-3000V)和锥孔电压(20-100V)对检测效果的影响：在喷雾针施加的毛细管电压使样品和流动相喷雾形成的小液滴带电，因此毛细管电压值大小影响DHC的离子响应强度和峰面积。如图10所示，毛细管电压在3000V处DHC峰面积急剧下降，锥孔电压在40V后DHC峰面积上升。经过优化，流速为0.3mL/min时，毛细管电压在1000V时样品离子化程度高，锥孔电压在40V时平均峰面积最大。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，用反相超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测脱氢紫堇碱及其代谢产物；
所述质谱为三重四极杆-线性离子阱质谱和离子淌度/四极杆-飞行时间质谱；所述质谱的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下采集数据；
所述三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件包括：离子化电压：3500～5500V；源温度：450～550℃；去簇电压：60～120V；碰撞能量：20～100eV；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行增强产物子离子扫描，阈值：100000、150000或200000；
所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件包括：离子源的毛细管电压：1.0k～1.5kV；锥孔电压：80～100V；斜坡碰撞能量在低质量端和高质量端分别为：10/30eV、30/50eV、50/70eV、70/90eV或90/110eV；
所述检测方法利用所述三重四极杆-线性离子阱质谱通过靶向扫描获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的一级质谱图和二级质谱图，再利用离子淌度/四极杆-飞行时间质谱通过靶向扫描和非靶向扫描结合数据处理获得脱氢紫堇碱及其代谢产物的高分辨一级质谱图、二级质谱图和碰撞截面值。
2.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的质谱条件还包括：气帘气：35psi；喷雾气和辅助加热气：45psi；碰撞能量：50eV；碰撞能量扩展：10eV；碰撞气压为High；碰撞室出口电压为8.0V；线性离子阱扫描速率：4000amu/s。
3.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的质谱条件还包括：源偏移：80V；脱溶剂气温度：500℃；源温度：120℃；去溶剂化气流速：800L/h；锥孔气流速：50L/h；以每次6eV的低能量扫描0.3秒；数据依赖采集多组分共流出时指定触发前3强的离子执行二级扫描，阈值：200。
4.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的离子化电压为5500V，源温度为550℃，去簇电压为80V，碰撞能量为40～60eV，阈值为100000；和/或
所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的离子源的毛细管电压为1.0kV，锥孔电压为100V，斜坡碰撞能量为30/50eV，在低质量端为30eV，在高质量端为50eV。
5.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述三重四极杆-线性离子阱质谱的扫描方法为多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描。
6.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述离子淌度/四极杆-飞行时间质谱的扫描方法包括母离子列表-高分辨数据依赖性采集和高分辨数据非依赖性采集结合数据处理的非靶向扫描。
7.根据权利要求1所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述数据处理包括质量亏损过滤、子离子过滤和中性丢失过滤。
8.根据权利要求1～7任一项所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述反相超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：HSS C18 SB色谱柱；
流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0003338256380000021
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：25～35℃。
9.根据权利要求8所述的脱氢紫堇碱及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为HSS C18 SB色谱柱；和/或
所述柱温为30℃；和/或
所述流速为0.3mL/min。
10.权利要求1～9任一项所述的检测方法在脱氢紫堇碱体内代谢产物鉴定中的应用。
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