CN105400795B - 改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的方法 - Google Patents

改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点（RBS）改造技术。将大肠杆菌密码子优化后的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP‑2）基因（具有SEQ ID NO. 1核苷酸序列的DNA）克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中RBS改变为新的RBS（具有SEQ ID NO. 2核苷酸序列的DNA）得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP01分别导入大肠杆菌BL21得到sHJBMP01和sHJBMP02本发明提供的RBS改造后的sHJBMP02生产rhBMP‑2的发酵单位提高到136.3mg/L。

Description

改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发 生蛋白2产量的方法
技术领域
本发明涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点(RBS)改造技术。
背景技术
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是一类酸性糖蛋白，属转化生长因子超家族成员，这种蛋白质具有使未分化间充质定向分化为成骨细胞，并进而合成胶原、形成钙化骨组织能力。天然BMP能够诱导促进骨和软骨的形成，并可以与多种载体形成骨修复材料，广泛的应用于治疗新鲜骨折、骨缺损、骨不连、脊椎融合、股骨头坏死等骨科临床治疗。在已知的近20种BMP中，骨形态发生蛋白2(BMP-2)的诱导成骨活性最强，被研究和应用的最为广泛。但是天然BMP-2含量稀少、提取成本高昂，临床应用严重受限。
近年来的研究表明重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)具有较高的安全性和有效性，它由114个氨基酸残基组成，具有显著的成骨诱导能力，体外试验无细胞毒性，生物相容性良好，美国FDA于2002年7月批准rhBMP-2上市用于治疗脊椎融合。现在rhBMP-2已被应用于外科整形手术诱导骨再生，在骨组织工程及骨修复领域展现了巨大的潜在应用价值，成为临床骨科创伤疾病防治研究的热点。
本发明提供了改造核糖体结合位点(RBS)提高基因工程菌株生产rhBMP-2的产量的方法，以及1株RBS改造后的的基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量比出发菌株提高了48％左右，达到136.3mg/L，遗传性状稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产。
发明内容
发明目的
提供了改造RBS提高基因工程菌株生产rhBMP-2的产量的方法，以及1株RBS改造后的基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量比RBS改造前的出发菌株sHJBMP01提高了48％左右，遗传性状稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产。
技术方案
大肠杆菌密码子优化后的rhBMP-2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
新的RBS，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
同时含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1的DNA和含有核苷酸序列为SEQ ID NO.2的DNA的菌株sHJBMP02。
改造RBS构建基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02的方法，将具有SEQ ID NO.1序列的DNA克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中的RBS改变为具有SEQ ID NO.2序列的DNA得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP02分别导入大肠杆菌BL21得到2株基因工程菌株sHJBMP01和sHJBMP02，2个菌株均可以生产rhBMP-2。
本发明的有益效果：提供了1株RBS改造后的基因工程菌株sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量稳定在136.3mg/L左右，比RBS改造前的出发菌株sHJBMP01提高了48％左右，该菌株生长速度快，遗传性状稳定，适合于在工业化生产rhBMP-2。
附图说明
图1是质粒pHJBMP01的构建示意图(A)和质粒pHJBMP02的构建示意图(B)。
图2是通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的生产与分离纯化各个过程。(A)sHJBMP01生产rhBMP-2以及分离纯化；(B)sHJBMP02生产rhBMP-2以及分离纯化。泳道M：蛋白质分子量标准；1：全菌蛋白；2：BufferA溶解的蛋白；3：Buffer B溶解的蛋白；4：Solution I溶解的蛋白；5：Solution I溶解的蛋白经过镍离子亲和层析柱的流出液；6：用Solution II洗涤镍离子亲和层析柱的流出液；7：用Solution III洗脱镍离子亲和层析柱的流出液组分一；8：用Solution III洗脱镍离子亲和层析柱的流出液组分二；9：用Solution III洗脱镍离子亲和层析柱的流出液组分三。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例中所使用的液体LB培养基成分：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，所述百分含量均为质量百分含量。实施例中所使用的固体LB培养基成分，在液体LB培养基中加入1.5％琼脂(质量百分含量)。
实施例1 rhBMP-2基因的获得
rhBMP-2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，由上海生工生物工程公司合成。
实施例2 sHJBMP01的获得
SEQ ID NO.1的DNA序列通过DNA人工合成得到，合成后的5'端带有NdeI粘性末端，3'端带有XhoI粘性末端，把SEQ ID NO.1的DNA克隆到质粒pET28a(购自Novagen公司)的NdeI/XhoI位点之中得到质粒pHJBMP01(图1A)；把质粒pHJBMP01转化到大肠杆菌BL21(购自上海浩然生物技术有限公司)中得到菌株sHJBMP01，。
实施例3 sHJBMP02的获得
通过聚合酶链式反应(PCR)得到pHJBMP02，其反应液成分为：pHJBMP01，50ng；寡核苷酸片段(DNA序列ataattttgtttaactttaaacaggaaacataccatgggcagcagccat，见SEQ NO：3)，0.3μM；寡核苷酸片段(DNA序列atggctgctgcccatggtatgtttcctgtttaaagttaaacaaaattat，见SEQ NO：4)，0.3μM；dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，各0.2mM；MgSO4，1.5mM；KOD-Plus-Neo(TOYOBO公司)，1U；10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo(TOYOBO公司)，5μl；加水将总体积补至50μl。其PCR反应条件为：94℃，2min；98℃，10sec，68℃，4min，重复30个循环；68℃，10min。以上反应液加入DpnI(New England Biolabs公司)10units，37℃，1hour。取5μl转化大肠杆菌BL21，挑选单克隆菌落，提取质粒，经过DNA测序正确的质粒命名为pHJBMP02，含有pHJBMP02的BL21命名为菌株sHJBMP02。
实施例4 sHJBMP01和sHJBMP02生产rhBMP-2
分别将sHJBMP01和sHJBMP02接种到含有50μg/L卡那霉素的固体LB培养基中，37℃培养箱中过夜；分别挑选单克隆接种到5mL含有50μg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm，培养16小时；再分别接种至100mL含有50μg/L卡那霉素的液体LB培养基中，接种量1％，37℃，200rpm，培养至OD600为0.6左右，分别加入IPTG至终浓度为0.4mM，37℃，200rpm培养5小时。
实施例5 rhBMP-2的分离纯化
分别将sHJBMP01和sHJBMP02的发酵液100mL离心取菌体；菌体加入10mL Buffer A(50mMTris-HCl，pH8.0)，超声破菌，离心取沉淀；沉淀加入10mL Buffer B(含有2M尿素的Buffer A)洗涤，离心取沉淀；沉淀加入10mL Solution I(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mMTris-HCl，pH8.0)洗涤，离心取上清；取0.5mL上清加入0.2mL镍离子亲和树脂(Ni-NTA，购自Novagen公司)，混匀，离心弃去上清；镍离子亲和树脂用1mL Solution II(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mMTris-HCl，pH6.3)洗涤2次；镍离子亲和树脂用1mL Solution III(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mMTris-HCl，pH4.2)洗脱4次，分别收集上清。
以上各个步骤的组分通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其纯度和回收率，纯化后的rhBMP-2通过Bradford蛋白定量试剂确定蛋白浓度。所得蛋白质经检测是正确的氨基酸序列，与标准品rhBMP-2序列一致。
实施例4 sHJBMP01和sHJBMP02生产rhBMP-2的稳定性
含有20％甘油的sHJBMP01和sHJBMP02菌液，在-80℃保存6个月；分别接种到含有50μg/L卡那霉素的固体LB培养基中，37℃培养箱中过夜；分别挑选单克隆接种到5mL含有50μg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm，培养16小时；再分别接种至100mL含有50μg/L卡那霉素的液体LB培养基中，接种量1％，37℃，200rpm，培养至OD600为0.6左右，分别加入IPTG至终浓度为0.4mM，37℃，200rpm培养5小时。sHJBMP01和sHJBMP02生产rhBMP-2的发酵单位分别稳定在92.2mg/L和136.3mg/L左右。
SEQUENCE LISTING
<110>南京江辉生物科技有限公司
<120>改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的
方法
<130>
<160> 4
<170>PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
atgcaggccaaacataaacagcgcaaacgcctgaaatcttcttgtaaacgtcatccgtta 60
tatgttgattttagtgatgtgggttggaatgattggatcgttgctcctccgggctatcat 120
gcgttttattgtcatggcgaatgtccagaacctctggccgatcatctgaatagcacgaat 180
catgctatcgtgcagaccttagttaattcagttaactccaaaatccctaaagcatgttgt 240
gtgcctaccgaactgagcgcgatctcaatgctgtacctggatgaaaatgagaaagtggtt 300
ctgaaaaattatcaggatatggtggtggaaggctgcggctgtcgctaa 348
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
acaggaaac 9
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
ataattttgtttaactttaaacaggaaacataccatgggcagcagccat 49
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
atggctgctgcccatggtatgtttcctgtttaaagttaaacaaaattat 49

Claims (4)

1.核糖体结合位点RBS，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
2.一种含有权利要求1所述核糖体结合位点的第二质粒。
3.一种构建含有权利要求2所述质粒的工程菌株的方法，其特征在于按如下步骤实现：将具有SEQ ID NO. 1序列的DNA克隆到质粒pET28a中得到第一质粒；将第一质粒中的RBS改变为权利要求1所述RBS，得到第二质粒；将第二质粒导入大肠杆菌BL21得到工程菌株。
4.根据权利要求3所述的工程菌株的方法，其特征在于所述的第二质粒由如下方法获得：第一质粒作为模板，以引物ata att ttg ttt aac ttt aaa cag gaa aca tac cat gggcag cag cca t和atg gct gct gcc cat ggt atg ttt cct gtt taa agt taa aca aaatta t，通过PCR反应得到第二质粒。
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Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略;余越春等;《工业微生物》;20140430;第44卷(第2期);第3节讨论，图2A，第2.1-2.2节 *

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