CN105348186A - 氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用，该类化合物具有通式（I）的结构，其合成方法包括：以4-氯吡啶-2-甲酸甲酯为原料，与甲胺或氘代甲胺进行取代反应后，再与对氨基苯酚或氘代对氨基苯酚进行缩合，然后与4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯或氘代4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯反应制得氘代双芳基脲类化合物。经实验证明，本发明提供的氘代双芳基脲类化合物具有治疗肿瘤的作用，本发明还提供了研究与开发所述化合物的抗肿瘤药物的应用。

Description

氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于化学和医药技术领域，涉及医药化合物及其制备方法和应用，具体涉及氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
索拉非尼(Sorafenib，4-{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)酰脲]苯氧基}吡啶-2-甲酰胺)是由德国拜耳公司和美国Onyx公司共同开发的第一个口服多激酶抑制剂，也是被批准用于治疗晚期肝癌的唯一药物。新近也被批准用于治疗人体甲状腺癌。
临床资料显示，索拉非尼单药的标准治疗方案，对于晚期肾癌的完全缓解(CR)、部分缓解(PR)率不高。另外，肝细胞癌对于索拉非尼极易产生耐药性，这可能是限制该药进一步使用的主要障碍。另外，随着索拉非尼的广泛应用，其毒副作用也逐渐显现出来。在治疗肝细胞癌时，索拉非尼会引起剂量依赖性皮肤毒性，如皮疹、脱屑、手足综合征、黏膜炎、脱发、瘙痒、干燥等毒副作用，这为该药物的继续使用增加了极大的难度。
索拉非尼的化学结构式如下:
索拉非尼分子式为C21H16ClF3N4O3，分子量464.82，CAS号284461-73-0。
氘是氢的一种稳定非放射性同位素，重量为2.0144。由于生成的氘代化合物中的氘含量远远高于自然界中0.015％的含量，所以可以将其看做是一种新型的化合物。氘代对于药物的改善也得到了美国专利与商标局的认可，如氘代利莫那班(Rimonabant)、莫沙比利(Mosapride)、奥昔布宁(Oxybutynin)等专利都已经被批准。
研究表明，氘在药物设计中是目前最好的生物电子等排体，并且氘代作用可以减少种群和性别不同引起的药效和毒性差异、减少病人间的个体差异、通过减少有害代谢物降低不良反应事件的发生、还可以减少基因毒性等，因此氘代作用已被广泛应用于人类临床研究以及药物研发过程中的药代动力学研究。目前国际上已有多家制药企业在从事氘代新药的研发，并已有多个氘代药物进入临床实验，如CTP-347、CTP-499等。
氘的重要特点是其在药物分子中的形状和体积与氢基本上相同，如果药物分子中的氢被选择性的替换为氘，氘代药物一般还会保留原来的生物活性和选择性。实验证明，碳-氘键的结合比碳-氢键更加稳定。携带中子的氘与碳形成的碳-氘键在较低的频率振动，因而强于碳-氢键。这一强度的增加,可直接影响某些药物的吸收、分布、代谢和排泄等属性，从而提高药物的疗效、安全性和耐受性。因此理论认为，如果药物分子中将被分解的某个特定的碳-氢键被氘代为相应的碳-氘键后，将会延缓其分解过程，使氘代药物在身体里作用的时间更长，成为效果更优于原来的药物。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提供了氘代双芳基脲类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤的药物中的应用，本发明还提供了氘代双芳基脲类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是用于制备治疗人体肝癌、人体肺癌、人体肾癌、人体甲状腺癌、人体结肠癌、人体胃癌、人体乳腺癌和黑色素瘤的药物。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
氘代双芳基脲类化合物，其结构通式如式(I)所示：
式中取代基R1-R7均为氘或氢；R1-R7中至少一个取代基为氘。
进一步的，所述氘代双芳基脲类化合物为D1、D2、D3、D4、D5和D6，其结构式如下所示：
本发明还提供了合成所述氘代双芳基脲类化合物的含氘中间体，其具有它通式(II)所示结构：
其中取代基R1-R3均为氘或氢，R4-R5均为氘。
进一步的，所述含氘中间体具体为：4-(2,6-二氘-4-氨基苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺和4-(2,6-二氘-4-氨基苯氧基)-N-甲基吡啶-2-三氘甲酰胺。
本发明还提供了所述的氘代双芳基脲类化合物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)4-氯吡啶-2-甲酸甲酯发生取代反应，形成酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b；
所述酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b结构式如下：
(2)所述酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b再发生醚化反应，形成醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f；
所述醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f结构式如下：
(3)所述醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f与4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯或含氘4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯发生缩合反应，形成所述氘代双芳基脲类化合物。
进一步的，所述步骤(1)中酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b的制备方法为：将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯与甲胺进行取代反应，得到酰胺化合物a；或将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯与氘代甲胺进行取代反应，得到含氘酰胺化合物b。
进一步的，所述步骤(2)中醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f的制备方法为：
将所述酰胺化合物a与对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物c；
或将所述含氘酰胺化合物b与对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物d；
或将所述酰胺化合物a与含氘对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物e；
或将所述含氘酰胺化合物b与含氘对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物f。
本发明还提供了所述的氘代双芳基脲类化合物以及药学上可接受的盐在制备抗肿瘤的药物中的应用。
进一步的，所述药学上可接受的盐包括无机酸和有机酸衍生的盐；
所述无机酸和有机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸和杏仁酸。
进一步的，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌，乳腺癌和黑色素瘤。
本发明的优点和技术效果是：本发明提供了氘代双芳基脲类化合物，该类化合物合成方法包括：先将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯发生取代反应，形成酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b，再发生醚化反应，形成醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f，最后与4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯或含氘4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯发生缩合反应形成氘代双芳基脲类化合物。同时，本发明也提供了一种高效的含氘中间体及其合成方法。经实验证明本发明提供的氘代双芳基脲类化合物具有治疗肝癌、肾癌和乳腺癌的作用，本发明提供了研究与开发所述相关化合物的抗肿瘤药物的方法。
附图说明
图1是本发明化合物D1-D7的血浆代谢稳定性实验结果；
图2是索拉非尼、D1、D4、D6化合物肝微粒体代谢稳定性实验结果；
图3是Wistar大鼠口服D1、D4、D6和索拉非尼3mg·kg-1后血浆中D1、D4、D6和索拉非尼的浓度时间曲线(n＝5)。
具体实施方式
下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。
本发明提供了氘代双芳基脲类化合物其结构通式如式(I)所示：
式中取代基R1、R1、R1、R1、R1、R1和R7均为氘或氢；R1-R7中至少一个取代基为氘。
实施例1：化合物D1的合成路线如下：
(1)将3g4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于8毫升质量比为40％的甲胺水溶液，室温反应3小时，反应完全后，加入二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干得油状物，收率87％，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用；取700mg1,5-二氘-4-对氨基苯酚加入到10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入815mg叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕；加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率61％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，再慢慢滴加412mg2,6-二氘-4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D1，收率87.1％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝2.76(d，3H，J＝4Hz)，7.12～7.16(m，1H)，7.36(d，1H，J＝2Hz)，7.57～7.63(m，3H)，8.48(d，1H，J＝4.4Hz)，8.73～8.74(m，1H)，8.98(s，1H)，9.20(s，1H)ppm.ESI-MS：(m/z)＝469[M+H]+。
实施例2：化合物D2的合成路线如下：
(1)先将206mg4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于四氢呋喃备用；再取100mg氘代甲胺盐酸盐加入水溶解后再加入242mg三乙胺，加毕，然后滴入到上述四氢呋喃溶液中，室温反应3小时，反应完全后，加水和二氯甲烷萃取，分出有机层，干燥，浓缩蒸干得油状物，收率78％，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用，取700mg1,5-二氘-4氨基苯酚加入到10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入815mg叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕；加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率58.3％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加409mg4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D2，收率78.9％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.14～7.15(m，1H)，7.37(s，1H)，7.59～7.67(m，4H)，8.12(s，1H)，8.50(d，1H，J＝4.4Hz)，8.75(s，1H)，9.01(s，1H)，9.23(s，1H)ppm.13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ＝109.07,114.46,120.83,123.56,132.46,137.49,139.78,148.15,150.82,152.89,152.91,164.24,166.41ppm.ESI-MS：(m/z)＝470[M+H]+。
实施例3：化合物D3的合成路线如下：
(1)将206mg4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于四氢呋喃备用；将100mg氘代甲胺盐酸盐加入水溶解后再加入242mg三乙胺，加毕，滴入到上述四氢呋喃溶液中，室温反应，反应完全后，加水和二氯甲烷萃取，分出有机层，干燥，浓缩蒸干得油状物，收率78％，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用，取1.81g对氨基苯酚加入25毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入2.5g叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕，加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率56.2％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加412mg2,6-二氘-4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D3，收率84.2％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝2.75(d，3H，J＝3.6Hz)，7.11～7.14(m，3H)，7.15(s，1H)，7.56～7.59(m，3H)，8.47(d，1H，J＝4.4Hz)，8.73(s，1H)，8.97(s，1H)，9.18(s，1H)ppm.ESI-MS：(m/z)＝467[M+H]+。
实施例4：化合物D4的合成路线如下：
(1)将3g4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于8毫升质量比为40％的甲胺水溶液，室温反应，反应完全后，加入二氯甲烷萃取，干燥，浓缩蒸干得油状物，收率87％，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用；取489mg对氨基苯酚加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入579mg叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕，加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率64.7％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加412mg2,6-二氘-4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D4，收率73.7％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.14～7.18(m，3H)，7.37(s，1H)，7.58～7.60(m，3H)，8.50(d，1H，J＝4.4Hz)，8.73(s，1H)，9.00(s，1H)，9.22(s，1H)ppm.ESI-MS：(m/z)＝470[M+H]+。
实施例5：化合物D5的合成路线如下：
(1)将206mg4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于四氢呋喃备用；取100mg氘代甲胺盐酸盐加入水溶解后再加入242mg三乙胺，加毕，滴入上述四氢呋喃溶液中，室温反应，反应完全后，加水和二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干得油状液体物，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用，取700mg1,5-二氘-4-氨基苯酚加入到10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入815mg叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕，加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率58.3％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加412mg2,6-二氘-4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D5，收率73.7％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.12～7.13(m，1H)，7.36(d，1H，J＝1.6Hz)，7.57～7.60(m，3H)，8.48(d，1H，J＝4.4Hz)，8.71(s，1H)，8.98(s，1H)，9.20(s，1H)ppm.ESI-MS：(m/z)＝472[M+H]+。
实施例6：化合物D6的合成路线如下：
(1)将3g4-氯吡啶-2-甲酸甲酯溶于8毫升质量比为40％的甲胺水溶液，室温反应，反应完全后，加入二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干得油状物，收率87％，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物溶于四氢呋喃备用；700mg1,5-二氘-4-对氨基苯酚加入到10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入815mg叔丁醇钾，然后滴加上述溶解油状物的四氢呋喃溶液，滴毕，加热到100℃反应，反应完全后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率61％。
(3)将上述白色固体溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加409mg4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯的二氯甲烷溶液，滴毕，升至室温反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D6，收率35.6％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝2.76(d，3H，J＝4Hz)，7.12～7.16(m，1H)，7.36(d，1H，J＝2Hz)，7.57～7.65(m，4H)，8.09(d，1H，J＝2Hz)，8.48(d，1H，J＝4.8Hz)，8.72～8.74(m，1H)，8.98(s，1H)，9.20(s，1H)ppm.ESI-MS：(m/z)＝467[M+H]+。
实施例7：化合物D7的合成路线如下：
(1)将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯(206mg，1.2mmol)溶于2毫升四氢呋喃备用；将氘代甲胺盐酸盐(100mg，1.45mmol)加入2毫升水溶解后再加入三乙胺(242mg，2.4mmol)，加毕，然后滴入到上述四氢呋喃溶液中，室温反应16小时，反应完全后，减压回收四氢呋喃,剩余物加水和二氯甲烷各10毫升萃取，分出有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干得油状液体物，直接用于下步反应。
(2)将步骤(1)所述油状物(600mg，3.45mmol)溶于2.5毫升四氢呋喃备用；将对氨基苯酚(488.8mg，4.48mmol)加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入叔丁醇钾(579mg，5.18mmol)，氮气保护后，室温搅拌1小时，然后滴加上述四氢呋喃溶液，滴毕，加热到100℃反应2小时，反应完全后，将反应液倒入30毫升水中，10毫升二氯甲烷萃取两次，合并有机相，10毫升盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体，收率64.7％。
(3)将上述白色固体(295mg，1.2mmol)溶于10毫升二氯甲烷，冷却到0℃后，慢慢滴加4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯(409mg，1.85mmol)的二氯甲烷溶液，滴毕，反应15分钟后升至室温过夜反应，反应完全后，浓缩蒸干，柱层析纯化得白色固体D7，收率35.6％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.13～7.17(m，3H)，7.36(d，1H，J＝2Hz)，7.57～7.66(m，4H)，8.11(d，1H，J＝4.8Hz)，8.74(d，1H，J＝4.4Hz)，9.01(s，1H)，9.23(s，1H)ppm.13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ＝109.07,114.47,117.23,120.94,122.76,127.26,132.46,137.51,139.78,148.24,150.83,152.89,152.92,164.24,166.41ppm.ESI-MS：(m/z)＝468[M+H]+。
实施例8：体外血浆代谢稳定性实验
索拉非尼氘代系列化合物10μmol/mL溶液的配制：取1mg/mL溶液吸取10μL，加入990μL的甲醇水(1:1)稀释为10μg/mL溶液，取10μg/mL溶液465.3μL，加入甲醇水(1:1)溶液534.7μL，配置为1mL的浓度为10μmol/mL的索拉非尼溶液。
Wistar大鼠新鲜血浆的制备：取200g左右重的大鼠，心脏取血，肝素钠抗凝，8000r/min，4℃下离心10min，取血浆。
孵育体系200μL，对应96孔板，依次加入180μL的血浆和20μL的10μmol/L的测试样品。样品混均匀后放入37℃的水浴震荡器中孵育，分别于0,5,10,20,40,60,90,120min加入300μL的含内标的乙腈终止液(浓度为100ng/mL的普萘洛尔的乙腈溶液)。反应混合溶液14000rpm，4℃离心15min，小心吸取上清液至进样小瓶中，LC-MS/MS检测每个化合物的剩余量，结果如图1。图1的实验结果表明，索拉非尼氘代系列化合物D1，D4，D6和D7在大鼠血浆中不能被代谢，说明索拉非尼氘代系列化合物D1，D4，D6和D7在血浆中稳定。化合物D2，D3，D5在大鼠血浆中被代谢，说明化合物D2，D3，D5在血浆中不稳定。
实施例9：体外肝微粒体代谢稳定性实验
溶液的配制：(1)K2HPO4缓冲液的配制：K2HPO45.706g，500mL三蒸水溶解，用HCl调节pH至7.4，浓度为50mmol/L。(2)大鼠的肝微粒体(浓度为20mg/mL)--孵育终浓度为0.5mg/mL；(3)待测试化合物标准溶液的配制—反应缓冲液稀释至2μM,每孔加入100μL,终浓度为1μM.(4)NADPH的配制：称取NADPH10.42mg，加入2.5mLK2HPO4缓冲液溶解，浓度为5mmol·L-1。(5)内标普萘洛尔乙腈溶液的配制：普萘洛尔2.20mg甲醇溶解，配制成浓度为1mg·mL-1的储备液，用乙腈稀释成100ng·mL-1。
孵育实验：总体积1mL，含微粒体25μL(由20mg·mL-1稀释至0.5mg·mL-1)，NADPH200μL(由5mmol·L-1稀释至1mmol·L-1)，待测化合物溶液20μL(由50μmol·L-1稀释至1μmol·L-1)，加入K2HPO4缓冲液755μL至1mL。
各孵育体系置于37℃水浴振荡器中孵育，分别在反应0、5、10、20、40、60、90、120、150、210、270min从体系中取出50μL，加入100μL含100ng·mL-1普萘洛尔的乙腈终止反应。每组平行三个样品，将各终止反应样品离心(4℃，14000rpm)15min，取上清LC-MS/MS检测每一个化合物及的剩余量，结果见图2，图2实验结果表明，合成的氘代化合物D1，D4和D6在体外肝微粒体稳定性实验中具有与索拉非尼相近的代谢稳定性。
实施例10：通过MTT分析方法测定所选化合物对肿瘤细胞BEL7402，MDA-MB-231，ACHN生长的抑制率。
实验材料：
1)细胞株：人肝癌细胞株BEL7402,人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人肾癌细胞株ACHN。细胞生长于RPMI-1640培养基+10％胎牛血清(含2mML-glutamine,penicillinandstreptomycin)中+1％双抗，置37℃(5％CO2–95％air)孵箱中生长，以0.25％的胰蛋白酶消化传代，1～2d换液1次。
2)化合物的溶解与稀释：根据化合物的分子量和质量，分别用DMSO(Sigma)配制成50μM的母液，-20℃保存。
3)RPMI1640细胞培养基，Corning公司；胎牛血清，BI公司；细胞消化液，0.25％Trypsin+0.02％EDTA
4)MTT液，MTT干粉(Amresco)，用PBS充分溶解配成5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤后分装，-20℃保存。
实验步骤：
1)细胞接种：取对数生长期的细胞，用胰酶消化后分散成单个细胞，计数，将细胞悬液调整至4.0×104个/mL，每孔50μL接种于已预先加好100μL/孔的培养基的96孔板中，使接种的细胞数量为2.0×103个/孔。细胞贴壁后，分别加入含有不同浓度化合物的新鲜培养基，使化合浓度分别是1.25μM、2.5μM、3.75μM、5μM、10μM、20μM，每个浓度设6个复孔，操作时避光，并调整各浓度所含DMSO含量一致。
2)药物孵育72h后，每孔加入20μLMTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,Sigma；5mg/mL)，置孵箱孵育4h后去上清，每孔加110μLDMSO溶解，用酶标仪测定在490nm下的吸光度值。根据公式：抑制率＝[(A570对照孔-A570给药孔)/A570对照孔]×100％，计算各浓度的抑制率，结果见表1和表2。
表1化合物对人肝癌细胞株BEL7402的抑制作用
表1实验结果表明，合成的氘代化合物D1，D4，D6和D7对人肝癌细胞株BEL7402具有优于索拉非尼的活性。
表2化合物对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人肾癌细胞株ACHN的抑制作用
表2实验结果表明，合成的氘代化合物D1，D6对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231具有优于索拉非尼的活性。合成的氘代化合物D1对人肾癌细胞株ACHN具有优于索拉非尼的活性。
实施例11：体内药代动力学实验
实验动物:Wistar大鼠20只，雄性，体重200g左右，10～12周龄。
给药溶液的配制:(1)索拉非尼及其氘代化合物混悬液的配制：称取适量化合物适量，将化合物用少量的0.5％的CMC-Na溶解并研磨，直至研磨均匀后用0.5％CMC-Na定容至需要的浓度后，超声均匀。大鼠给药剂量为3mg·kg-1，配制混悬液的浓度为1mg·mL-1。(2)索拉非尼及其氘代化合物静注药液的配制：称取适量索拉非尼及其氘代化合物，溶于DMF溶液中，配制浓度为4mg·mL-1，给药剂量为3mg·kg-1。
(1)单次口服索拉非尼及其氘代化合物混悬液：Wistar大鼠5只，雄性。给药剂量分别为3mg·kg-1，给药前禁食12h，给药后4h开始进食，期间自由饮水。实验时单次灌服待测化合物混悬液，于给药前和给药后5，15，30min，1，2，4，6，8，12，24，36，48h由眼眶静脉丛取血。每次取血约0.5mL，肝素钠抗凝，轻轻混匀，4℃低温8000r·min-1离心10min后取上清，置于-20℃冰箱中，待测。
(2)血浆样品预处理:血浆样品100μL，加入200μL混合内标工作溶液(配制在100％的乙腈溶液中，浓度为5ng·mL-1的普萘洛尔)，充分混合均匀，于4℃下以14000rpm转速离心15min，取上清溶液80μL，进样5μL，用LC-MS/MS进行分析。图3和表3为大鼠口服给药的药代动力学实验。
表3Wistar大鼠口服D1，D4，D6和sorafenib(3mg·kg-1)药动学参数综合比较表
表3实验结果表明，新合成的氘代化合物D1，D4和D6具有与索拉非尼类似的药代动力学性质，但D1的AUC值明显优于索拉非尼。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.氘代双芳基脲类化合物，其特征在于其结构通式如式（I）所示：
(Ⅰ)
式中取代基R1-R7均为氘或氢；R1-R7中至少一个取代基为氘。
2.根据权利要求1所述的氘代双芳基脲类化合物，其特征在于所述氘代双芳基脲类化合物为D1、D2、D3、D4、D5和D6，其结构式如下所示：
。
3.合成权利要求1所述氘代双芳基脲类化合物的含氘中间体，其特征在于：其具有通式（II）所示结构：
(II)
其中取代基R1-R3均为氘或氢，R4和R5均为氘。
4.根据权利要求3所述的合成所述氘代双芳基脲类化合物的含氘中间体，其特征在于：所述含氘中间体具体为：
4-(2,6-二氘-4-氨基苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺
和4-(2,6-二氘-4-氨基苯氧基)-N-甲基吡啶-2-三氘甲酰胺。
5.根据权利要求1所述的氘代双芳基脲类化合物的制备方法，其特征在于制备方法具体包括以下步骤：
（1）4-氯吡啶-2-甲酸甲酯发生取代反应，形成酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b；
所述酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b结构式如下：
；
（2）所述酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b再发生醚化反应，形成醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f；
所述醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f结构式如下：
；
（3）所述醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f与4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯或含氘4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯基酯发生缩合反应，形成所述氘代双芳基脲类化合物。
6.根据权利要求5所述的氘代双芳基脲类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中酰胺化合物a或含氘酰胺化合物b的制备方法为：将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯与甲胺进行取代反应，得到酰胺化合物a；或将4-氯吡啶-2-甲酸甲酯与氘代甲胺进行取代反应，得到含氘酰胺化合物b。
7.根据权利要求5所述的氘代双芳基脲类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中醚类化合物c或含氘醚类化合物d、e、f的制备方法为：
将所述酰胺化合物a与对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物c；
或将所述含氘酰胺化合物b与对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物d；
或将所述酰胺化合物a与含氘对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物e；
或将所述含氘酰胺化合物b与含氘对氨基苯酚进行缩合反应，得到醚类化合物f。
8.权利要求1所述的氘代双芳基脲类化合物以及药学上可接受的盐在制备抗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的氘代双芳基脲类化合物以及药学上可接受的盐在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于所述药学上可接受的盐包括无机酸和有机酸衍生的盐；
所述无机酸和有机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸和杏仁酸。
10.根据权利要求8所述的氘代双芳基脲类化合物以及药学上可接受的盐在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于所述肿瘤包括肝癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌，乳腺癌和黑色素瘤。
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