CN105441544B

CN105441544B - 利用snp和ssr技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用

Info

Publication number: CN105441544B
Application number: CN201510903368.3A
Authority: CN
Inventors: 李霞; 周国林; 汪爱华; 胡侦华; 黄兴学; 王斌才; 邓耀华; 张润花
Original assignee: Wuhan vegetable research institute
Current assignee: Wuhan vegetable research institute
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2035-12-09
Also published as: CN105441544A

Abstract

本发明一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用。以矮脚黄A不育系与贺B矮杂交获得F2代分离群体为研究对象，通过SNP芯片技术转化获得系列与育性连锁的可电泳检测的SNP标记，并由芯片SNP标记信息开发与育性基因连锁的SSR分子标记。获得的SSR分子标记可以快速鉴定出不育系转育后代群体内单株基因型，为不育系的快速选育及后期杂交制种提供便利，同时为不结球白菜隐性细胞核雄性不育相关基因的精细定位和克隆奠定基础。

Description

利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用

技术领域

本发明属于不结球白菜育种及生物技术领域，具体涉及到一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用。

背景技术

不结球白菜(Brassica campestrisssp.Chinensis Makino)，又名小白菜、青菜、鸡毛菜，在东亚地区栽培十分广泛，是一种重要的叶菜类蔬菜。不结球白菜属十字花科芸薹属白菜亚种，是典型的异花授粉作物，杂种优势明显(邓晓辉，2007)。目前，利用雄性不育系制种是植物杂种优势利用的有效途径，因此对白菜雄性不育系的选育及其应用研究深受育种工作者的重视。

国内外众多研究者开展了白菜分子标记的开发工作。其中，Ying等(2003)利用BSA法结合AFLP技术对大白菜隐性核雄性不育基因进行遗传连锁图谱分析，找到了4个与恢复基因紧密连锁的特异性片段，并成功转换成STS标记。沈向群和杨文俊(2004)筛选出一个与大白菜核基因显性雄性不育育性恢复基因连锁的RAPD标记。邓晓辉等(2007)利用RAPD技术对不结球白菜pol系及其保持系基因组DNA的扩增图谱进行了比较，获得了不育系的特异扩增片段，并转化为稳定的SCAR标记。张淑江等(2008)对大白菜显性细胞核雄性不育系的不育基因进行了RAPD标记并转化为SCAR标记。Feng等(2009)找到了与复等位雄性不育基因相连锁的SSR标记，并定位在A7连锁群中。利用分子标记技术寻找与雄性不育性状相关基因连锁的标记，为分子标记辅助育种打下良好的基础。目前上述研究者开发的与育性基因连锁的分子标记已成功应用于分子标记辅助相应白菜雄性不育系选育中(王丽丽等，2011)，极大降低了选育群体的数量，缩短了选育年限，实现了不育系的高效选育。但已有研究成果主要是在大白菜育种工作中加以利用，针对小白菜隐性核不育材料的分子标记开发较少报道。

目前，随着芯片及新一代高通量测序技术的推广应用，SNP检测和分析技术得到进一步发展，SNP标记成为新一代遗传标记，广泛应用于高密度遗传连锁图谱构建、全基因组关联分析及重要农艺性状基因定位与克隆工作中，为分子标记辅助育种带来了前所未有的机遇(Ganal et al.,2009)。研究发现，水稻每268bp就有1个SNP位点(Sheng et al.,2004)；玉米基因组编码区域每124bp有1个SNP位点，非编码每31bp有1个SNP位点(Ching etal.,2002)；甜菜基因组编码区域每72bp有1个SNP位点，非编码每58bp有1个SNP位点(Schneider et al.,2007)。研究表明，与传统分子标记相比，SNP标记可大大提高定位的精度，能够快速锁定目标基因区段，提出候选基因，更加有利于目标基因的克隆(Buckler etal.,2009；Kim et al.,2010；Yu et al.,2011；Poland et al.,2011)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用；其通过获得的与矮脚黄A育性基因紧密连锁的SSR标记来辅助优良不育系的选育。

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法，包括以下步骤：

1)利用矮脚黄A不育系与贺B矮可育系为亲本杂交获得F1代杂种；

2)F1代人工去雄授粉获得F2代分离群体；

3)F2代群体中各单株编号挂牌，选取30个不育单株和30个可育单株，利用试剂盒分单株提取样品DNA，每10份单株样品DNA等量混合，分别混合得到三个不育集团池和三个可育集团池；

4)将上述六个集团池样品DNA分别与芯片杂交，然后对芯片进行清洗、染色和扫描，收集扫描的SNP数据；

5)将SNP数据经GenomeStudio软件分析，三个不育集团池与三个可育集团池芯片数据评估后共获得73个SNP差异位点，将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库比对分析后显示，上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计56个，A5、A3、A9、A8连锁群各一个；其中，基因分型后，不育材料基因型为“AA/BB”对可育材料基因型“AB”为差异，或不育材料缺失“NC”对可育材料“AA/BB”为差异，共计四种差异类型。

6)根据分布于A2连锁群上的SNP差异位点序列设计17对AS-PCR引物。以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用17对AS-PCR引物分别进行PCR，共获得6个差异标记，

7)将上述获得的6个差异标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对，获得的相应区段作为候选区段。每个标记序列上下游各选取约10K长度的序列，作为引物设计提交序列；设计64对SSR引物；以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用64对SSR引物分别进行PCR，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得10对差异标记分别为:SSR 4-1，SSR 60-1，SSR60-2，SSR 60-5，SSR 7-1，SSR 8-2，SSR 8-3，SSR 810-6，SSR 810-12。

8)将上述10个SSR标记进行F2代2623个单株的分离大群体验证：

a.利用可育和不育表型差异，在2623个单株组成的F2代分离群体中，花期根据表型鉴定挑选出632株不育单株，提取单株DNA。利用SSR4-1，SSR 60-1，SSR 60-2，SSR 60-5，SSR 7-1，SSR 8-2，SSR 8-3，SSR 810-6，SSR 810-8，SSR810-12标记进行大群体PCR扩增检测。

b.基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，将上述10个SSR分子标记及6个SNP差异标记的F2代群体单株基因型数据以及单株育性性状统计数据，运行MAPMAKER/EXPVersion 3.0软件分析，确定其遗传距离。结果表明：SSR60-1，SSR60-2，SSR8-2与目标基因遗传距离<1cM，分别为0.79cM、0.94cM、0.63cM。

进一步地，所述步骤6)中，17对AS-PCR引物序列分别为：

进一步地，所述步骤6)中，扩增6个标记引物序列为：

LX4:5’-GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3’/5’-GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3’，

LX5:5’-AAGTATATACTGGCTTCCCTTCCCCC-3’/5’-CTTTGCACTGGATGGCTCAGAAGAGG-3’，

LX7:5’-ACTGGTCGAGCTGTTTCTGCTGAAA-3’/5’-TGACGTGGATTATTGGTTTGATTCCG-3’，

LX8:5’-TTATGTTTTGTACTGCAAGGAACGCG-3’/5’-CGATGGCTGGAGGCAAGGGTC-3’，

LX11:5’-TTGATCCGGTTACCATAGAGTTCG-3’/5’-GGGTTTGGTGTTTGGGGTGTTTG-3’，

LX12-1:5’-CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTC-3’/5’-CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTA-3’。

再进一步地，所述步骤7)中，64对SSR引物序列分别为：

再进一步地，所述步骤8)中，扩增10个SSR标记引物序列分别为：

SSR4-1:5’-AGTGTTTTGGTTTGCATCCAGT-3’/5’-AGGAGAATGTTGGTGAAATGCT-3’，

SSR60-1:5’-GACATTTGGCTTGATCCTTTTC-3’/5’-TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3’，

SSR60-2:5’-AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3’/5’-CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3’，

SSR60-5:5’-CCTTAATGTTCGTCGTTTATGC-3’/5’-AAACCATATCCAAATCCTACGG-3’，

SSR7-1:5’-CAAAGAAACAAAACCGGAGAAG-3’/5’-CACAAGACAATAGGCGTGAGAG-3’，

SSR8-2:5’-GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3’/5’-GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3’，

SSR8-3:5’-TATTGTTGCAGACGGATTTCAC-3’/5’-AAGAGTACGATGAAGAGGCGAC-3’，

SSR810-6:5’-TCTTGACGAATTACCGATGGAT-3’/5’-GTGCAGAGAGCTATTTTGAGTTGA-3’，

SSR810-8:5’-CAGTCCACGAAACTAACACCAA-3’/5’-ATCACACCTCAATTCTCTTGCC-3’，

SSR810-12:5’-TACCAAGGTTGTGATGATTTGC-3’/5’-CCAAGAAAGAAAAGGGGATCA-3’。

本发明还提供了一种上述筛选获得的3个与不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A育性基因连锁的SSR标记SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2的应用包括：在以矮脚黄A为不育源向其他优良材料转育创制不育系过程中的基因型分析。

a)不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A为母本，选择农艺性状优良的不结球白菜可育系1个为父本，分别与之杂交产生F1代。以F1代为母本，上述优良可育自交系为父本回交，产生BC1F1代。

b)种植BC1F1代植株，单株挂牌取样，提取单株DNA样品，利用标记引物SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2进行单株PCR扩增，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，记录单株带型，进行基因型分析。在两种基因型MSMS(单带扩增)和MSms(双带扩增)中，选择三个标记扩增带型均为MSms基因型的单株，继续与优良可育系回交，产生BC2F1代。

c)种植BC2F1代单株，如步骤b中所示方法继续用标记SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析，选择MSms的基因型的单株作为母本单株与优良可育系回交。如此回交多代(一般4-5代)后，观察轮回后代与优良可育系的田间表型。如基本一致，即可利用SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析，选择BCnF1代中基因型为MSms的单株自交，即可获取优良不育系转育材料。

本发明的有益效果

1.利用分子标记辅助不结球白菜优良不育系转育的优势在于：在利用SSR分子标记辅助隐性核不育源转移至优良可育系的过程中，可以帮助育种工作者提前获得转育群体单株的基因型。在回交当代选择自己所需的单株，而无需回交后再自交观察田间表型，节省了大量的投入，缩短了育种年限。

2.获得了与不结球白菜隐性核不育育性基因紧密连锁的分子标记，为下一步基因克隆奠定了良好的基础。

附图说明

图1为SNP标记及小群体验证图；

图中，LX4、LX5、LX7、LX8、LX11、LX12-1为标记名称，B代表可育集团池，A代表不育集团池，B1-B12代表可育单株，A1-A12代表不育单株，M:Marker；

图2为 SSR标记筛选图；

图中，A表示不育集团混合池，B表示可育集团混合池，4-1、60-1、60-2、60-5、7-1，8-2、8-3、810-6、810-8和810-12为SSR标记名称。

具体实施方式

实施例1：不结球白菜隐性核不育系育性基因连锁的分子标记筛选

1.DNA提取

对F2代分离群体中各单株编号挂牌，于苗期选取0.5g鲜嫩叶片，装于2.0ml离心管，于-20℃或-70℃储存备用。基因组DNA提取采用CTAB法(Lu et al,2004)。具体步骤是：将叶片倒于研钵中，加入700-800μl 2％的CTAB缓冲液(2％CTAB；EDTA：20mmol/L；pH＝8.0Tris-HCl：100mmol/L；NaCl：1.4mol/L；PVP1％)，磨成匀浆。65℃水浴60min，每隔15min轻摇一次。室温放置10min，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)轻摇，混匀。12,000r/min离心15min，轻轻取出，吸取上清至新的2ml的离心管中，加1/10体积的3MNaAC (PH＝5.2)，再加入两倍体积的冰冻无水乙醇，上下翻转数次混匀，冰浴30min。10,000r/min离心2min，小心的倒去上清，加1,000μl漂洗液(76％乙醇，10mM醋酸铵)，漂洗两次。小心的倒掉漂洗液，于室温下晾干至透明无色。视DNA量，酌情加入TE缓冲液(含0.1％的RNase)溶解DNA，-20℃保存备用。总DNA质量用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。总DNA浓度用紫外分光光度计(Pharmacia Biotech,Gene Quant Ⅱ)测量，根据检测结果，将各样品的DNA浓度用ddH2O调整到50ng/μl，于-20℃保存备用。

2 SNP标记筛选

2.1 DNA制备及样品池的构建

使用天根生化科技(北京)有限公司生产的《新型植物基因组DNA提取试剂盒》提取样品DNA，以备后续扩增所用。所用产品目录号：DP320，具体操作按照产品使用说明中的操作步骤执行。产品说明书版本号：DP121221。在F2群体内选取30个不育单株和30个可育单株，利用试剂盒分单株提取样品DNA，每10份单株样品等量混合，混成三个不育集团池，和三个可育集团池，用于后续DNA的扩增。本实验利用Illumina 60K BrassicanapusSNP芯片技术对六份混合样品进行分析。

2.2 DNA扩增准备

0.1N NaOH(4gNaOH溶于100ml水)DNA变性，MA2中和作用，37℃孵育20-24h，DNA充分扩增。

2.3样本与芯片杂交-DNA片段化

加入50μl FMS 37℃温育1h，DNA被酶切为300-600bp的小片段；沉淀DNA，加100PM1，300μl异丙醇，4℃静止30min，3000g离心20min，干燥1h。回溶DNA片段，加入RA1，48℃1h。DNA变性，95℃20min，室温静止30min。准备杂交盒，加入PB1，48℃杂交16-24h。

2.4芯片清洗

在玻璃槽中加入200ml PB1，放入洗架，沿对角线撕去芯片表面的封膜，把去封膜的芯片放到洗架上，上下拉动1min，洗去未杂交上的DNA片段。

2.5芯片染色

150ml PB1放入安装盒中，放入黑色框架，把芯片放到黑色框架上，放入塑料垫片，放上Alignment Bar，将玻璃板放到芯片上，用金属夹固定玻璃板、塑料垫片、芯片、黑色框架，剪除垫片多余的部分。准备染色试剂，将水循环加热仪事先预热至44℃，用测温仪测定预热水循环加热仪的温度，使其稳定于44℃。把制作完成的芯片装置放到水循环加热仪上，按照实验流程操作(单碱基延伸、染色)，PB1作为洗液，XC4用于封膜。取下芯片，放在staining rack上，PB1中上下拉动10次，静止5min，XC4中上下拉动10次，静止5min，0.68bar真空抽干50-55min。以上操作流程由inlumina公司网站提供(英文版)。

2.6芯片扫描

采用BeadArray Reader激光共聚焦扫描系统，进行数据采集。

2.7芯片数据分析

SNP数据分析使用的软件为GenomeStudio Software软件，该软件由以下网站http://www.illumina.com.cn/applications/microarrays/microarray-software/genomestudio.aspx提供。数据分析过程中，分析软件参数设置为默认参数。其中基因分型后，不育材料基因型为“AA/BB”对可育材料基因型“AB”为差异，或不育材料缺失“NC”对可育材料“AA/BB”为差异，共计四种差异类型。三个不育集团池与三个可育集团池芯片数据分析评估后共获得73个SNP差异位点(表1)，将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库比对分析后显示，上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计 56个，A5、A3、A9、A8连锁群各一个(表2)。

表1评估后SNP标记差异表

表1续

注：A1-A3是不育集团混池样品名，B1-B3是可育集团混池样品名。

表2比对分析后SNP差异位点分布表

表2续

2.8 AS-PCR引物设计

由于SNP标记只有转化为可电泳检测的分子标记，才便于后续实验操作及实际应用。由于本实验中绝大部分SNP差异位点集中分布在A2连锁群，因此引物设计重点选取A2连锁群的SNP差异位点进行标记转化。根据PCR引物3’末端必须与模板完全互补才能产生有效聚合反应的原理，将SNP差异位点序列提交网站http://pga.mgh.harvard.edu/cgi-bin/snap3/websnaper3.cgi在线设计Allele-Specific PCR(AS-PCR)引物，共设计17对AS-PCR引物。

2.9 AS-PCR引物的琼脂糖凝胶检测：

50ng DNA，1×PCR缓冲液，2.0mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，正向及反向AS-PCR引物各12.5ng，反应总体积为10μl。PCR循环参数为：94℃(2min)；94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(1min)，35个循环；4℃保存。扩增产物于1％琼脂糖凝胶上电泳分离，通常用0.5×TAE，180W电压。电泳完成后，用伯乐凝胶成像系统GelDoc^TM XR+拍照并保存图片。17对AS-PCR引物扩增三个可育集团池和三个不育集团池，共获得6个差异标记(图1)，以上标记序列见表3所示。

表3 SNP标记引物序列

3.SSR标记筛选

3.1 SSR引物设计

将以上获得的6个SNP标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对，获得的相应区段作为候选区段。每个标记序列上下游各选取约10K长度的序列，作为引物设计提交序列。共计提交6段白菜基因组A2连锁群上的候选序列至http://wsmartins.net/websat/网站，在线进行SSR引物设计。

3.2 PCR反应体系

共设计SSR引物64对，按以下PCR体系扩增：50ng DNA，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，正向及反向SSR引物各12.5ng，反应总体积为10μl。PCR循环参数为：94℃(2min)；94℃(30s)，60℃(-0.5℃/循环)(30s)，72℃(45s)，9个循环；94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(1min)，30个循环；4℃保存。

3.3 SSR引物检测及标记筛选

扩增产物于6％变性PAGE凝胶上电泳分离，通常用0.5×TBE，80W电压。电泳完成后，银染法显带，用数码相机拍照保存图片。通过SSR引物在不育集团池和可育集团池的扩增，在64对SSR引物中共计有10对SSR引物在不育集团池和可育集团池扩增出差异条带(图2)。

4与育性基因连锁的分子标记遗传距离估算

将上述获得的差异标记，进行F2代2623个单株的分离大群体验证。基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，将上述10个SSR分子标记的F2群体单株基因型数据和育性性状统计数据输入计算机，运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析，确定其遗传距离。结果表明：SSR4-1、SSR60-1、SSR60-2、SSR60-5、SSR7-1、SSR8-2、SSR8-3、SSR810-6、SSR810-8、SSR810-12的遗传分别为2.5cM、0.79cM、0.94cM、1.1cM、1.4cM、0.63cM、1.2cM、1.4cM、1.5cM、3.1cM。同时遗传距离<1cM的SSR标记为3个(差异标记序列如表4所示)，

表4 SSR标记引物序列

实施例2：利用与不结球白菜矮脚黄A育性基因连锁的分子标记辅助选育优良不育系转育，步骤如下：

a)不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A为母本，选择农艺性状优良的不结球白菜可育自交系为父本，杂交产生F1代。

b)以F1代为母本，上述优良可育自交系为父本回交，产生BC1F1代。

c)种植BC1F1代植株，单株挂牌取样，提取单株DNA样品，利用标记SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2引物进行单株PCR扩增，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显影后，记录单株扩增带型，进行基因型分析。单株基因型分为两类MSMS单带扩增和MSms双带扩增，选择三个标记扩增带型均为MSms基因型的单株，继续与优良可育系回交，产生BC2F1代。

d)种植BC2F1代单株，如步骤c中所示方法继续用标记SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析，选择MSms的基因型的单株作为母本单株与优良可育系回交。如此回交多代(一般4-5代)后，观察轮回后代与优良可育系的田间表型。如基本一致，即可利用SSR60-1、SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析，选择BCnF1代中为MSMs的基因型的单株自交。即获得优良的不育系转育材料。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)对F2代分离群体中各单株编号挂牌，在F2群体内选取30个不育单株和30个可育单株，利用试剂盒分单株提取样品DNA，每10份单株样品DNA等量混合，分别混合得到三个不育集团池和三个可育集团池；

2)将上述六个集团池DNA分别与Illumina 60K BrassicanapusSNP芯片杂交，然后对芯片进行清洗、染色和扫描，收集扫描的SNP数据；

3)将SNP数据通过GenomeStudio Software软件进行数据分析，三个不育集团池与三个可育集团池芯片数据分析评估后共获得73个SNP差异位点，将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库比对分析后显示，上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计56个，A5、A3、A9、A8连锁群各一个；其中，基因分型后，不育材料基因型为“AA/BB”对可育材料基因型“AB”为差异，或不育材料缺失“NC”对可育材料“AA/BB”为差异，共计四种差异类型；

4)根据上述分布于A2连锁群上的SNP差异位点序列为模板设计17对AS-PCR引物；其中，

17对AS-PCR引物序列为：

5)以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用17对AS-PCR引物分别进行PCR，共获得6个差异标记，分别命名为LX4、LX5、LX7、LX8、LX11、LX12-1；其中，

扩增6个标记引物序列分别为：

LX4:5’-GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3’/5’-GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3’，

LX7:5’-ACTGGTCGAGCTGTTTCTGCTGAAA-3’/5’-TGACGTGGATTATTGGTTTGATTCCG-3’，

LX8:5’-TTATGTTTTGTACTGCAAGGAACGCG-3’/5’-CGATGGCTGGAGGCAAGGGTC-3’，

LX11:5’-TTGATCCGGTTACCATAGAGTTCG-3’/5’-GGGTTTGGTGTTTGGGGTGTTTG-3’，

LX12-1:5’-CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTC-3’/5’-CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTA-3’；

6)将上述获得的6个差异标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对，获得的相应区段作为候选区段；每个标记序列上下游各选取10K长度的序列，作为引物设计提交序列；设计64对SSR引物；以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用64对SSR引物分别进行PCR，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共获得10个差异标记，分别命名为：SSR 4-1，SSR 60-1，SSR60-2，SSR 60-5，SSR 7-1，SSR 8-2，SSR 8-3，SSR 810-6，SSR 810-12；其中，64对SSR引物序列分别为：

7)将上述标记进行F2代2623个单株的分离大群体验证：

a.利用可育和不育表型差异，在2623个单组成的F2代分离群体中，花期表型鉴定挑选出632株不育单株，提取单株DNA，利用SSR4-1，SSR 60-1，SSR 60-2，SSR 60-5，SSR 7-1，SSR8-2，SSR 8-3，SSR 810-6，SSR 810-8，SSR810-12标记进行单株PCR扩增大群体检测；其中，扩增10个SSR标记引物序列分别为：

SSR4-1:5’-AGTGTTTTGGTTTGCATCCAGT-3’/5’-AGGAGAATGTTGGTGAAATGCT-3’，

SSR60-1:5’-GACATTTGGCTTGATCCTTTTC-3’/5’-TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3’，

SSR60-2:5’-AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3’/5’-CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3’，

SSR60-5:5’-CCTTAATGTTCGTCGTTTATGC-3’/5’-AAACCATATCCAAATCCTACGG-3’

SSR7-1:5’-CAAAGAAACAAAACCGGAGAAG-3’/5’-CACAAGACAATAGGCGTGAGAG-3’

SSR8-2:5’-GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3’/5’-GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3’

SSR8-3:5’-TATTGTTGCAGACGGATTTCAC-3’/5’-AAGAGTACGATGAAGAGGCGAC-3’

SSR810-6:5’-TCTTGACGAATTACCGATGGAT-3’/5’-GTGCAGAGAGCTATTTTGAGTTGA-3’

SSR810-8:5’-CAGTCCACGAAACTAACACCAA-3’/5’-ATCACACCTCAATTCTCTTGCC-3’

SSR810-12:5’-TACCAAGGTTGTGATGATTTGC-3’/5’-CCAAGAAAGAAAAGGGGATCA-3’；

b.基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，将上述10个SSR分子标记F2代群体单株基因型数据以及单株育性性状统计数据，运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析，确定其遗传距离；结果表明:SSR60-1，SSR60-2，SSR8-2与目标基因遗传距离<1cM，分别为0.79cM、0.94cM、0.63cM。

2.根据权利要求书1所述利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法，其特征在于：所述步骤7)中，使用下述SSR引物分别进行PCR扩增

SSR60-1:5’-GACATTTGGCTTGATCCTTTTC-3’/5’-TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3’，

SSR60-2:5’-AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3’/5’-CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3’，

SSR8-2:5’-GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3’/5’-GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3’；

扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得三个扩增产物片段，片段大小分别为325bp、288bp、175bp。