CN102359920A - 一种制备卡介菌的培养基原料马铃薯质量标准及质控方法 - Google Patents
一种制备卡介菌的培养基原料马铃薯质量标准及质控方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用来制备卡介菌的培养基原料马铃薯的质量标准和质控方法，以直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%作为马铃薯原料的质控标准，提高卡介菌收率和质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备卡介菌的培养基的原料马铃薯的质量标准和质控方法。
背景技术
在《中国药典》2010年第三部中对卡介菌的培养基的规定是采用苏通马铃薯培养基、改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基。目前大部分企业所采用的是苏通马铃薯培养基。培养特性项下说明，于37～39℃陪养时，卡介菌在苏通马铃薯培养基发育成干皱成团略呈浅黄色的菌苔。
在企业的生产实践中发现，不同批次的原料马铃薯制备的马铃薯培养基上所获得的卡介菌质量不稳定，有的质地紧密，有的则枯黄稀疏，这些情况导致各批次间卡介菌的收率波动较大。
在将菌种接种到马铃薯培养基上接种灭菌后，可以看到有些马铃薯溶，有些土豆不溶。马铃薯溶与不溶的判定标准：去皮的马铃薯切成长方形片状，长约8cm，宽约2.5cm，厚约lcm，制成马铃薯培养基。将马铃薯片放入异型试管中，加入配制好的培养基至略高于异型试管凹进部分，放入不锈钢盒内连同接种铲一起在0.11MPa、121℃条件下，灭菌30分钟。在冷却室放至常温。如果灭菌冷却后的马铃薯仍然保持完整长方形状，则为不溶的马铃薯；如果有部分散落，溶于培养液中，则为溶的马铃薯。
经过观察统计后发现，溶的土豆制成的培养基使得卡介菌生长情况更加良好，收获的卡介菌更加致密有型，不易松散。收获得到的卡介菌得率较高、稳定。
目前尚没有任何单位或个人建立马铃薯培养基的原料质控方法，导致了马铃薯来源及标准无法统一，进而无法有效控制卡介菌的质量。发明人通过分析出马铃薯的有效成分变化、建立原料马铃薯质量标准和控制方法，使得生产得到的卡介菌的质量均一稳定，收率稳定可控。
发明内容
本发明目的是针对现有技术中存在的缺陷和问题，而提供用来制备卡介菌的培养基的原料马铃薯的质量标准和质控方法，以直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%作为制备卡介菌的培养基的原料马铃薯的质控标准，保证所培养出的卡介菌得率和质量可控、均一稳定。
一种制备卡介菌的培养基的原料马铃薯的质量标准，其特征在于直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%。
所述的马铃薯的质控方法，其特征在于包括如下步骤：
（一）总淀粉的含量测定：取切制好的大小合适的土豆块片，用组织捣碎机捣碎，将适量试样放于80目筛上冲洗，其纤维素等残留于筛上，蛋白质、无机盐、糖果、可溶性物质留于水中，称为淀粉乳，而淀粉沉淀于下层，再过100目筛，将沉淀粉物用蒸馏水充分洗涤后，下层淀粉水量降至50%左右。上层混悬液用真空泵滤机吸滤，使含水量降至40%左右，经脱水后的淀粉放于干燥箱中进行干燥，干燥的温度在≤60℃，干燥，冷却，称重，至2g连续两次称重的差异不超过5mg为止。
（二）直链淀粉的含量测定：
（1）标准溶液配制
直链淀粉标准溶液：称取100.0mg直链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL直链淀粉标准溶液。取标准溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，即得浓度为0、2、6、10、14、20、22、26μg/mL的标准溶液系列。
支链淀粉标准溶液：称取100.0mg支链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL支链淀粉标准溶液。分别取1mg/mL溶液0、1、2、3、4、5mL，分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHAC调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，得到0、20、40、60、80、100μg/mL的标准溶液系列。
（2）测定波长的选择
各选一适宜浓度的直链淀粉(15μg/mL)和支链淀粉(60μg/mL)标准溶液，分别在双波长紫外-可见分光光度计上进行400～1000nm光谱扫描，做出其光谱图。
双波长法测定波长的确定：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1、参比波长λ 2。
结果：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1=630nm、参比波长λ 2=486nm。
（3）含量测定
直链淀粉占总淀粉比例（%）：称取各品种100.0mg粗淀粉，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL粗淀粉。取1mg/mL溶液3mL，置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，待测样品。在不同波长测定吸光度，求得其直链淀粉量。以蒸馏水作空白。
支链淀粉占总淀粉比例（%）= 1-直链淀粉占总淀粉比例（%）
为更好的表明本发明的实质，以下用影响马铃薯溶与不溶的物质基础指标成分研究实验及效果来说明：
1. 实验对象
用于生产的十六批马铃薯。
2. 实验仪器与试剂
普通天平、万分之一天平、低速离心机、组织捣碎机、涡旋混匀器、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、超声清洗仪、电热恒温鼓风干燥箱、溶剂过滤器、80目药典筛、100目药典筛、真空泵、刀、常用玻璃仪器、塑料试管、离心试管、试管架、微量移液器、封口膜、马铃薯直链淀粉标准品、碘、碘化钾、乙醇、甲醇、碘试液、石油醚、冰乙酸、氢氧化钠。
3. 实验内容
3.1水分测定
测定用的供试品，先破碎成直径不超过3mm的颗粒或碎片。直径和长度在3mm以下的可不破碎。减压干燥法需通过二号筛。取供试品2～5g,平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。结果见表1。
表1 水分测定
| 编号 | 溶与不溶 | 水分（%） |
| 1 | 不溶 | 77.5 |
| 2 | 溶 | 78.2 |
| 3 | 溶 | 74.1 |
| 4 | 溶 | 79.4 |
| 5 | 溶 | 75.4 |
| 6 | 不溶 | 80.4 |
| 7 | 不溶 | 78.5 |
| 8 | 不溶 | 77.2 |
| 9 | 溶 | 78.6 |
| 10 | 溶 | 79.4 |
| 11 | 不溶 | 80.2 |
| 12 | 不溶 | 78.5 |
| 13 | 不溶 | 77.9 |
| 14 | 溶 | 76.5 |
| 15 | 溶 | 77.1 |
| 16 | 不溶 | 78.5 |
3.2 淀粉含量测定
取切制好的符合标准土豆片，用组织捣碎机捣碎，将适量试样放于80目筛上冲洗，其纤维素等残留于筛上，蛋白质、无机盐、糖果、可溶性物质留于水中，称为淀粉乳，而淀粉沉淀于下层，再过100目筛，将沉淀粉物用蒸馏水充分洗涤后，静止6-7h，下层淀粉水量降至50%左右。上层混悬液用真空泵滤机吸滤，使含水量降至40%左右，经脱水后的淀粉放于干燥箱中进行干燥，干燥的温度在≤60℃，干燥，冷却，称重，至2g连续两次称重的差异不超过5mg为止。结果见表2。
表2 总淀粉含量测定
| 编号 | 溶与不溶 | 总淀粉（%） |
| 1 | 不溶 | 10.86 |
| 2 | 溶 | 10.38 |
| 3 | 溶 | 10.73 |
| 4 | 溶 | 11.17 |
| 5 | 溶 | 11.23 |
| 6 | 不溶 | 12.34 |
| 7 | 不溶 | 12.91 |
| 8 | 不溶 | 11.55 |
| 9 | 溶 | 11.23 |
| 10 | 溶 | 10.96 |
| 11 | 不溶 | 11.52 |
| 12 | 不溶 | 11.23 |
| 13 | 不溶 | 10.87 |
| 14 | 溶 | 11.31 |
| 15 | 溶 | 11.86 |
| 16 | 不溶 | 10.93 |
3.3直链淀粉测定
3.3.1标准溶液配制
直链淀粉标准溶液：称取100.0mg直链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL直链淀粉标准溶液。取标准溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，即得浓度为0、2、6、10、14、20、22、26μg/mL的标准溶液系列。
支链淀粉标准溶液：称取100.0mg支链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL支链淀粉标准溶液。分别取1mg/mL溶液0、1、2、3、4、5mL，分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，得到0、20、40、60、80、100μg/mL的标准溶液系列。
3.3.2测定波长的选择
各选一适宜浓度的直链淀粉(15μg/mL)和支链淀粉(60μg/mL)标准溶液，分别在双波长紫外-可见分光光度计上进行400～1000nm光谱扫描，做出其光谱图。
双波长法测定波长的确定：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1、参比波长λ 2。
结果：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1=630nm、参比波长λ 2=486nm。见附图1。
3.3.3标准曲线制作
将所配制的直链淀粉系列标准溶液分别在不同波长测定吸光度，以蒸馏水作空白，以浓度C为横坐标，双波长法以吸光度差值ΔA=Aλ 1 - Aλ 2为纵坐标分别作直链淀粉标准曲线，并计算回归方程。结果见附图2。
结果：以直链淀粉浓度为纵坐标（y），吸光度为横坐标（x），进行线性回归拟合，得回归方程为：y=0.0345x-0.0062, r=0.998 9。结果表明：直链淀粉在3.6000～15.6000ｕg/ml范围内线性关系良好。
3.3.4样品的测定
直链淀粉占总淀粉比例（%）：称取各品种100.0mg粗淀粉，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL粗淀粉。取1mg/mL溶液3mL，置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，待测样品。在不同波长测定吸光度，求得其直链淀粉量。以蒸馏水作空白。
支链淀粉占总淀粉比例（%）= 1-直链淀粉占总淀粉比例（%）
结果见表3。
表3 淀粉成分分析
| 编号 | 溶与不溶 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） | 支链淀粉占总淀粉比例（%） | 直链淀粉占马铃薯比例（%） | 支链淀粉占马铃薯比例（%） |
| 1 | 不溶 | 17.7 | 82.3 | 1.9 | 8.9 |
| 2 | 溶 | 20.2 | 79.8 | 2.1 | 8.3 |
| 3 | 溶 | 20.4 | 79.6 | 2.2 | 8.5 |
| 4 | 溶 | 21.2 | 78.8 | 2.4 | 8.8 |
| 5 | 溶 | 20.9 | 79.1 | 2.3 | 8.9 |
| 6 | 不溶 | 18.4 | 81.6 | 2.3 | 10.1 |
| 7 | 不溶 | 16.2 | 83.8 | 2.1 | 10.8 |
| 8 | 不溶 | 15.9 | 84.1 | 1.8 | 9.7 |
| 9 | 溶 | 20.8 | 79.2 | 2.3 | 8.9 |
| 10 | 溶 | 21.2 | 78.8 | 2.3 | 8.6 |
| 11 | 不溶 | 17.1 | 82.9 | 2.0 | 9.6 |
| 12 | 不溶 | 18.3 | 81.7 | 2.1 | 9.2 |
| 13 | 不溶 | 18.8 | 81.2 | 2.0 | 8.8 |
| 14 | 溶 | 21.5 | 78.5 | 2.4 | 8.9 |
| 15 | 溶 | 20.9 | 79.1 | 2.5 | 9.4 |
| 16 | 不溶 | 17.2 | 82.8 | 1.9 | 9.1 |
用SPSS17.0对结果进行分析，结果见表4—表9：
表4 水分方差分析
表5 总淀粉方差分析
表6 支链淀粉占总淀粉比例方差分析
表7 支链淀粉占总淀粉比例方差分析
表8 直链淀粉占马铃薯比例方差分析
表9 支链淀粉占马铃薯比例方差分析
由上表可知，溶与不溶的马铃薯的水分、总淀粉（%）、直链淀粉占马铃薯比例（%）的P值>0.05，无显著性差异，而直链淀粉占总淀粉比例（%）、支链淀粉占总淀粉比例（%）、支链淀粉占马铃薯比例（%）、支链淀粉占马铃薯比例（%）P值≤0.05，有显著性差异，可作为溶与不溶的马铃薯质控指标进行区别。
而支链淀粉占总淀粉比例是由直链淀粉占总淀粉比例（%）总比例求出，而直链淀粉占总淀粉比例（%）P值最小为0.000，其P≤0.01（极显著差异），并且为一步求得，不用求取总淀粉量，可降低操作步骤和换算步骤繁琐而带来的误差，故此，直链淀粉占总淀粉比例（%）为指标进行溶与不溶的马铃薯质控指标。
在使用SPSS17.0软件对直链淀粉占总淀粉比例（%）进行单独分析，结果见下表10：
根据数据可以看出，溶的置信指数较高，方差误较低，故此以直链淀粉占总淀粉比例以溶的来进行判断，其下限为20.53%，发明人的多次试验应用结果表明溶的最小值为20.2%。因此确立直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%为溶的马铃薯的标准有效、可信。故此判定<20.0%为不溶的马铃薯。
附图说明
图1 作图法选择检测波长和参比波长
图2 直链淀粉标准曲线
具体实施方式
具体实施例1
001批马铃薯
质控方法：
1.总淀粉的含量测定：取切制好的大小合适的土豆块片，用组织捣碎机捣碎，将适量试样放于80目筛上冲洗，其纤维素等残留于筛上，蛋白质、无机盐、糖果、可溶性物质留于水中，称为淀粉乳，而淀粉沉淀于下层，再过100目筛，将沉淀粉物用蒸馏水充分洗涤后，静止6-7h，下层淀粉水量降至50%左右。上层混悬液用真空泵滤机吸滤，使含水量降至40%左右，经脱水后的淀粉放于干燥箱中进行干燥，干燥的温度在≤60℃，干燥，冷却，称重，至2g连续两次称重的差异不超过5mg为止。
2.直链淀粉的含量测定：
2.1标准溶液配制
直链淀粉标准溶液：称取100.0mg直链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL直链淀粉标准溶液。取标准溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，即得浓度为0、2、6、10、14、20、22、26μg/mL的标准溶液系列。
支链淀粉标准溶液：称取100.0mg支链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL支链淀粉标准溶液。分别取1mg/mL溶液0、1、2、3、4、5mL，分别置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHAC调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，得到0、20、40、60、80、100μg/mL的标准溶液系列。
2.2 测定波长的选择
各选一适宜浓度的直链淀粉(15μg/mL)和支链淀粉(60μg/mL)标准溶液，分别在双波长紫外-可见分光光度计上进行400～1000nm光谱扫描，做出其光谱图。
双波长法测定波长的确定：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1、参比波长λ 2。
结果：用作图法确定直链淀粉测定波长λ 1=630nm、参比波长λ 2=486nm。见附图1。
2.3标准曲线制作
将所配制的直链淀粉系列标准溶液分别在不同波长测定吸光度，以蒸馏水作空白，以浓度C为横坐标，双波长法以吸光度差值ΔA=Aλ 1 - Aλ 2为纵坐标分别作直链淀粉标准曲线，并计算回归方程。结果见附图2。
结果：以直链淀粉浓度为纵坐标（y），吸光度为横坐标（x），进行线性回归拟合，得回归方程为：y=0.0345x-0.0062, r=0.998 9。结果表明：直链淀粉在3.6000～15.6000ｕg/ml范围内线性关系良好。
2.4样品的测定
直链淀粉占总淀粉比例（%）：称取各品种100.0mg粗淀粉，放入100mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL粗淀粉。取1mg/mL溶液3mL，置于50mL容量瓶中，加20～30mLH2O，以0.1mol/LHCl调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，待测样品。在不同波长测定吸光度，求得其直链淀粉量。以蒸馏水作空白。
支链淀粉占总淀粉比例（%）= 1-直链淀粉占总淀粉比例（%）
检测结果见表11。
表 11 具体实施例1
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 001 | 19.8 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为001的直链淀粉占总淀粉比例<20.0%，为不溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为不溶的马铃薯。
具体实施例2
002批马铃薯。
质控方法：同具体实施例1。
检测结果见表12。
表 12 具体实施例2
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 002 | 15.5 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为002的直链淀粉占总淀粉比例＜20.0%，为不溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为不溶的马铃薯。
具体实施例3
003批马铃薯。
质控方法：同具体实施例1。
检测结果见表13。
表 13 具体实施例3
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 003 | 20.1 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为003的直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%，为溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为溶的马铃薯。
具体实施例4
004批马铃薯。
质控方法：同具体实施例1。
检测结果见表14。
表 14 具体实施例4
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 004 | 12.5 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为004的直链淀粉占总淀粉比例＜20.0%，为不溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为不溶的马铃薯。
具体实施例5
005批马铃薯。
质控方法：同具体实施例1。
检测结果见表15。
表 15 具体实施例5
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 005 | 22.2 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为005的直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%，为溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为溶的马铃薯。
具体实施例6
006批马铃薯。
质控方法：同具体实施例1。
检测结果见表16。
表 16 具体实施例6
| 批号 | 直链淀粉占总淀粉比例（%） |
| 006 | 20.8 |
结果分析：根据检测结果判定，批号为006的直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%，为溶的马铃薯。
经生产最终核实后，证实此批马铃薯为溶的马铃薯。
注射剂得率统计
对具体实施例进行卡介菌多糖核酸注射液生产跟踪统计，结果见表17。
表 17 具体实施例生产跟踪情况统计
| 编号 | 溶与不溶 | 卡介菌性状 | 卡介菌得率（%） |
| 001 | 不溶 | 枯黄稀疏 | 12.5 |
| 002 | 不溶 | 枯黄稀疏 | 19.8 |
| 003 | 溶 | 致密有型，不易松散 | 22.5 |
| 004 | 不溶 | 枯黄稀疏 | 16.3 |
| 005 | 溶 | 致密有型，不易松散 | 20.3 |
| 006 | 溶 | 致密有型，不易松散 | 22.8 |
备注：卡介菌得率= 收获卡介菌质量/马铃薯原料质量×100%
通过多次研究及生产追踪、统计分析，确立直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%溶的马铃薯，而<20.0%为不溶的马铃薯。将直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%作为马铃薯的质量标准，本发明的质控方法简单、易行，可操作性强，按此标准可使得生产得到的卡介菌质量均一稳定，提高卡介菌批得率。
Claims (2)
1.一种制备卡介菌的培养基的原料马铃薯的质量标准和质控方法，其特征在于直链淀粉占总淀粉比例≥20.0%。
2.权利要求1所述的马铃薯的质控方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）总淀粉的制备：取切制好的大小合适的土豆块片，用组织捣碎机捣碎，将适量试样放于80目筛上冲洗，其纤维素等残留于筛上，蛋白质、无机盐、糖果、可溶性物质留于水中，称为淀粉乳，而淀粉沉淀于下层，再过100目筛，将沉淀粉物用蒸馏水充分洗涤后，静止6-7h，下层淀粉水量降至50%左右，上层混悬液用真空泵滤机吸滤，使含水量降至40%左右，经脱水后的淀粉放于干燥箱中进行干燥，干燥的温度在≤60℃，干燥，冷却，称重，至2g连续两次称重的差异不超过5mg为止；
（2）直链淀粉占总淀粉比例测定：称取100.0mg粗淀粉，放入100mL容量瓶中，加入1mol/L NaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL粗淀粉；取1mg/mL粗淀粉3mL，置于50mL容量瓶中，加20～30mL H2O，以0.1mol/L HAC调pH至3.5，加0.5mL碘试剂，定容，混匀，待测样品；双波长法测定吸光度，求得其直链淀粉量；以蒸馏水作空白，求得直链淀粉占总淀粉比例测定。
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| CN1590983A (zh) * | 2003-09-02 | 2005-03-09 | 中国农业大学 | 一种检测稻米直链淀粉含量的方法 |
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