CN1936021A - 一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法，属于生物技术领域，用于不结球白菜胞质雄性不育系的分子标记辅助选择育种。用标记引物OPAG20，或者用标记引物SCAG20，扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料线粒体DNA，如果能够扩增出700bp的片段，均标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。本发明对不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB线粒体DNA进行RAPD及SCAR分子标记的筛选，可有效开展不结球白菜胞质雄性不育系的分子标记辅助选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程。
Description
一、技术领域
本发明公开了一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法，属于生物技术领域，用于不结球白菜胞质雄性不育系的分子标记辅助选择育种。
二、技术背景
不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，原产中国，是我国南方普遍种植的最大众化蔬菜，在蔬菜的周年供应中起着举足轻重的作用(侯喜林，2003)。不结球白菜为典型的异花授粉作物，自交衰退严重，优良杂交组合产量优势明显。不结球白菜花器小，人工去雄成本高，而利用雄性不育系是进行杂种生产的理想材料，其中胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)可获得100％的不育系，在生产上具有良好的应用前景。
传统的育种方法选育不育系周期长、效率低，这也是目前限制不结球白菜雄性不育系选育和应用的重要原因。分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection)不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加速育种进程，提高不结球白菜不育系的育种效率。
自Levings提出线粒体DNA(mitochondria DNA，mtDNA)与雄性不育有关以来，研究者从线粒体DNA水平、线粒体RNA水平及其翻译产物蛋白质水平上进行多方面的研究，结果证明mtDNA与雄性不育有着本质的联系(Menassa，1999；凌杏元，2000；张祖新，2002)。目前已在榨菜、矮牵牛、萝卜、油菜、等多种作物不育胞质的线粒体基因组找到了可能与CMS有关的基因座位(陈学军，2003；Yesodi，1997；易平，2002；王永飞，2001)。
随着分子生物学的发展，国内外都很重视开展线粒体基因组中育性基因的分子标记筛选以及分子标记辅助选择(杨剑波，2002；凌杏元，2000；张赛群，2003)。在蔬菜作物上，盖树鹏等(2001，2004)利用RAPD技术，在大葱胞质雄性不育系mtDNA中获得了不育基因的1个标记S132800，并成功转化为SCAR标记，同时建立了大葱不育系分子标记辅助选择的技术体系。陈学军等(2003)利用特异引物在榨菜胞质雄性不育系mtDNA中获得了1173bp的特异PCR标记。但至今尚无不结球白菜mtDNA胞质雄性不育基因标记筛选及其标记辅助选择的报道，MAS将提高选择效率，从而加快育种进程。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是：筛选出一个或几个与不结球白菜mtDNA中胞质雄性不育基因紧密连锁的分子标记，建立不结球白菜雄性不育系分子标记辅助选择体系，从而提高不结球白菜不育系的选择效率，为杂种优势的利用提供理想材料。
技术方案 本发明的实施方案如下：
一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法，其特征在于：
用标记引物OPAG20，引物序列为ATGGCGAGAG
扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料线粒体DNA，如果能够扩增出700bp的片段NAU/RAPD/CMS5700，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
或者用标记引物SCAG20，
左端引物序列：ATGGCGAGAGGGAAGATCCA
右端引物序列：ATGGCGAGAGTTATTCAAGA
扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料线粒体DNA，如果能够扩增出700bp的片段NAU/SCAR/CMS6700，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
上述标记引物的筛选的过程如下：
(1)选用不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB；
(2)用SDS-蛋白酶K法提取不育系98HA及其保持系98HB的单株线粒体DNA；
(3)标记引物的筛选：
RAPD标记引物的筛选：用随机引物在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl2 2.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板mtDNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB mtDNA间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因的1个700bp的RAPD标记片段NAU/RAPD/CMS5700，其标记引物为OPAG20。
利用Takara公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化特异DNA片段，连接pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定重组克隆并由Takara公司进行两端测序。
SCAR标记的筛选：根据RAPD扩增特异序列的测序结果，利用软件Primer Premier设计SCAR引物，在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl2 2.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物对2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板mtDNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。
PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HBmtDNA间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因的1个700bp的SCAR标记片段NAU/SCAR/CMS6700。
本发明获得了不结球白菜mtDNA胞质雄性不育基因的1个RAPD标记NAU/RAPD/CMS5700，并将其转化为更为稳定的SCAR标记NAU/SCAR/CMS6700。
有益效果 本发明选用的是不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系为材料开展不结球白菜mtDNA中胞质雄性不育分子标记的筛选及分子标记辅助选择体系的建立。与目前技术相比，其优点是：
(1)标记稳定。本研究以不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系这一对近等基因系为材料，鉴定出RAPD标记1个，并转化为更稳定的SCAR标记，在2002，2003年分别用这些标记对不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系测交及自交后代进行检测，表明该标记表现稳定，不受年份、环境条件的影响。
(2)分子标记辅助选择体系操作方便，节约成本。不结球白菜雄性不育系的常规选育方法周期长，成本高，费时又费力。通过本发明探索出了简易、快速提取不结球白菜mtDNA的方法；筛选出了不结球白菜mtDNA中胞质雄性不育基因的1个RAPD标记及1个SCAR分子标记用于辅助选择，并建立了PCR产物的快速检测技术；建立的分子标记辅助选择方法可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜胞质雄性不育系的选择效率，从而加快育种进程。
四、附图说明
图1 NAU/RAPD/CMS5700标记的筛选
左边两个泳道为引物OPAG20在不结球白菜胞质雄性不育系98HAmtDNA中的扩增结果，右边两个泳道为引物OPAG20在不结球白菜保持系98HBmtDNA中的扩增结果，箭头所示为标记NAU/RAPD/CMS5700。
图2 NAU/SCAR/CMS6700标记的筛选
左边两个泳道为引物对SCAG20在不结球白菜胞质雄性不育系98HAmtDNA中的扩增结果，箭头所示为标记NAU/SCAR/CMS6700。
五、具体实施方式
本发明的实施程序是：
(一)材料与方法 不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB这一近等基因系来自南京农业大学蔬菜研究所(Hou X.L.Cao S.C and He Y.K.Creation of a newgermplasm of CMS non-heading Chinese cabbage.Acta Horticulturae，2004，1：75～81，南京农业大学蔬菜研究所自该专利申请之日起20年内保证对外提供)。胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB测交及自交后代进行育性调查、分子标记的筛选及连锁分析，重组率计算公式为：重组率＝重组型植株数/总株数×100％。
(二)分子标记筛选分析 主要利用RAPD标记及SCAR标记。
本试验mtDNA的提取采用SDS-蛋白酶K法(史公军，王彦华，侯喜林，不结球白菜线粒体DNA的提取及分析，西北农业学报，2004，1：52～54)。
首先用含有标记引物OPAG20，序列为ATGGCGAGAG的240对随机引物对不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB的mtDNA多态性进行初步分析。在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl2 2.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板mtDNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB mtDNA间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因的1个700bp的RAPD标记片段NAU/RAPD/CMS5700，其标记引物为OPAG20。
利用Takara公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化特异DNA片段，连接pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定重组克隆并由Takara公司进行两端测序。
根据测序结果进行SCAR标记引物的设计，利用软件Primer Premier设计20bp SCAR引物。
SCAG20L：ATGGCGAGAGGGAAGATCCA
SCAG20R：ATGGCGAGAGTTATTCAAGA
SCAR标记的筛选是在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl2 2.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物对2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板mtDNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。
PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出不结球白菜胞质雄性不育基因的SCAR标记。
(三)结果与分析 分子标记筛选结果表明，共发现不结球白菜mtDNA中胞质雄性不育基因的1个RAPD标记与不结球白菜胞质雄性不育基因连锁，即用引物OPAG20扩增出的700bp的片段NAU/RAPD/CMS5700，并将其转化为更为稳定的1个SCAR标记NAU/SCAR/CMS6700，用引物对SCAG20L和SCAG20R可扩增出700bp的片段。通过对不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系后代单株进行连锁分析，发现所筛选到的标记与不结球白菜胞质雄性不育基因紧密连锁(表1)。此外，标记在不同年份，不同环境表现稳定。
建立了利用分子标记辅助不结球白菜育种的技术体系。探索出了简易、快速的SDS-蛋白酶K法用于不结球白菜mtDNA的提取；筛选出了不结球白菜mtDNA中胞质雄性不育基因的1个RAPD标记及1个SCAR分子标记用于辅助选择；并建立了PCR产物的快速检测技术；建立的分子标记辅助选择方法可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜胞质雄性不育系的选择效率，从而加快育种进程。
表1标记在胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB后代中的分离情况
| 多态性标记 | 不育系单株 | 保持系单株 | 重组率(％) | ||
| 株数 | 重组个体数 | 株数 | 重组个体数 | ||
| NAU/RAPD/CMS5700NAU/SCAR/CMS6700 | 6060 | 00 | 6060 | 00 | 00 |
Claims (2)
1、一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法，其特征在于：
用标记引物OPAG20，序列为ATGGCGAGAG
扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料线粒体DNA，如果能够扩增出700bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在；
或者用标记引物SCAG20，
左端引物序列：ATGGCGAGAGGGAAGATCCA
右端引物序列：ATGGCGAGAGTTATTCAAGA
扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料线粒体DNA，如果能够扩增出700bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
2、根据权利要求1所述的一种不结球白菜雄性不育分子标记辅助选择方法，其中采用的OPAG20和SCAG20两种分子标记引物是通过以下方法筛选获得的：
1)选用不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB；
2)用SDS-蛋白酶K法提取不育系98HA及其保持系98HB的单株线粒体DNA；
3)标记引物的筛选：
用随机引物在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl2 2.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板线粒体DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl；
PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB线粒体DNA间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因的1个700bp的RAPD标记片段，其标记引物为OPAG20；
根据RAPD扩增特异序列的测序结果，利用软件Primer Premier设计SCAR引物，在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物对2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板线粒体DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl；
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN102978287A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-03-20 | 南京农业大学 | 一种利用雄蕊瓣化标记不结球白菜雄性不育基因的方法 |
| CN105441544A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-30 | 武汉市蔬菜科学研究所 | 利用snp和ssr技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用 |
| CN107312845A (zh) * | 2017-07-07 | 2017-11-03 | 华中农业大学 | 鉴别无蜡粉不结球白菜的引物、试剂盒及鉴别方法 |
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| CN105441544A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-30 | 武汉市蔬菜科学研究所 | 利用snp和ssr技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用 |
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