本发明目的为氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。针对目前治疗乙肝药物上述(1),(2)类不能从根本治疗乙肝,第(3)类药物可抑制DNA复制,可使部分病人HBV-DNA转阴,但有“反跳”现象,而且价格昂贵。为此,根据氧化苦参碱可抑制乙肝病毒复制的特性,提供用氧化苦参碱制备的治疗乙型肝炎的药物。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
氧化苦参碱是从苦参和苦豆子中提取的一种白色固体,其分子式C15H24N2O2,纯度在99%以上,余量是水分。用无热源去离子的纯净蒸馏水将氧化苦参碱溶解,配制成100mg/ml的注射剂-即苦参素注射液。以往用于治疗肿瘤在化疗或放疗后引起的白血球减少,以及其它原因引起的白血球减少症,有效率达85%以上。在大量临床治疗白血球减少症过程中,苦参素注射液对乙型肝炎也有很好的治疗作用,为此,利用苦参素注射液治疗乙型肝炎,进行了大量的科学实验和临床验证工作,进一步证实氧化苦参碱是制备治疗乙型肝炎的有效药物。具体实验和临床结果分述于下:
一、动物实验:在上海市传染病院肝炎研究室进行。
1、毒性试验:以昆明种小鼠腹腔注射氧化苦参碱制备的苦参素注射液,LD50为750mg/Kg,静脉注射LD50为150mg/Kg,以北京大耳自家兔静脉注射,LD50为120mg/Kg。结果说明该药物毒性非常低,临床使用安全。
2、苦参素注射液的药理、病理、抗乙型肝炎病毒(HBV)试验:
(一)实验方法:选择十月龄不分性别但体重相近的麻鸭,随机分组,在相同条件下饲养。鸭乙型肝炎(DHB)模型是以鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染制作。
实验用苦参素注射液,即实施例1所生产的制剂,分为0.05g/Kg、0.15g/kg和0.45g/kg三个治疗组;阿昔洛韦治疗对照组,剂量为100mg/Kg;DHBV-DNA阳性对照组;DHBV-DNA阴性对照组和健康麻鸭苦参素治疗组,各组均为12只。
各组均采用腿部肌肉注射途径给药,每周3次,隔日给药,连续12周。DHBV DNA(+)和DHBV DNA(-)两个对照组肌肉注射生理盐水(1ml/kg)。以上各组麻鸭分别在给药前、给药第四周、第八周、第十二周和停药后第二周同时静脉采血,作血清DHBV DNA斑点杂交试验。在停药后第二周,各组麻鸭同时放血至死,取肝脏,置于福尔马林固定液和2.5%戊二醛固定液中保存,作鸭肝的光学显微镜和电子显微镜检查。
(二)、实验结果:
①、药理作用:静脉注射后,氧化苦参碱进入细胞内的微粒体,作用细胞代谢酶,特别是进入肝细胞的微粒体,作用于乙肝病毒,各组麻鸭血清DHBV DNA测定,如表1所示。
表1各实验组和对照组麻鸭清血清DHBV DNA含量测定结果
用药剂量 |
麻鸭编号 |
采血时间 |
统计学检 验 |
给药前 |
给药四周 |
第8周 |
第12周 |
停药两周 |
苦参素注射液0.05g/Kg | A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12 | +++++++++++++++++++++++++++ | ++++++++++++++++++++++++++++++ | +++++++++++++++++++- | ++++-+++++-+++++-++ | +++++++-+++++++-+++++++- | P<0.5 |
苦参素注射液0.15g/Kg |
B1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11B12 |
++++++++++++++++++++++++++++++++ |
+++++++++++++++++++++++++++++++++ |
++++---+++++++ |
++++++++-++-++++++++ |
+-+++-++-++死亡++ | P<0.05 |
苦参素注射液0.45g/Kg |
C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12 |
++++++++++++++++++++++++++++ |
-+++++++++++++++++++++++++ |
++++++++++-+++++++-++ |
++++++--++++++++ |
----+++++-+-++++ | P<0.05 |
用药剂量 |
麻鸭编号 |
采血时间 |
统计学检 验 |
给药前 |
给药四周 |
第8周 |
第12周 |
停药两周 |
DHBV-DNA阳性对照 | D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10D11D12 | ++++++++++++-+++++++++ | +++++++++++++++++ | ++++++-+-+++++++ | ++++++++++++++++++ | +++++-++++++-+++++++ | P>0.05 |
DHBV-DNA阴性对照 |
E1E2E3E4E5E6E7E8E9E10E11E12 |
------------ |
------------ |
------------ |
------------ |
------------ | P<0.05 |
阿昔洛韦药物对照组0.1g/Kg |
F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12 |
++++++++++++++++++++++++++++ |
------++-++-- |
-------+-+-- |
------------ |
+++++++-+++++++++++++++++++ | P<0.05 |
注:表中++++相当于DHBV DNA含量为100Pg;+++为50Pg;++为25Pg;+为10Pg,
数据经自然对数转换后作自身前后比较的方差分析,用药前后有显著性差异。
从表1可以看出,苦参素注射液三个不同剂量组麻鸭血清DHBV-DNA含量在用药前后有显著的变化,用药八周后DHBV DNA含量即有不同程度的下降;用药十二周时,DHBV DNA平均含量分别下降42.6%、61.97%和65.50%,在停药后2周分别有2,2和5只麻鸭血清DHBV DNA转为阴性,其中0.45g/kg组DNA转阴率达41.7%,显示苦参素注射液有较明显的抗病毒作用,能抑制鸭乙肝病毒DNA的复制,降低血清DHBV DNA含量。此外,在血清中HBVDNA含量在苦参素注射液停药后第2周仍能维持于停药时的水平,未见有阿昔洛韦组的停药后“反跳”现象,表明苦参素注射液有持续抗病毒复制作用,图1所示阿昔洛韦组在停药两周以后,曲线又开始上升。
②、各组麻鸭病理检查试验:
1、实验组和对照组鸭肝光镜检查结果如表2所示:
从表2可以看出,DHBV DNA阳性对照组麻鸭肝组织炎性改变个体之间差别较大,以"+"变化加权法计算,平均为1.0625,炎症改变类似慢性肝炎的变化,肝组织汇管区炎症和小叶实质炎症明显,肝细胞肿胀显著,窦细胞活跃,汇管区胆管增生,有界板破坏和碎屑样坏死。DHBV DNA(-)对照组麻鸭肝组织炎性改变不大,平均加权为0.5417。阿昔洛韦组变化与DHBV-DNA(-)组相似。苦参素注射液组的肝脏病理有所改善,三个剂量组的平均加权为0.6969,肝组织炎症减轻,表明苦参素注射液有较明显的改善肝脏病变作用。
2、各组电镜观察结果:见附图2,3,4,5,6,7所示,结果表明:
(1)DHBV DNA阴性组:肝细胞(1)内线粒体与内质网较丰富,糖元颗粒丰富,分散存在。肝窦内皮细胞和窦壁完好,内有枯否氏细胞。细胞间纤维(2)连接紧密。
(2)DHBV DNA阳性组:在肝小叶边缘的肝细胞完整,内有较多脂粒(3),但靠近中央静脉处,有些肝细胞核(4)被挤向一边,胞内有大的脂滴。肝窦内枯否氏细胞作活跃的变形运动,在有的肝窦与肝细胞之间有较多增生纤维和少量坏死物质,肝细胞表面有较多微绒毛伸入狄氏腔。肝细胞间连接较松,少见紧密。
(3)阿昔洛韦对照组:多数肝细胞均较完好,与DHBV DNA阴性对照组基本相似,特别是小叶边缘肝细胞基本完好。有较多双核肝细胞,有些肝细胞的细胞器有浓缩的迹象,肝窦内有较多贮脂细胞。
(4)苦参素注射液低剂量组:绝大多数肝细胞结构类似阿昔洛韦对照组,肝细胞核居中,胞浆内线粒体和内网质较丰富,糖元颗粒也较多。在靠汇管区的肝细胞内,可见少量细胞器坏死碎片和较大的脂粒,有些肝细胞的外侧有少量增生纤维。
(5)苦参素注射液中剂量组:肝细胞核正常,胞浆内线粒体等细胞器丰富,糖元颗粒少见。有些肝细胞内有较大的脂滴,肝窦内皮细胞有坏死,枯否氏细胞内可见较多吞食的坏死细胞残体。肝细胞间连接较松,紧密连接少见。
(6)苦参素注射高剂量组:肝细胞核完好居中。多数肝细胞内有大的脂滴,细胞器较少,糖元颗粒少见。细胞间有间隙,紧密连接少见。肝窦内有坏死细胞残体,但枯否氏细胞的伪足没有吞食包。
综上所述,得出下述结论:
(1)苦参素注射液有较好的抗病毒作用,能抑制乙肝病毒DNA的复制、降低血清DHBV-DNA含量,三个试验组在用药第12周时,DHBV-DNA平均含量分别下降42.60%,61.97%和65.5%,尤以高剂量组的血清DHB-DNA转为阴性更为明显,转阴率达41.7%。
(2)血清DNA含量在苦参素注射液停药后第二周仍能维持停药时的水平,未见有其它药物所常见的停药后的反跳现象。
(3)苦参素注射液可减轻鸭肝炎症,对肝脏超微结构的病理具有改善作用,对肝细胞本身无任何毒性作用。
由此可见,苦参素治疗乙型肝炎的药理机制主要通过抑制肝炎病毒复制。
二、临床治疗:
由上海市传染病医院、南汇县传染病医院、南市区传染病医院和徐汇区医院用氧化苦参碱制备的苦参素注射液治疗慢性乙型肝炎121例,其中男病例98例,女性23例,年龄为18-60岁,按照全国第三次病毒性肝炎学术会议制订的慢性乙型肝炎诊疗标准,121例病人中慢性迁延性肝炎70例,慢性活动性肝炎51例。121例病人血清HBsAg或HBe Ag或抗HBc为阳性,HBV DNA 40例阳性,经肌肉注射苦参素治疗,200mg/支,每日2-4支,连续一个月为一个疗程,治疗三个疗程,分别对乙肝抗原和抗体指标,临床症状和体征和化验结果见表3,4,5。
表3苦参素治疗前后HBVM变化乙肝指标 治疗前(+)例数 治疗后(-)例数 %HBsAg 119 8 7抗HBs 120 1 0.8抗HBc 119 4 3抗HBcIgM 52 26 50HBeAg 121 62 51抗HBe 121 19 16HBV-DNA 40 14 35
表4苦参素治疗后症状与体征改善比较症状体征 存在例数 消失例数 %乏力 104 83 80纳差 93 79 85腹胀 55 53 96肝痛 71 60 86面色黝黑 18 7 39关节酸痛 20 14 70出血 13 10 77失眠 28 9 32肝肿大 59 23 39脾肿大 16 3 19
表5苦参素治疗后ALT和SB变化统计
治疗恢复正常例数化验 总例数 升高例数 合计 恢复率%指标 4周 8周 12周ALT 121 120 29 38 29 96 80SB 121 40 20 12 4 39 90
从表3,4,5得出如下结果:
1.苦参素注射液有较好的抑制乙肝病毒的作用,病人血清HBeAg转阴率为51.0%,HBV-DNA转阴率为35%。
2.苦参素注射液对慢性乙型肝炎有较好的改善临床症状的作用,如乏力、纳差和肝痛,有效率为80.5-86.2%。
3、苦参素注射液对慢性乙型肝炎有较好的降酶除黄效果,ALT复常率为80%,SB复常率为90%。
三、药效对比观察:
在上海长征医院用苦参素与胸腺肽注射液进行药效对比观察,每组20例,并作肝脏穿刺病理检查,结果见表6。
表6 苦参素与胸腺肽治疗前后HBeAg及HBV-DNA比较
HBeAg HBV-DNA ALT组 别 复常
病例数 阴转例 阴转率 阴转例 阴转率 例数治疗组 20 10 (10/20)50% 9 (9/20)45% 18对照组 20 2 (2/20)10% 1 (1/20)5% 16*HBeAg阴转率治疗组对照组相比P<0.05,有显著性差异HBV-DNA治疗组与对照组相比P<0.05,有显著性差异
结果证明苦参素有显著改善症状,降低ALT和清除乙肝病毒作用。
在上海市第八人民医院以苦参素与无环鸟苷注射液进行药效对比观察,结果见表7。
表7两组治疗前后HBVM变化
治疗组(N=20) 对照组(N=16)指标 P值
阳性例数 转阴例数 % 阳性例数 转阴例数 %HBsAg 20 0 0 16 0 0HBeAg 16 7 43.8 15 7 46.7 >0.05HBV-DNA 4 2 50.0 5 2 40.0 >0.05
结果表明,苦参素注射液和无环鸟苷都有明显抑制肝炎病毒复制和乙肝抗原转阴作用,但无环鸟苷对人体有毒害作用和反跳现象。
四、毒副作用的临床实验观察:
苦参素注射液治疗了121例,在治疗前、后均检查外周血象,血红蛋白11.5克,红血球290万-380万,白血球4500-6700立方毫米,胸透全部阴性,心电图无异常,肾功能:尿素,肌酐均在正常范围之内,尿常规未见红、白血球、蛋白质、管型。治疗期间及结束后未见发热、皮疹、恶心呕吐、腹泻等消化道症状。
本发明技术与已有的技术相比,具有如下的优点及效果:
1、本发明将氧化苦参碱用于制造治疗乙肝药物-苦参素注射液,能抑制乙型肝炎病毒,改善临床症状,效果明显,优于其它治疗乙肝药物。
2、苦参素注射液经毒性试验和临床观察,证明无毒付作用。
3、制造氧化苦参碱制剂,设备简单,制造容易,价格低廉,治疗方便。