CN105466803A - 一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，水稻(Oryza？sativa？L.)是全世界主要的农作物之一，淀粉是稻米的主要成份，其特性决定着稻米的品质和用途。淀粉特性主要包括形态结构、分子结构、晶体结构、糊化特性、水解特性和消化特性等。其中膨胀势和水溶性是淀粉糊化特性的一个重要指标，也是反应水稻品质的一个重要参数。水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，主要包括淀粉分离、称量、水浴糊化、冷却吸取上清、沉淀称重和上清测定、公式换算等步骤。该方法的优点是操作简单、快速、成本低廉、重复性好，从而为研究水稻淀粉的热力学特性乃至水稻品质特性提供了技术支持，对水稻的加工和应用具有重要的意义。

Description

一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法

技术领域

本发明具体涉及一种水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法。

背景技术

水稻(OryzasativaL.)是世界三大粮食作物之一，也是我国最主要的粮食作物，播种面积占粮食播种面积的1/5，年产量约4.8亿吨，占世界粮食总产量的1/4，全世界三分之一以上的人口以水稻为主食。随着人们生活水平的提高和稻米消费结构的变化，对于稻米品质的要求越来越高。培育优质、高产、多抗的稻米品种是当前的首要任务。

淀粉是水稻主要的能量贮藏物质，在水稻的生长发育中起重要的作用，其特性决定着稻米的品质和用途。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的半晶体颗粒物质，在植物细胞淀粉体内合成和积累。淀粉特性主要包括形态结构、分子结构、晶体结构、糊化特性、水解特性和消化特性等。淀粉颗粒不溶于冷水，但是当淀粉在水中加热，淀粉颗粒吸水膨胀、晶体结构被破坏，一些可溶性的淀粉溶解在水中，这就是淀粉的糊化。糊化特性是反映淀粉品质的重要指标之一，这一特性在食品工业中被广泛利用。膨胀势和水溶性是水稻淀粉的重要糊化特性指标之一，颗粒膨胀和水吸收能力可以衡量在淀粉糊化中膨胀势和淀粉溶解的程度。目前采取的都是烘干法，烘干法必须要样品量要多，量少则会导致可溶性结果不准确，也会影响膨胀势的结果，量多则会在吸取上清的过程中残留较多的上清液，对烘干器皿的要求也比较高，称重过程中则没有办法使用精细天平。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，以获得精准结果，从而为进一步研究米质糊化特性乃至品质提供参考。本法采用浓硫酸-蒽酮法测定可溶性部分，结果重复性好、方便快捷以及最主要的用量少。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，其包括如下步骤：

(1)水稻淀粉粒的分离纯化：将水稻糙米中水中浸泡后磨碎，过滤出滤液，将滤液过筛后反复离心去除表面褐色杂质，之后获得沉淀，对沉淀物进行脱脂和脱蛋白处理，再经过洗涤、脱水后干燥、研磨，得到淀粉粉末；

(2)称重：称取空白离心管的重量，得出质量W1，向该离心管中加入10～100mg淀粉粉末并称重，得出质量W2；

(3)水浴糊化：向离心管中加水后混匀，在指定温度下进行水浴，在水浴过程中反复颠倒离心管；

(4)冷却吸取上清：水浴结束后冷却，将离心管离心，吸取上清液；

(5)沉淀称重：对取完上清液的沉淀和离心管称重，得出质量W3；

(6)上清可溶性淀粉质量测定：采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，使用分光光度计测量不同浓度标准液葡萄糖含量并绘制标准曲线，使用分光光度计和标准曲线测量并得出步骤(4)的上清液的浓度，计算溶解淀粉质量W4，

W4＝C*V*0.9/10⁶(g)，

其中C为根据标准曲线得出待测样品的浓度μg/mL，V为待测样品体积mL，0.9为糖转换为淀粉的系数,10⁶从μg到g转换系数；

(7)计算膨胀势和可溶性：根据上述数据计算膨胀势和可溶性，其中

膨胀势＝(W3-W1)/(W2-W1-W4)，

可溶性＝W4/(W2-W1)。

在步骤(1)中，一种优选方案为过滤出的滤液分别过100、200、400目筛，将滤液离心(如在3000g离心5min)，获得沉淀物，沉淀物用双蒸水悬浮，再次离心(如在3000g离心5min)，再次获得沉淀物；沉淀物经过反复的悬浮和离心直到离心后的上清液无杂质，得到离心后的沉淀物。

在步骤(1)中，可按现有的脱脂方法进行，本申请中一种优选的脱脂操作为：向离心后的沉淀物中加入搅拌子，并加入由甲醇和丙酮组成的抽提液，充分搅拌(于45℃搅拌30min)，离心(5000g离心10min)，去上清液后重复加入抽提液I并搅拌和离心的脱脂步骤2次。

在步骤(1)中，按现有的脱蛋白方法进行，本申请中一种优选的脱蛋白操作为：脱脂后的沉淀物中加入SDS-buffer，充分搅拌(40℃搅拌30min)，离心(5000g离心10min)，去上清后重复加入SDS-buffer并搅拌和离心的脱蛋白步骤4次；

在步骤(1)中，一种优选的洗涤脱水干燥研磨步骤为：脱蛋白后的沉淀物加入蒸馏水搅拌5min，5000g离心10min，去上清，重复水洗多次；然后用无水乙醇脱水，于40℃干燥2d，研磨成淀粉粉末，过100目筛，-20℃保存备用。

在步骤(1)中，一种优选的无水乙醇脱水的步骤为：淀粉浸没于无水乙醇中并搅拌均匀静置2h以上，然后于5000g离心10min，倒去上清。

在步骤(2)中，向离心管中加入的淀粉粉末的质量优选为20～50mg，进一步为25～35mg，以30mg为最佳。

在步骤(3)中，水浴指定温度可在50℃～95℃范围内任意确定，水浴时间为30min。在水浴过程中需要充分混匀，例如于第1分钟上下颠倒10次，以后在第1.5、2、3、4、5、7.5、10、15、25分钟颠倒两次。

在步骤(4)中，一种优选操作为：水浴结束后室温冷却，去除离心管管壁水滴，冷却过程中将离心管上下颠倒多次，将冷却好的离心管离心(于8000g离心20min)，吸取上清液；取完上清液的沉淀进一步离心(于8000g离心20min)，继续吸取上清液。

在于在步骤(6)中，采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，将葡萄糖标样80℃烘干8小时，称取100mg葡萄糖加水定容到100mL容量瓶中作为母液；再分别配置10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL标准液；然后取2.5mL待测液于试管中加入6.5mL蒽酮试剂，混匀仪摇匀三次，室温避光冷却一小时于OD620nm波长处测定结果，空白为双蒸水；两次重复之后得出不同浓度下的OD值，在Excel中绘制标准曲线。

在步骤(6)中，在测定不同的水浴指定温度下的溶解淀粉质量时，需要提前做一次该水浴指定温度下的预实验；在测定溶解淀粉质量时，将待测液稀释到适合分光光度计的度数范围(OD值为0.2-0.5之间适宜)。

本发明进一步提供了一种具体的快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，其包括如下步骤：

(1)水稻淀粉粒的分离纯化：

①粉碎：糙米在水中室温浸泡过夜，在研钵中磨碎，将匀浆液装入4层纱布袋，用挤压法压出滤液；

②过筛：将滤液分别过100、200、400目筛，未能过筛部分的则剔除；

③离心：将滤液在3000g，离心5min，获得沉淀。沉淀用双蒸水悬浮，3000g，离心5min，再次获得沉淀。沉淀再悬浮、离心，反复几次，直到离心后上清液无杂质。

④脱脂：在沉淀中加入加入搅拌子，加抽提液I(甲醇：丙酮＝1：1)，45℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清，重复两次。

⑤脱蛋白：加入SDS-buffer，40度搅拌30min，5000g离心10min，去上清，重复四次。

⑥水洗：加入蒸馏水搅拌5min，5000g离心10min，去上清，重复三次；

⑦收集：用无水乙醇脱水2次，脱水过程为：淀粉需浸没于无水乙醇中并搅拌均匀静置2h以上，然后5000g离心10min，倒去上清。脱水后于40℃干燥2d，研磨成淀粉粉末，过100目筛，-20℃保存备用。

(2)称重：

①2mL离心管称重：将2mL离心管放置于万分之一天平上，得出质量W1(g)(针对一些质量一般的天平，取一个空白离心管作为标准管，得出质量，接下来称重其他东西前要先称量标准管的质量，一致才可继续)；

②淀粉称重：用称量勺称量大约30mg淀粉于2mL离心管中，得出质量W2(g)；

(3)水浴糊化：

①加水：在2mL离心管中加入1.5mL双蒸水；

②混匀：将离心管上下颠倒，将悬液充分混匀(部分水稻淀粉不容易颠倒混匀的可以用中指击打离心管底部)；

③水浴：在特定温度下水浴(通常从50℃到95℃每隔5℃做一次)半小时，期间第一分钟上下颠倒10次，以后在1.5、2、3、4、5、7.5、10、15、25分钟颠倒两次(其中在高温水浴时候前期要将离心管的盖子打开，防止温度一下子过高，离心管盖子崩开)。水浴糊化过程中，每个样品摇匀手法一致，保证样品的重复性和不同时间测定的对比性。

(4)冷却吸取上清：

①冷却：水浴结束之后室温冷却，用吸水纸吸干离心管管壁水滴，冷却半小时，期间将离心管上下颠倒几次；

②离心：将冷却好的离心管8000g离心20min；

③吸取上清：按照顺序挨个从离心机中吸取上清，离心结束之后，离心管之包含两部分，沉淀和上清，之间有一层斜的胶面，沿着斜面往上先用1mL枪头后用20μL枪头吸取上清于10mL容量瓶中，枪头在容量瓶中吹打多次。吸取上清过程中，“先大后小”原则，先大枪头后用小枪头，少量多次，但是不可触碰到沉淀。

④重复步骤②、③一次；

(5)沉淀称重：取完上清的沉淀和离心管称重，得出质量W3(g)(称重前要先称量标准管的质量，没有误差方可使用)；

(6)上清可溶性淀粉质量测定：

①标准曲线制作：采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，蒽酮试剂(0.2g蒽酮溶解于100mL浓硫酸中，现配现用)。葡萄糖标样80℃烘干8小时，称取100mg葡萄糖(粉末)加水定容到100mL容量瓶中作为母液(1mg/mL)。分别配置10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL标准液(分别从母液中移取250μL，500μL，750μL，1000μL，1250μL，1500μL定容于25mL容量瓶)。取2.5mL待测液于试管中加入6.5mL蒽酮试剂(注意垂直加入，并且吹打三次，保持手法一致)，混匀仪摇匀三次，室温避光冷却一小时于OD620nm波长处测定结果，空白为双蒸水。两次重复之后得出不同浓度下的OD值，在Excel中绘制标准曲线。

②预实验：不同温度下的可溶性差别很大，所以每一个温度下都需要提前做一下预实验，根据要求将待测液稀释到适合分光光度计的度数范围(OD值为0.2-0.5之间适宜)。

③溶解淀粉质量：W4＝C*V*0.9/10⁶(g)

其中C为根据标准曲线得出待测样品的浓度μg/mL，V为待测样品体积mL，0.9为糖转换为淀粉的系数,10⁶从μg到g转换系数。

(7)公式换算：膨胀势＝(W3-W1)/(W2-W1-W4)

可溶性＝W4/(W2-W1)。

与现有的淀粉膨胀势和可溶性方法相比较而言，本发明的优势在于：

本发明提供了一种微量测定淀粉膨胀势和可溶性的方法。它规范了在水浴糊化过程中摇晃时间以及次数，保证实验的可重复性。采用蒽酮法测定可溶性淀粉的质量，规范了蒽酮法的详细步骤，对于测定微量实验实现了可重复性。其测定成本低廉，适合用于科研实验。为研究水稻淀粉的热力学特性乃至水稻品质特性提供了技术支持，对水稻的加工和应用具有重要的意义。

附图说明

图1为一种水稻淀粉分离纯化过程示意图；

图2为葡萄糖标准曲线；

图3为水稻淀粉(南粳0212)在不同温度下的膨胀势和可溶性曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明。

实施例1“南粳0212”水稻淀粉膨胀势与可溶性微量测定。

(1)“南粳0212”水稻淀粉粒的分离纯化(流程图见图1)：

①粉碎：“南粳0212”糙米在水中室温浸泡过夜，于家用压榨机中磨碎，将匀浆液装入4层纱布袋，用挤压法压出滤液；

②过筛：将滤液分别过100、200、400目筛，未能过筛部分的则剔除；

③离心：将滤液在3000g，离心5min，获得沉淀。沉淀用双蒸水悬浮，3000g，离心5min，再次获得沉淀。沉淀再悬浮、离心，反复几次，直到离心后上清液无杂质。

④脱脂：在沉淀中加入加入搅拌子，加入抽提液I(三氯甲烷:甲醇＝1:1)，45℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清。加抽提液II(甲醇：丙酮＝1：1)，45℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清，重复两次。

⑤脱蛋白：加入SDS-buffer，40℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清，重复四次。

⑥水洗：加入蒸馏水搅拌5min，5000g离心10min，去上清，重复三次；

⑦收集：用无水乙醇洗2次，40℃干燥2d，研磨成淀粉粉末，过100目筛，-20℃保存备用。

(2)称重：

①2mL离心管称重：将2mL离心管放置于万分之一天平上，得出质量W1(针对一些质量一般的天平，取一个空白离心管作为标准管，得出质量，接下来称重其他东西前要先称量标准管的质量，一致才可继续)；

②淀粉称重：用称量勺称量大约30mg“南粳0212”淀粉于2mL离心管中，得出质量W2；

(3)水浴糊化：

①加水：在2mL离心管中加入1.5mL双蒸水；

②混匀：将离心管上下颠倒，将悬液充分混匀(部分水稻淀粉不容易颠倒混匀的可以用中指击打离心管底部)；

③水浴：在特定温度下水浴(通常从50℃到95℃每隔5℃做一次)半小时，期间第一分钟上下颠倒10次，以后在1.5、2、3、4、5、7.5、10、15、25分钟颠倒两次(其中在高温水浴时候前期要将离心管的盖子打开，防止温度一下子过高，离心管盖子崩开)。

(4)冷却吸取上清：

①冷却：水浴结束之后室温冷却，用吸水纸吸干离心管管壁水滴，冷却半小时，期间将离心管上下颠倒几次；

②离心：将冷却好的离心管8000g离心20min；

③吸取上清：按照顺序挨个从离心机中吸取上清，离心结束之后，离心管之包含两部分，沉淀和上清，之间有一层斜的胶面，沿着斜面往上先用1mL枪头后用20μL枪头吸取上清于10mL容量瓶中，枪头在容量瓶中吹打多次；

④重复步骤②、③一次；

(5)沉淀称重：取完上清的沉淀和离心管称重，得出质量W3(称重前要先称量标准管的质量，没有误差方可使用)；

(6)上清可溶性淀粉质量测定：

①标准曲线制作：采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，蒽酮试剂(0.2g蒽酮溶解于100mL浓硫酸中，现配现用)。葡萄糖标样80℃烘干8小时，称取100mg葡萄糖(粉末)加水定容到100mL容量瓶中作为母液(1mg/mL)。分别配置10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL标准液(分别从母液中移取250μL，500μL，750μL，1000μL，1250μL，1500μL定容于25mL容量瓶)。取2.5mL待测液于试管中加入6.5mL蒽酮试剂(注意垂直加入，并且吹打三次，保持手法一致)，混匀仪摇匀三次，室温避光冷却一小时于OD620nm波长处测定结果，空白为双蒸水。两次重复之后得出不同浓度下的OD值，在Excel中绘制标准曲线。标准曲线为y＝88.411x-4797(R²＝0.997)，

②预实验：不同温度下的可溶性差别很大，所以每一个温度下都需要提前做一下预实验，根据要求将待测液稀释到适合分光光度计的度数范围(OD值为0.2-0.5之间适宜)。

③溶解淀粉质量：W4＝C*V*0.9/10⁶(g)

其中C为根据标准曲线得出待测样品的浓度μg/mL，V为待测样品体积mL，0.9为糖转换为淀粉的系数,10⁶从μg到g转换系数。

(7)公式换算：膨胀势＝(W3-W1)/(W2-W1-W4)

可溶性＝W4/(W2-W1)。

为了进一步说明结果良好的重复性以及整个计算的详细过程，表1和表2分别提供了用硫酸蒽酮法测得的溶解淀粉质量以及膨胀势和可溶性的测得数据。在表1中，一般从10mL容量瓶中稀释5倍或者10倍，稀释的程度就需要我们做一个预实验，观察其OD620值的范围(0.2-0.5之间最适宜)，确定稀释倍数之后就可以正式进行实验，测得OD620值根据标准曲线换算为浓度，根据公式W4＝C*V*0.9/10⁶(g)得出溶解淀粉质量。从表1中我们可以发现在不同时间段做出来的三次OD值重复误差很小，说明该方法具有稳定的重复性。表2为计算膨胀势和可溶性的各项中间数据，为参考利用该方法提供便利。从表3中可以看出，随着糊化温度的增加，“南粳0212”水稻淀粉膨胀势和可溶性也随着增加，采用本方法之后，其标准偏差(SD值)很小，说明其重复性好。“南粳0212”水稻淀粉膨胀势范围从2.32-23.94g/g，可溶性从2.21-12.02％。将结果做成趋势图，我们发现“南粳0212”水稻淀粉膨胀势从65℃开始急剧上升，可溶性从65℃开始明显上升。从图中也可以发现其偏差很小，说明用本发明的方法测定的膨胀势与可溶性误差小。水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，主要包括淀粉分离、称量、水浴糊化、冷却吸取上清、沉淀称重和上清测定、公式换算等步骤。该方法的优点是操作简单、快速、成本低廉、重复性好，从而为研究水稻淀粉的热力学特性乃至水稻品质特性提供了技术支持，对水稻的加工和应用具有重要的意义。

表1：“南粳0212”淀粉不同温度下溶解淀粉质量计算明细。

表2：“南粳0212”淀粉膨胀势和可溶性各中间数据。

表3：水稻(南粳0212)淀粉在不同温度下的膨胀势和可溶性结果

相同列中数据(平均值±标准差)后不同字母表示显著性差异(p<0.05,n＝3).

Claims (10)

1.一种快速、高效、稳定水稻淀粉膨胀势和可溶性微量测定方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)水稻淀粉粒的分离纯化：将水稻糙米中水中浸泡后磨碎，过滤出滤液，将滤液过筛后反复离心去除表面褐色杂质，之后获得沉淀，对沉淀物进行脱脂和脱蛋白处理，再经过洗涤、脱水后干燥、研磨，得到淀粉粉末；

(2)称重：称取空白离心管的重量，得出质量W1，向该离心管中加入10～100mg淀粉粉末并称重，得出质量W2；

(3)水浴糊化：向离心管中加水后混匀，在指定温度下进行水浴，在水浴过程中反复颠倒离心管；

(4)冷却吸取上清：水浴结束后冷却，将离心管离心，吸取上清液；

(5)沉淀称重：对取完上清液的沉淀和离心管称重，得出质量W3；

(6)上清可溶性淀粉质量测定：采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，使用分光光度计测量不同浓度标准液葡萄糖含量并绘制标准曲线，使用分光光度计和标准曲线测量并得出步骤(4)的上清液的浓度，计算溶解淀粉质量W4，

W4＝C*V*0.9/10⁶(g)，

其中C为根据标准曲线得出待测样品的浓度μg/mL，V为待测样品体积mL，0.9为糖转换为淀粉的系数,10⁶从μg到g转换系数；

(7)计算膨胀势和可溶性：根据上述数据计算膨胀势和可溶性，其中

膨胀势＝(W3-W1)/(W2-W1-W4)，

可溶性＝W4/(W2-W1)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，过滤出的滤液分别过100、200、400目筛，将滤液在3000g离心5min，获得沉淀物，沉淀物用双蒸水悬浮，再次在3000g离心5min，再次获得沉淀物；沉淀物经过反复的悬浮和离心直到离心后的上清液无杂质，得到离心后的沉淀物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，脱脂操作为：向离心后的沉淀物中加入搅拌子，并加入由甲醇和丙酮组成的抽提液I，于45℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清液后重复加入抽提液I并搅拌和离心的脱脂步骤两次。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，脱蛋白操作为：脱脂后的沉淀物中加入SDS-buffer，40℃搅拌30min，5000g离心10min，去上清后重复加入SDS-buffer并搅拌和离心的脱蛋白步骤四次。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，脱蛋白后的沉淀物加入蒸馏水搅拌5min，5000g离心10min，去上清，重复水洗多次；然后用无水乙醇脱水，于40℃干燥2d，研磨成淀粉粉末，过100目筛，-20℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，无水乙醇脱水的步骤为：淀粉浸没于无水乙醇中并搅拌均匀静置2h以上，然后于5000g离心10min，倒去上清。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(3)中，水浴指定温度为50℃～95℃，在水浴过程中于第1分钟上下颠倒10次，以后在第1.5、2、3、4、5、7.5、10、15、25分钟颠倒两次。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(4)中，水浴结束后室温冷却，去除离心管管壁水滴，冷却过程中将离心管上下颠倒多次，将冷却好的离心管于8000g离心20min，吸取上清液；取完上清液的沉淀进一步于8000g离心20min，继续吸取上清液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(6)中，采用硫酸蒽酮法测定还原糖含量，将葡萄糖标样80℃烘干8小时，称取100mg葡萄糖加水定容到100mL容量瓶中作为母液；再分别配置10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL标准液；然后取2.5mL待测液于试管中加入6.5mL蒽酮试剂，混匀仪摇匀三次，室温避光冷却一小时于OD620nm波长处测定结果，空白为双蒸水；两次重复之后得出不同浓度下的OD值，在Excel中绘制标准曲线。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(6)中，在测定不同的水浴指定温度下的溶解淀粉质量时，需要提前做一次该水浴指定温度下的预实验；在测定溶解淀粉质量时，将待测液稀释到适合分光光度计的度数范围。