CN104788668B - 聚乙二醇‑布雷菲德菌素a酯类衍生物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类聚乙二醇‑布雷菲德菌素A酯类衍生物，其结构如式I、式II、式III或式IV所示，并提供了新化合物在制备防治肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌和前列腺癌药物中的应用。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的聚乙二醇(PEG)-布雷菲德菌素A酯类衍生物及其制备与应用。
(二)背景技术
布雷菲德菌素A((+)Brefeldin A BFA)是一种天然的大环内酯类抗生素，是Ascomycetes的二级代谢产物，又称斜卧菌素或壳二孢。1958年Singleton等人首次从Penicillium decumbens发酵液中分离得到。1971年，BFA的完全构型由X射线晶体结构分析得到确定。布雷菲德菌素A分子式C16H24O4，分子量280Da，分子结构含有5个手性中心，2个双键，1个五元碳环和1个13元大环内酯，结构如下式A所示：
布雷菲德菌素A具有多种生物活性，包括抗真菌、抗病毒、抗线虫、抗有丝分裂，并且发现它对多种癌细胞具有高活性抑制作用(GI50＝0.04μM)。目前，布雷菲德菌素A作为一种重要的分子工具广泛应用于哺乳动物信号传导途径的研究。由于其生物功能的多样性和高效的抗癌生物活性，美国肿瘤研究院(NCI)将BFA作为抗肿瘤药物的重点研究，作为新型抗癌候选药物。但是，布雷菲德菌素A因其自身的药代动力学性质(生物利用度低、水溶性差、血浆半衰期短等)不理想，无法作为抗肿瘤治疗试剂应用于临床。为了克服这些缺陷对BFA的结构修饰及衍生物研究逐渐受到重视，希望能寻找到既保持BFA高活性抗肿瘤作用又适合作为药物用于临床的化合物。
聚乙二醇(PEG)安全、无毒，具有油水二亲性，已被FDA批准用于人体。PEG的多醚链骨架具有良好的稳定性和水溶性，与药物相连能够增大药物的相对分子质量，减少肾消除，延长药物的半衰期，增大药物的水溶性，并且PEG链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原决定簇，降低药物的免疫原性。另外，小分子药物进行PEG修饰后，能够显著改善难溶药物的水溶性，如PEG-紫杉醇；改善药动学参数，如PEG-阿霉素、PEG-阿糖胞苷；与BFA存在相似药物使用缺陷的抗肿瘤化合物喜树碱，与PEG交联制备的聚乙二醇-喜树碱，现已进入Ⅱ期临床研究。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一类具有明显抗肿瘤活性的PEG化的布雷菲德菌素A酯类化合物，对肺腺癌细胞，乳腺癌细胞有效抑制，GI50值高达6.61nM，以及一种简便的PEG化布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物，其结构如式I、式II、式III或式IV所示：
式I、II、III、IV中，n1、n2、n3、n4各自代表平均聚合度，各自独立为20～90。
本发明还提供所述聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法，所述方法为以下方法(一)～方法(四)之一
(一)所述式I所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法为：
(1)式a1所示的单甲基聚乙二醇溶于无水氯仿，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，加热回流反应；TLC跟踪监测反应结束，所得反应液a后处理制得式a2所示的化合物；
(2)式a2所示的化合物溶于无水二氯甲烷中，加入布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在惰性气体的保护下，加热回流搅拌反应，TLC跟踪监测至反应结束，所得反 应液b经分离纯化制得式I所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物；
所述步骤(1)中，所述式a1所示的单甲基聚乙二醇、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1：11～13：1～1.3，优选1：11：1；
所述步骤(2)中，所述式a2所示的化合物、布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1:2.0～2.3:2.5～3:0.5～1；
化学式如下式所示
式a1、a2中，n1代表平均聚合度，为20～90。
所述方法(一)的步骤(1)中，反应时间一般为10～15小时。
所述方法(一)的步骤(1)中，所述无水氯仿的体积用量一般以式a1所示的单甲基聚乙二醇的物质的量计为30～100mL/mmol。
所述方法(一)的步骤(1)中，反应液a后处理步骤为：反应结束后，反应液a蒸除溶剂，剩余物加入饱和NaHCO3溶液稀释，用盐酸酸化至pH值＝6，所得酸性溶液用氯仿萃取，取有机相用水洗涤，经无水NaSO4干燥、过滤，滤液浓缩后浓缩液加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式a2所示的化合物。
所述方法(一)的步骤(2)中，反应时间一般为20～30小时。
所述方法(一)的步骤(2)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以 式a2所示的化合物的物质的量计为100～500mL/mmol。
所述方法(一)的步骤(2)中，反应液b分离纯化步骤为：反应结束后，反应液b中加水稀释，用CH2Cl2萃取，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷、甲醇体积比15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式I所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物。
(二)所述式II所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法为：
(1)式b1所示的聚乙二醇溶于无水氯仿，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，加热回流反应；TLC跟踪监测至反应结束，所得反应液c后处理制得式b2所示的化合物；
(2)式b2所示的化合物溶于无水二氯甲烷中，加入布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在惰性气体的保护下，加热回流搅拌反应，TLC跟踪监测至反应结束，所得反应液d经分离纯化制得式II所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物
所述步骤(1)中，所述式b1所示的聚乙二醇、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1：5～6：1～1.3，优选1：5：1；
所述步骤(2)中，所述式b2所示的化合物、布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1:2.0～2.3:2.5～3:0.5～1。
化学式如下式所示
式b1、b2中，n2代表平均聚合度，为20～90。
所述方法(二)的步骤(1)中，反应时间一般为10～15小时。
所述方法(二)的步骤(1)中，所述无水氯仿的体积用量一般以式b1所示的聚乙二醇的物质的量计为30～100mL/mmol。
所述方法(二)的步骤(1)中，反应液c后处理步骤为：反应结束后，反应液c蒸除溶剂，剩余物加入饱和NaHCO3溶液稀释，用盐酸酸化至pH＝6，所得酸性溶液用氯仿萃取，取有机相用水洗涤，经无水NaSO4干燥、过滤，滤液浓缩后浓缩液加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式b2所示的化合物。
所述方法(二)的步骤(2)中，反应时间一般为20～30小时。
所述方法(二)的步骤(2)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以式b2所示的化合物的物质的量计为100～500mL/mmol。
所述方法(二)的步骤(2)中，反应液d的分离纯化步骤为：反应结束后，反应液d中加水稀释，用CH2Cl2萃取，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯 甲烷、甲醇体积比15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式II所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物。
(三)所述式III所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法为：
(1)式c1所示的单甲基聚乙二醇溶于无水二氯甲烷，-5℃～5℃(优选0℃)下加入NaOH，搅拌反应1～2h后加入溴乙酸乙酯，-5℃～5℃(优选0℃)下搅拌反应1～2h，升温至室温进行反应，TLC跟踪检测至反应结束，所得反应液e后处理制得含式c2所示的化合物的浓缩液；
(2)含式c2所示的化合物的浓缩液在-5℃～5℃(优选0℃)下用盐酸调pH值为1.0，-5℃～5℃(优选0℃)下反应0.5～1h后，升温至60℃进行反应，TLC跟踪检测至反应结束，所得反应液f后处理制得式c3所示的化合物；
(3)式c3所示的化合物溶于无水二氯甲烷中，加入布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在惰性气体的保护下，加热回流搅拌反应，TLC跟踪监测至反应结束，所得反应液g经分离纯化制得式III所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物；
所述步骤(1)中，所述式c1所示的单甲基聚乙二醇、NaOH、溴乙酸乙酯的物质的量之比为1：3～4：4～4.5，优选1：3：4；
所述步骤(3)中，所述式c3所示的化合物、布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1:2.0～2.3:2.5～3:0.5～1。
反应式如下所示
式c1、c2、c3中，n3代表平均聚合度，为20～90。
所述方法(三)的步骤(1)中，室温下的反应时间一般为40～60小时。
所述方法(三)的步骤(1)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以式c1所示的单甲基聚乙二醇的物质的量计为30～100mL/mmol。
所述方法(三)的步骤(1)中，反应液e后处理步骤为：反应结束后，反应液e过滤除去固体，滤液蒸除溶剂，所得固体粗产物加水溶解，用正己烷萃取除去过量的溴乙酸乙酯，水相浓缩后制得含式c2所示的化合物的浓缩液。
所述方法(三)的步骤(2)中，升温至60℃后的反应时间一般为5～10小时。
所述方法(三)的步骤(2)中，所述反应液f的后处理步骤为：反应结束后，反应液f蒸馏除去水和HCl，剩余固体倒入大量冰乙醚，析出白色沉淀，过滤、滤饼洗涤、干燥制得式c3所示的化合物。
所述方法(三)的步骤(3)中，反应时间一般为20～30小时。
所述方法(三)的步骤(3)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以 式c3所示的化合物的物质的量计为100～500mL/mmol。
所述方法(三)的步骤(3)中，反应液g的分离纯化步骤为：反应结束后，反应液g中加水稀释，用CH2Cl2萃取，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷、甲醇体积比8:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式III所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物。
(四)所述式IV所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法为：
(1)式d1所示的聚乙二醇溶于无水二氯甲烷，-5℃～5℃(优选0℃)下加入NaOH，搅拌反应1～2h后加入溴乙酸乙酯，-5℃～5℃(优选0℃)下搅拌反应1～2h，升温至室温进行反应，TLC跟踪检测至反应结束，所得反应液h后处理制得含式d2所示的化合物的浓缩液；
(2)含式d2所示的化合物的浓缩液在-5℃～5℃(优选0℃)下用盐酸调pH值为1.0，-5℃～5℃(优选0℃)下反应0.5～1h后，升温至60℃进行反应，TLC跟踪检测至反应结束，所得反应液i后处理制得式d3所示的化合物；
(3)式d3所示的化合物溶于无水二氯甲烷中，加入布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在惰性气体的保护下，加热回流搅拌反应，TLC跟踪监测至反应结束，所得反应液j经分离纯化制得式IV所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物；
所述步骤(1)中，所述式d1所示的聚乙二醇、NaOH、溴乙酸乙酯的 物质的量之比为1：3～4：4～4.5，优选1：3：4；
所述步骤(3)中，所述式d3所示的化合物、布雷菲德菌A、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为1:2.0～2.3:2.5～3:0.5～1。
化学式如下式所示
式d1、d2、d3中，n4代表平均聚合度，为20～90。
所述方法(四)的步骤(1)中，室温下的反应时间一般为40～60小时。
所述方法(四)的步骤(1)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以式d1所示的聚乙二醇的物质的量计为30～100mL/mmol。
所述方法(四)的步骤(1)中，反应液h后处理步骤为：反应结束后，反应液h过滤除去固体，滤液蒸除溶剂，所得固体粗产物加水溶解，用正己烷萃取除去过量的溴乙酸乙酯，取水相浓缩，制得含式d2所示的化合物的浓缩液。
所述方法(四)的步骤(2)中，升温至60℃后的反应时间一般为5～10小时。
所述方法(四)的步骤(2)中，所述反应液i的后处理步骤为：反应结束后，反应液i蒸馏除去水和HCl，剩余固体倒入大量冰乙醚，析出白色沉淀，过滤、滤饼洗涤、干燥制得式d3所示的化合物。
所述方法(四)的步骤(3)中，反应时间一般为20～30小时。
所述方法(四)的步骤(3)中，所述无水二氯甲烷的体积用量一般以式d3所示的化合物的物质的量计为100～500mL/mmol。
所述方法(四)的步骤(3)中，反应液j的分离纯化步骤为：反应结束后，反应液j中加水稀释，用CH2Cl2萃取，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷、甲醇体积比15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后加入大量冰乙醚中析出白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤、干燥即制得式IV所示的聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物。
本发明方法中，所述惰性气体一般为氮气或氦气。
本发明所用的聚乙二醇为市购商品，为混合物，一般用聚乙二醇-k来表示，k代表聚乙二醇的平均分子量，如聚乙二醇-1000是指平均分子量1000的聚乙二醇。在计算聚乙二醇的物质的量时，以其平均分子量作为该聚乙二醇的分子量。
本发明所用的单甲基聚乙二醇为也叫甲氧基聚乙二醇或者聚乙二醇单甲醚，也是市购商品，为混合物，同样的，一般可用单甲基聚乙二醇-m来表示，m代表单甲基聚乙二醇的平均分子量，如单甲基聚乙二醇-1000是指平均分子量1000的单甲基聚乙二醇。在计算单甲基聚乙二醇的物质的量时，以其平均分子量作为单甲基聚乙二醇的分子量。
本发明中，聚乙二醇或单甲基聚乙二醇的平均分子量为960～4050，n1、 n2、n3、n4代表平均聚合度，即n1、n2、n3、n4各自为20～90。优选聚乙二醇或单甲基聚乙二醇的平均分子量为1000～4000，即n1、n2、n3、n4各自为22～88。
本发明还提供所述的PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物可用于制备防治食管癌、肺癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌的药物。更优选所述PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物用于制备防治肺癌或乳腺癌的药物。
本发明的有益效果主要体现在：本发明新化合物对食管癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌有高效的疗效，在体外检测有效抑制率高达80％；获得PEG化布雷菲德菌素A酯类衍生物的方法简单，易于操作。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
总反应式如下：
本发明实施例中，
聚乙二醇1000二酸酯按以下方法制得：
将聚乙二醇1000(1g，1mM)加入到装有50ml无水氯仿的圆底烧瓶，搅拌至全部溶解，加入丁二酸酐(0.5g，5mM)和DMAP(0.122g，1mM)，混合物加热回流反应；反应过程TLC监测，碘缸显色。12h终止反应，旋蒸除去CHCl3，残余物加入与残余物等体积的饱和NaHCO3溶液稀释，用pH＝1的盐酸酸化至pH＝6；氯仿萃取(3x25ml)，合并的有机相用水洗涤(2x15ml)，经无水NaSO4干燥，过滤，滤液浓缩至少量液体即停，然后加入大量冰乙醚中 析出产物，过滤，滤饼用乙醚洗涤2次、干燥得白色固体，收率85％。
聚乙二醇4000二酸酯按以下方法制得：
将聚乙二醇4000(1g，1mM)加入到装有50ml无水氯仿的圆底烧瓶，搅拌至全部溶解，加入丁二酸酐(0.5g，5mM)和DMAP(0.122g，1mM)，混合物于70℃加热回流反应；反应过程TLC监测，碘缸显色。12h终止反应，旋蒸除去CHCl3，残余物加入饱和NaHCO3溶液稀释，用pH＝1的盐酸酸化至pH＝6；氯仿萃取(3x25ml)，合并的有机相用水洗涤(2x15ml)，经无水NaSO4干燥，过滤，滤液浓缩至少量液体即停，然后加入大量冰乙醚中析出产物，过滤，滤饼用乙醚洗涤2次、干燥得白色固体，收率83％。
单甲醚聚乙二醇1000-1-酸酯按以下方法制得：
将单甲基聚乙二醇1000(1g，1mM)加入到装有50ml无水氯仿的圆底烧瓶，搅拌至全部溶解，加入丁二酸酐(0.11g，11mM)和DMAP(0.122g，1mM)，混合物加热回流反应；反应过程TLC监测，碘缸显色。12h终止反应，旋蒸除去CHCl3，残余物加入饱和NaHCO3溶液稀释，用pH＝1的盐酸酸化至pH＝6；氯仿萃取(3x25ml)，合并的有机相用水洗涤(2x15ml)，经无水NaSO4干燥，过滤，滤液浓缩至少量液体即停，然后加入大量冰乙醚中析出产物，过滤，滤饼用乙醚洗涤2次、干燥得白色固体，收率84％。
聚乙二醇1000二酸醚按以下方法制得：
将聚乙二醇1000(1g，1mM)加入到装有50ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，降温至0℃，在此温度下缓慢加入NaOH固体(0.12g，3mM)，搅拌反应1h；加入溴乙酸乙酯(0.67g，4mM)，保持0℃反应1h，升温至室温，继续反应。反应过程TLC监测，碘熏显色。48h之后终止反应，过滤除去白色固体，滤 液旋蒸除去溶剂，得到黄色半固体物质；加入60m的水，正己烷萃取(3x10ml)除去过量的溴乙酸乙酯，水相旋蒸10min，得浓缩混合溶液待下一步反应使用。
在0℃，将上述浓缩混合溶液用盐酸调至pH＝1.0，并保持冰浴条件反应0.5h，升温至60℃。反应过程TLC监测，碘熏显色。6h之后终止反应，旋蒸除去水和HCl，得黄色半固体物质，倒入大量冰乙醚，析出白色沉淀。过滤、滤饼洗涤、干燥得固体产物，收率80％。
聚乙二醇4000二酸醚按以下方法制得：
将聚乙二醇4000(1g，1mM)加入到装有50ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，降温至0℃，在此温度下缓慢加入NaOH固体(0.12g，3mM)，搅拌反应1h；加入溴乙酸乙酯(0.67g，4mM)，保持0℃反应1h，升温至室温，继续反应。反应过程TLC监测，碘熏显色。48h之后终止反应，过滤除去白色固体，滤液旋蒸除去溶剂，得到黄色半固体物质；加入60m的水，正己烷萃取(3x10ml)除去过量的溴乙酸乙酯，水相旋蒸10min，得浓缩混合溶液待下一步反应使用。
在0℃，将上述浓缩混合溶液用盐酸调至pH＝1.0，并保持冰浴条件反应0.5h，升温至60℃。反应过程TLC监测，碘熏显色。6h之后终止反应，旋蒸除去水和HCl，得黄色半固体物质，倒入大量冰乙醚，析出白色沉淀。过滤、滤饼洗涤、干燥得固体产物，收率81％。
单甲醚聚乙二醇1000-1-酸醚按以下方法制得：
将单甲醚聚乙二醇1000(1g，1mM)加入到装有50ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，降温至0℃，在此温度下缓慢加入NaOH固体(0.12g，3mM)，搅拌反应1h；加入溴乙酸乙酯(0.67g，4mM)，保持0℃反应1h，升温至室温， 继续反应。反应过程TLC监测，碘熏显色。48h之后终止反应，过滤除去白色固体，滤液旋蒸除去溶剂，得到黄色半固体物质；加入60m的水，正己烷萃取(3x10ml)除去过量的溴乙酸乙酯，水相旋蒸10min，得浓缩混合溶液待下一步反应使用。
在0℃，将上述浓缩混合溶液用盐酸调至pH＝1.0，并保持冰浴条件反应0.5h，升温至60℃。反应过程TLC监测，碘熏显色。6h之后终止反应，旋蒸除去水和HCl，得黄色半固体物质，倒入大量冰乙醚，析出白色沉淀。过滤、滤饼洗涤、干燥得固体产物，收率78％。
实施例1：(II-1)的制备
氮气保护下，聚乙二醇1000二酸酯(0.12g，0.1mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.056g，0.2mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.058g，0.3mM)和DMAP(0.012g，0.1mM)，混合物加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，用CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4a(II-1)0.088g，收率51.2％。
化合物表征:
化合物(II-1):1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.37(dd,J＝15.7,3.1Hz,2H),5.92(dd,J＝15.7,1.9Hz,2H),5.71(ddd,J＝15.0,10.3,4.6Hz,2H),5.30(dd,J＝15.1,9.6Hz,2H),4.87(dqd,J＝12.5,6.2,1.6Hz,2H),4.38–4.32(m,2H),4.14–4.09(m,2H),3.66(s,81H),2.85(m,4H),2.72–2.63(m,4H),2.41–2.32(m,2H),2.21(ddd,J＝13.8,9.0,5.2Hz,2H),2.13–1.99(m,6H),1.95(dd,J＝17.8,8.6Hz,2H),1.85–1.81(m,6H),1.58–1.49(m,4H),1.27(d,J＝6.3Hz,6H),1.01–0.88(m,2H).
实施例2：4b(II-2)的制备
氮气保护下，聚乙二醇4000二酸酯(0.41g，0.1mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.056g，0.2mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.058g，0.3mM)和DMAP(0.012g，0.1mM)，混合加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，用CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4b(II-2)0.223g，收率47.2％。
化合物表征:
化合物(II-2):1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.31(dd,J＝15.7,3.2Hz,2H),5.95(dd,J＝ 15.7,1.8Hz,2H),5.70(ddd,J＝15.0,10.2,4.5Hz,2H),5.37(dd,J＝15.0,9.6Hz,2H),4.85(dqd,J＝12.5,6.2,1.6Hz,2H),4.37–4.31(m,2H),4.15–4.07(m,2H),3.60(s,289H),2.85(m,4H),2.74–2.61(m,4H),2.41–2.32(m,2H),2.21(ddd,J＝13.8,9.0,5.2Hz,2H),2.15–1.99(m,6H),1.95(dd,J＝17.8,8.6Hz,2H),1.85–1.81(m,6H),1.56–1.47(m,4H),1.24(d,J＝6.2Hz,6H),1.00–0.92(m,2H).
实施例3:4c(Ⅰ-1)制备
氮气保护下，单甲醚聚乙二醇1000-1-酸酯(0.11g，0.1mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.056g，0.2mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.058g，0.3mM)和DMAP(0.012g，0.1mM)，混合物加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，用CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4c(Ⅰ-1)0.079g，收率57.8％。
化合物表征:
化合物(Ⅰ-1):1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.13(dd,J＝15.7,3.3Hz,1H),5.65–5.54(m,2H),5.23–5.08(m,1H),4.77–4.69(m,1H),4.28–4.22(m,1H),4.18–4.28(m,1H),3.64(s,88H),3.25(s,3H),2.81(m,2H),2.72–2.63(m,2H),2.41–2.32(m,1H),2.21(ddd,J ＝13.8,9.0,5.2Hz,1H),2.13–1.99(m,3H),1.95(dd,J＝17.8,8.6Hz,1H),1.85–1.79(m,3H),1.52–1.49(m,2H),1.27(d,J＝6.3Hz,3H),,0.88–0.73(m,1H)
实施例4：4d(IV-1)的制备
氮气保护下，聚乙二醇1000二酸醚(0.17g，0.15mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.084g，0.3mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.077g，0.4mM)和DMAP(0.018g，0.15mM)，混合物加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4d(IV-1)0.156g，收率64.0％。
化合物表征:
化合物(IV-1):1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.29(dd,J＝15.6,2.9Hz,2H),5.75(dd,J＝15.5,1.7Hz,2H),5.60(ddd,J＝14.9,10.2,4.5Hz,2H),5.18(dd,J＝15.1,9.6Hz,2H),4.73–4.65(m,2H),4.11–4.05(m,2H),3.92–3.86(m,2H),3.79–3.68(m,4H),3.53(s,80H),2.22(p,J＝8.4Hz,2H),2.04–1.95(m,2H),1.95–1.85(m,4H),1.82–1.60(m,10H),1.44(ddd,J＝14.0,11.0,4.8Hz,2H),1.37–1.30(m,2H),1.15(d,J＝6.2Hz,6H),0.80(ddd,J＝15.6,13.5,5.6Hz,2H).
实施例5：4e(IV-2)的制备
氮气保护下，聚乙二醇4000二酸醚(0.51g，0.15mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.084g，0.3mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.077g，0.4mM)和DMAP(0.018g，0.15mM)，混合物加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝15:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4e(IV-2)0.263g，收率50.2％。
化合物表征:
化合物(IV-2):1H-NMR(500MHz,DMSO)δ7.34(dd,J＝15.6,3.0Hz,2H),5.72(dd,J＝15.6,1.9Hz,2H),5.66(td,J＝10.3,5.1Hz,2H),5.20(dd,J＝15.2,9.7Hz,2H),4.76–4.67(m,2H),4.05(dq,J＝10.0,5.2Hz,2H),3.93(ddd,J＝9.2,5.2,2.4Hz,2H),3.65(dd,J＝5.4,4.2Hz,4H),3.52(s,282H),2.31(p,J＝8.3Hz,2H),2.01–1.94(m,2H),1.94–1.89(m,2H),1.87–1.61(m,12H),1.54–1.45(m,2H),1.30(ddd,J＝13.2,7.2,6.0Hz,2H),1.19(d,J＝6.3Hz,6H),0.75(ddd,J＝21.0,9.5,4.8Hz,2H).
实施例6：4f(III-1)的制备
氮气保护下，单甲醚聚乙二醇1000-1-酸醚(0.16g，0.15mM)加入到装有25ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶，搅拌全部溶解，加入布雷菲德菌素A(0.084g，0.3mM)于40℃加热至全部溶解，依次加入EDC(0.077g，0.4mM)和DMAP(0.018g，0.15mM)，混合物加热回流反应。反应过程中用TLC监测，浓硫酸显色。24h之后终止反应，反应液中加入30mlH2O，CH2Cl2萃取(3x15ml)，合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩除去大部分溶剂，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(D/M)体积比＝8:1的混合溶剂，收集含有产物的洗脱液，蒸除溶剂后得到目标产物透明液体，再加入大量冰乙醚析出，得到白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤两次，干燥后即制得化合物4f(III-1)0.149g，收率56.4％。
化合物表征:
化合物(III-1):1H-NMR(500MHz,DMSO)δ7.34(dd,J＝15.6,3.0Hz,1H),5.72(dd,J＝15.5,1.9Hz,1H),5.66(ddd,J＝14.9,10.3,4.5Hz,1H),5.20(dd,J＝15.2,9.7Hz,1H),4.75–4.67(m,1H),4.05(dd,J＝8.9,4.9Hz,1H),3.96–3.90(m,1H),3.68–3.63(m,2H),3.52(s,88H),3.25(s,3H),2.31(p,J＝8.3Hz,1H),2.01–1.94(m,1H),1.94–1.89(m,1H),1.87–1.62(m,6H),1.54–1.43(m,1H),1.35–1.27(m,1H),1.19(d,J＝6.3Hz,3H),0.81–0.70(m,1H).
实施例1～6制得的化合物经体外检测分析具有明显的抗癌活性。筛选方法采用四氮唑盐还原法(MTT法)和磺酰罗丹明及蛋白染色体(SRB法)，选用肿瘤细胞株MCF-7、A549，抑制效果如表1所示；
表1：PEG-BFA衍生物4a-4f对肿瘤细胞的抑制活性
Claims (4)
1.一种聚乙二醇-布雷菲德菌素A酯类衍生物，其结构如式I、式II、式III或式IV所示：
式I、II、III、IV中，n1、n2、n3、n4各自代表平均聚合度，各自独立为20～90。
2.如权利要求1所述的式I、式II、式III或式IV所示的PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述式I、式II、式III或式IV所示的PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备防治食管癌、肺癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述式I、式II、式III或式IV所示的PEG-布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备防治肺癌或乳腺癌的药物中的应用。
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| 聚乙二醇-异黄酮复合物的合成;徐蓓华等;《合成化学》;20081231;第16卷(第1期);第77-80页 * |
| 聚乙二醇负载葛根素前药的合成、表征及体外特性初步研究;蒋福升等;《中国药学杂志》;20110430;第46卷(第7 期);第522-526页 * |
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