CN105424788A - 利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测dna碱基的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器，包括工作电极、辅助电极和参比电极，所述工作电极为哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰的玻碳电极，其经下述步骤获得：1）将壳聚糖溶液和哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液等体积混合后，超声分散0.5－1h，然后静置1－3h获得复合材料，再次超声震荡、漩涡分散均匀后，滴加到洁净的玻碳电极表面，晾干成膜；2）在步骤1）所得玻碳电极的膜表面滴加全氟磺酸溶液，晾干成膜，即得。该生物传感器可以实现对脱氧核糖核酸碱基进行单独或同时检测，并且具有较宽的线性检测范围、较低的检测限、较高的灵敏度、且干扰反应少、反应条件温和。

Description

利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器
技术领域
本发明属于DNA碱基检测技术领域，具体涉及一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰电极构建的生物传感器检测DNA碱基的新方法。
背景技术
碱基是核酸分子的主要组成部分，核酸分析在生物化学和分子生物学研究中有着极为重要的意义，广泛应用于传染病、流行病、肿瘤和遗传性疾病的临床检测、环境监控等方面。电化学因其操作简便、快速、灵敏等特性而受到国内外科研人士的广泛认可，运用电化学的方法进行核酸分析更是成为国内外研究的热点。
核酸分子中的腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）在储存遗传信息和蛋白质的生物合成中扮演着重要角色。在DNA双螺旋结构中嘌呤与嘧啶的比值介于0.8－1.0之间，比值异常和癌症、衰老等一些疾病密切联系。此外，一些肉类尤其是牛肉，新鲜的海洋食物和豆科植物中富含嘌呤体。然而，大量的肉类物质摄入会增加痛风、高尿血症等一些疾病的发病率。依据Watson–Crick的碱基互补配对原则，DNA中嘌呤和嘧啶浓度是相匹配的，由此看来，简单有效测定DNA样品中碱基浓度是十分必要的。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器，该生物传感器包括工作电极、辅助电极和参比电极，其中，所述工作电极为哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰的玻碳电极，其经下述步骤获得：
1）将壳聚糖溶液和哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液等体积混合后，超声分散0.5－1h，然后静置1－3h获得复合材料，再次超声震荡、漩涡分散均匀后，滴加到洁净的玻碳电极表面，晾干成膜；
2）在步骤1）所得玻碳电极的膜表面滴加全氟磺酸溶液，晾干成膜，即得。
具体的，步骤1）中，所述壳聚糖溶液浓度为0.5wt%，哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液浓度为4mg/ml。
目前为止，有很多用于测定碱基的方法，如高性能液相色谱法、离子对高效液相色谱法、毛细管电泳法、流动注射化学发光光谱法等，这些方法均存在费时、成本高、灵敏度低、预处理过程复杂等缺点。电化学分析方法提供了方便、快捷的方式来检测碱基且价格低廉，灵敏度高。DNA的氧化性损伤一般发生在嘌呤碱基上，其中鸟嘌呤因具有最低氧化电位而最容易被氧化。结合纳米材料及一些生物大分子成功构建出了生物传感器，实现了不同碱基的电化学氧化过程；通过电化学测定：不同碱基都有其相对应的氧化电位，不同浓度碱基所检测到的电流存在差异，这就是本发明DNA样品中碱基测定的主线。
哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯是一种功能化纳米材料，因其具有高的热导率、良好的机械强度、高比表面积等优点而受到科研人员的关注。本发明选取哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯为主导材料修饰的电化学工作电极，从而实现DNA碱基在电极上的电化学氧化，达到碱基测定的目的。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明是以纳米材料哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯（rGO-NH）为基体修饰工作电极构建了一种新型的纳米生物传感器，实现了脱氧核糖核酸碱基的电化学检测。其中，工作电极的构建是通过哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯与壳聚糖（CHI）特定条件下自组装修饰并用全氟磺酸（Nafion）修饰加以牢固而获得。本发明成功构建出了稳定且高效的新型生物传感器，结合碱基的电化学氧化过程可以实现对脱氧核糖核酸碱基进行单独或同时检测，并且具有较宽的线性检测范围、较低的检测限、较高的灵敏度、且干扰反应少、反应条件温和，还能够实现实际样品中碱基的检测。
附图说明
图1为实施例1中哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰的玻碳电极的构建示意图；
图2为固定鸟嘌呤（G）浓度25μM，胸腺嘧啶（T）浓度250μM，腺嘌呤（A）浓度从0－400μM的差分脉冲伏安测定结果；
图3为固定腺嘌呤（A）浓度20μM，胸腺嘧啶（T）浓度200μM，鸟嘌呤(G)浓度从0－200μM的差分脉冲测定结果；
图4为固定腺嘌呤（A）浓度25μM，鸟嘌呤（G）浓度25μM，胸腺嘧啶（T）浓度从0－2000μM的差分脉冲测定结果；
图5为小牛胸腺DNA和鲱鱼精子DNA的测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，壳聚糖购自生工生物（上海）股份有限公司。哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯购自南京先丰纳米材料科技有限公司（rGO-NH）。全氟磺酸溶液（Nafion溶液），也称作全氟磺酸原液，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
0.5%壳聚糖溶液的配制：称取50mg壳聚糖粉末加入到10ml含1V%醋酸的双蒸水溶液中，搅拌至完全溶解，用微量大浓度氢氧化钠溶液调节其pH至5~6，分装备用。
4mg/ml哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液的配制：称取4mg哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯超声分散于1ml双蒸水中，可采用超声与漩涡震荡混合进行，以保证其充分分散。
玻碳电极的清洁处理：分别使用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝对玻碳电极表面进行打磨，打磨至呈镜面，依次在75V%乙醇溶液、双蒸水中进行震荡清洗，取出。利用电化学工作站三电极体系（辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为玻碳电极）观察其循环伏安曲线。具体为：将初步清洗过的玻碳电极置于含100mM、pH7.0的PBS缓冲液（即磷酸氢二钠-磷酸二氢钠）中，连接三电极，打开CHI650C电化学工作站，选取循环伏安法（设定参数：电压范围为-0.1V～1.8V，扫描速度为50mV/s，四个循环）开始循环伏安扫描，观察其循环伏安图谱，若无杂峰说明清洗干净，取出，双蒸水冲洗后放入干燥皿中备用。
实施例1
如图1所示，一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器，该生物传感器包括工作电极、辅助电极（铂电极）和参比电极（Ag/AgCl电极），其中，所述工作电极为哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰的玻碳电极，其经下述步骤获得：
1）将0.5%壳聚糖溶液和4mg/ml哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液等体积（5μL）混合后，超声分散约0.5h，然后静置约2h获得纳米复合材料，重新超声震荡、漩涡分散均匀后，用移液器吸取4μL缓慢均匀滴加到洁净的玻碳电极表面，晾干成膜（保证无气泡，无侧漏，无污染，可置于干燥器中过夜干燥处理以成膜）；
2）观察步骤1）所得玻碳电极表面的成膜状态，若膜完好成型于玻碳电极表面则可进行下一步修饰。取2μL全氟磺酸溶液滴加到修饰后的玻碳电极膜表面（保证垂直滴加，以确保哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯与壳聚糖复合膜被完全覆盖），静置，晾干成膜，即得。
电化学实验测定
以实施例1构建的生物传感器为例，通过CHI650C电化学工作站的差分脉冲伏安法（设定参数：脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，扫描速度为50mV/s）进行不同碱基的同时检测。具体为：固定腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶(T)中的两种碱基，来测定第三种碱基，测定结果见图2至4。
图2为固定鸟嘌呤（G）浓度25μM，胸腺嘧啶（T）浓度250μM，腺嘌呤（A）浓度从0－400μM的差分脉冲伏安测定结果。从图2中可以看出在低浓度腺嘌呤（A）存在的情况下，无法检测到响应电流，但随着待测溶液中腺嘌呤（A）浓度的增大，其响应电流随之增强。
图3为固定腺嘌呤（A）浓度20μM，胸腺嘧啶（T）浓度200μM，鸟嘌呤（G）浓度从0－200μM的差分脉冲测定结果。从图3中可以看出在低浓度鸟嘌呤（G）存在的情况下，无法检测到响应电流，但随着待测溶液中鸟嘌呤（G）浓度的增大，其响应电流随之增强。
图4为固定腺嘌呤（A）浓度25μM，鸟嘌呤（G）浓度25μM，胸腺嘧啶（T）浓度从0－2000μM的差分脉冲测定结果。从图4中可以看出在低浓度胸腺嘧啶（T）存在的情况下，无法检测到响应电流，但随着待测溶液中胸腺嘧啶（T）浓度的增大，其响应电流随之增强。
从上述图中可以明显看出：随着变量碱基浓度的增加，差分脉冲响应电流也逐渐增强，且在一定的范围内存在极好的线性关系（小图部分），其均有较低的检测限（最低检测浓度）和极好的线性范围，具体如下：
A：y=0.1469x+4.7012，R2=0.9903；最低检测限：0.2μM，线性检测范围：0.2μM－50μM；
G：y=0.2324x+3.0386，R2=0.9907；最低检测限：0.1μM，线性检测范围：0.1μM－40μM；
T：y=0.0117x+7.0802，R2=0.99；最低检测限：2μM，线性检测范围：10μM－17000μM。体系环境为100mMpH7PBS缓冲溶液，差分脉冲伏安参数为：脉冲振幅50mV，脉冲宽度50ms，扫描速度：50mV/s。
实际样品测定
以实施例1构建的生物传感器进行实际样品测定。实际样品测定选取小牛胸腺DNA和鲱鱼精子DNA为实验材料，对其进行消化溶解预处理，具体为：称取10mg小牛胸腺DNA样品，用5ml浓度1M的HCl溶解，80℃水浴加热50min后，用浓度1M的NaOH进行中和直至溶液pH为7，最后用pH7的磷酸缓冲液定容至20ml后取5ml于样品池中，以实施例1构建的生物传感器为基础，通过CHI650C电化学工作站的差分脉冲伏安法（设定参数：脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，扫描速度为50mV/s）进行实际样品测定。
鲱鱼精子DNA的预处理及测定条件参照小牛胸腺DNA。测试结果见图5。
由图5可以明显看出：小牛胸腺DNA和鲱鱼精子DNA样品经消化溶解预处理后，在0.8V(G)，1.1V(A)，1.3V(T)附近均能检测到相应的电化学氧化信号，能够用于真实样品的检测。需要说明的是：实验材料小牛胸腺DNA和鲱鱼精子DNA均购买自Sigma生物公司，由于购买这些的DNA样品本身是用于物理化学分析，其并未给出准确的序列片段，因此本申请仅提供简单的图谱测定结果。
结论
1）本发明利用新型纳米材料（rGO-NH）成功构建了一种用于电化学检测碱基的生物传感器，且制作简单，检测环境温和，检测灵敏度高，稳定性强。
2）在一定pH范围内，不同碱基随pH改变，其检测的峰值电位与pH呈现良好的线性关系，不同碱基检测过程中传递的电子和质子数量是一致的。
3）本发明生物传感器能够实现碱基的同时检测，且有较低的的检测限和明显的检测范围，其三种碱基的检测限和检测范围分别为：
A：0.2μM、0.2μM－50μM；
G：0.1μM、0.1μM－40μM；
T：2.0μM、10μM－17000μM。
4）本发明所构建的生物传感器体系能够完成实际样品的检测，为实际应用奠定了理论基础。

Claims (2)

1.一种利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器，该生物传感器包括工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，所述工作电极为哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰的玻碳电极，其经下述步骤获得：
1）将壳聚糖溶液和哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液等体积混合后，超声分散0.5－1h，然后静置1－3h获得复合材料，再次超声震荡、漩涡分散均匀后，滴加到洁净的玻碳电极表面，晾干成膜；
2）在步骤1）所得玻碳电极的膜表面滴加全氟磺酸溶液，晾干成膜，即得。
2.如权利要求1所述利用哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯修饰工作电极构建的用于检测DNA碱基的生物传感器，其特征在于，步骤1）中，所述壳聚糖溶液浓度为0.5wt%，哌嗪修饰的还原性氧化石墨烯溶液浓度为4mg/ml。
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