CN105330721B - Ace抑制肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ACE抑制肽及其应用。ACE抑制肽，其氨基酸序列为CI或CK。本发明的二肽CI或CK对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发现，二肽CI在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。

Description

ACE抑制肽及其应用

技术领域：

本发明属于医药领域，具体涉及ACE抑制肽及其应用。

背景技术：

近年来越来越多的研究表明来源于天然食物或动植物的生物活性肽对人体健康有着积极的作用。这些生物活性肽能够通过调节人体内各种生理过程从而对人体产生有益的影响。目前有关生物活性肽的生理功效已被广泛研究，其免疫调节、抗高血压、抗氧化、保护骨骼以及抗高血脂等一系列重要作用相继见诸报道，在这其中生物活性肽的抗高血压作用是目前研究最为广泛也是最具应用价值的用途之一。

高血压是指人在安静状态下舒张压(Diastolic Blood Pressure，DBP)/收缩压(Systolic Blood Pressure，SBP)持续高于140/90mmHg，其平均发病率在15～20％之间。作为全球最常见的慢性病,高血压可以诱发心血管病、中风以及肾脏病等多种疾病，甚至造成无数患者死亡。相关研究表明人体血压受到多种因素调节，其中血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)和激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)是人体控制血压稳定的主要方式。血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)在这两个系统中的作用尤其重要。在RAS系统中，ACE控制着没有生理活性的血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)向具有升压活性的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的转化。在KKS系统中，ACE可通过失活血管舒缓激肽，导致血管收缩，引起血压升高。因此，ACE是抗高血压药物最重要的靶标之一。研究表明具有抗高血压作用的生物活性肽能够通过抑制ACE来实现降血压功效。且相比传统降压药物这些天然活性肽具有特异性高、毒副作用小、易吸收、药效持续时间长等优点。

目前已报道具有ACE抑制和抗高血压作用的生物活性肽已有数百种，其来源十分广泛，包含了动物、植物以及乳制品等不同来源。但是，从动植物及乳制品中分离提纯生物活性肽具有步骤繁琐、成本较高且无法大规模研究等缺点。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供对ACE(血管紧张素转化酶)的活性具有持续稳定的抑制作用，具有良好降血压效果的ACE抑制肽。

本发明是利用人工合成技术对长度为2个氨基酸的短肽的ACE抑制活性进行系统地评价，筛选具有高ACE抑制率的二肽，并进一步研究其在动物体内的降血压效果。相较传统抗高血压药物，生物活性肽具有具有毒副作用小、更加安全的优势。因此，本发明将对抗高血压新药物和保健食品的开发等具有重要意义。

本发明的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CI(Cys-Ile)或CK(Cys-Lys)。

本发明的第二个目的是提供上述ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用。

一种ACE抑制药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。

本发明的第三个目的是提供上述ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。

一种降血压药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。

本发明的二肽CI或CK对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发现，二肽CI在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。

附图说明：

图1是34种二肽的ACE的抑制率；

图2是二肽CI和CK的ACE抑制活性；

图3是CI灌胃后2小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以“平均值±标准误”形式表示。*p<0.05,**p<0.01表示给药前后血压值发生显著变化；

图4是CI灌胃后4小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以“平均值±标准误”形式表示。*p<0.05,**p<0.01表示给药前后血压值发生显著变化。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.实验部分

1.1实验材料和仪器

实验材料：合成二肽(由吉尔生化上海有限公司合成)如表1所示，纯度大于95％，共34种；卡托普利(Captoril)西格玛奥德里奇公司；呋喃丙烯酰三肽(FAPhe-Gly-Gly，FAPGG)西格玛奥德里奇公司纯度>＝98％；ACE西格玛奥德里奇公司；原发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)雄性31周龄北京维通利华实验动物技术有限公司动物许可证号：SCXK(京)2012-0001饲养一周适应环境后按每5只一组进行分组；生理盐水。

仪器设备：VICTOR X多标记酶标仪酶标仪铂金埃尔默公司；移液器法国吉尔森公司；BP-98A智能无创血压仪北京软隆生物技术有限公司；注射器；灌胃针。

1.2实验方法：

1.2.1ACE抑制率的测定

二肽的ACE抑制率使用可见分光光度法进行测定。具体方法是利用FAPGG作为ACE作用的底物，FAPGG最大吸收峰在340nm附近，用ACE将FAPGG水解成FAP和GG可使340nm附近处吸光度降低，降低的速率与ACE活性成正比。通过测定FAPGG在340nm附近处吸光度下降速度可计算出ACE的活性，进而根据添加抑制剂前后ACE酶活的变化间接反映不同ACE抑制剂的抑制活性。本实验将二肽样本用超纯水溶解后配置20mg/mL原液，然后稀释成20μg/mL浓度的样品作为实验组，以0.0002μg/mL的卡托普利溶液为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。实验于37℃下，以340nm为主波长检测ACE底物FAPGG的吸光度，405nm为参比波长消除噪音影响，检测吸光度值的变化，检测以3分钟为间隔连续检测1小时。根据公式：计算样品的抑制率。其中E为样品孔的ACE酶活(U/L)，计算公式为S_s为样品孔ACE动力学曲线直线段的斜率，S_p为未加抑制剂孔的ACE动力学曲线直线段的斜率，S_b为空白孔ACE动力学曲线直线段的斜率。

1.2.2IC₅₀测定

实验将二肽原液稀释成200μg/mL浓度的样品作为试样，以20μg/L浓度的Captopril样品作为阳性对照，对各样品按3浓度倍梯度进行稀释，后按1.2.1所述方法测定样品的ACE抑制率，进而计算IC50值。

1.2.3大鼠降压实验

购买31周龄的原发性高血压大鼠，饲养一周适应环境后进行分组实验。按照如下剂量：卡托普利(100mg/kg)、生理盐水、CI(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、1mg/kg)将相应药品溶于生理盐水中利用灌胃方式进行给药。利用无创血压仪分别测量大鼠灌胃前、灌胃后2小时、灌胃后4小时后的舒张压(Diastolic Blood Pressure，DBP)、收缩压(Systolic Blood Pressure，SBP)和平均动脉压(Mean Blood Pressure，MBP)，取其平均值作为相应的血压值。

1.2.4统计分析

数据统计采用R进行两样本均值单尾t检验，数值均以均值±标准误表示。

2.结果与讨论

2.1 34种二肽的ACE抑制率

本研究用可见光分光光度法连续监测34种二肽在一小时内对ACE的抑制活性，表1中的34种二肽均为人工合成，纯度在95％以上(表1)。测试结果发现N端为半胱氨酸(Cys，C)的两种二肽半胱氨酸-异亮氨酸(Cys-Ile，CI)和半胱氨酸-赖氨酸(Cys-Lys，CK)的ACE抑制活性最强，其抑制率分别为67.52％和38.39％；其余二肽中有7种二肽对ACE有轻微抑制作用(10％≤ACE抑制率<20％)，有24种二肽对ACE无抑制效果或抑制效果不明显(ACE抑制率<10％)(图1)。在本轮测试中浓度为0.0002μg/mL的卡托普利的ACE抑制活性为72.83％。

2.2 CI和CK IC₅₀测定

如图2所示1小时连续检测发现CI和CK对ACE的活性有持续稳定的抑制作用，图中光吸收值随时间变化越小代表ACE抑制效果越好。从图中可以看到二肽CI的ACE抑制效果与浓度为0.0002μg/mL的卡托普利的作用效果相近。更加精确的浓度梯度实验测定发现CI的IC₅₀值为39.77μmol/L，CK的IC₅₀值为211.53μmol/L。

2.3 CI体内降血压实验

相关研究表明部分ACE抑制剂的活性在体内和体外有所不同，因此，体外检测所得到的具有高ACE抑制率的二肽是否能在生物体内拥有好的降血压效果还需要进一步的动物实验来验证。在本研究中选用CI进行SHR大鼠降血压实验。用CI、生理盐水和卡托普利对SHR大鼠进行灌胃，并分别于给药后2h、4h监测大鼠的血压变化。

如图3所示当CI剂量为1mg/kg时，给药后2h后SHR大鼠血压无明显改变；当CI剂量达到10mg/kg时SHR大鼠血压开始呈下降趋势，其中SBP下降34.36±5.19mmHg(p＝0.016)，DBP下降27.88±2.83mmHg(p＝0.008),MBP下降30.00±3.61mmHg(p＝0.01)，下降较为明显。随着CI剂量不断提高，给药后2h后SHR大鼠血压下降幅度进一步增大，当CI剂量达到100mg/kg时SBP下降83.95±10.28mmHg，DBP下降81.43±13.89mmHg，MBP下降82.32±12.61mmHg，各指标均显著低于给药前(p<0.05)，降压效果高于同等浓度的卡托普利。

在给药后4h继续检测SHR大鼠血压变化。当CI剂量仅为1mg/kg时，各血压指标均低于给药前，其中SBP下降23.54±6.79mmHg(p＝0.05)，DBP下降14.89±3.55mmHg(p＝0.04)，MBP下降17.78±4.66mmHg(p＝0.04)，药效显著，且给药后4h血压总体水平较给药后2h低(图4)。当CI剂量为10mg/kg和25mg/kg时给药后4h SHR大鼠血液仍呈下降趋势(图4)，下降幅度较给药后2h略有下降。当CI剂量达到50mg/kg时，给药后4h降压作用较给药后2小时略有上升，且各项指标均极显著低于给药前(p<0.001)(图4)；当剂量为100mg/kg时，其降压效果与给药后2小时相比基本不变，与等浓度的卡托普利降压效果接近(图4)。以SBP为例，当剂量分别为10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg时，灌胃4h后的SBP比给药前分别下降21.20±9.08mmHg(p＝0.10)、27.29±11.2mmHg(p＝0.09)、49.22±3.24mmHg(p＝0.003)和83.85±17.35mmHg(p＝0.03)，与给药后2小时相比无显著差异(p>0.1)；DBP和MBP的变化与SBP一致。

由图3和图4可以看出SBP、DBP、MBP下降幅度随着CI剂量的增加整体呈上升趋势。灌胃2h后以上各指标下降值与CI剂量呈非线性关系，而当灌胃4h后以上各指标下降值与CI剂量呈较好好的正相关。利用pearson相关系数分析CI剂量与血压指标灌胃前后的改变量之间的相关性，得到CI对应的各项指标的相关系数。如表2所示，CI灌胃后4h的各项血压指标的平均改变量与剂量的相关系数R>0.8，说明CI急性药效的研究适宜在灌胃后4h进行采样。在本实验剂量范围内，当剂量在100mg/kg时，药效最佳，血压下降值和CI剂量间较强的线性关系提示随着剂量的继续增加有可能实现更大的药效。

生物活性肽的降血压作用已在食品科学领域和药物研究领域得到了广泛的关注。研究也发现短肽的氨基酸构成对其ACE抑制活性有重大的影响，其中两个末端氨基酸构成尤为关键。目前已知当生物肽N末端为疏水性氨基酸尤其是脂肪类氨基酸(如Gly，Leu、Ile、Val)，C末端为芳香族氨基酸(如Phe、Tyr、Trp或Pro)时，其降血压活性相对较强。本研究中我们发现符合上述条件的二肽一共有14种，其中只有IF、KY、KW和EW显示有一定程度的ACE抑制活性(抑制率≥10％)，其余10种二肽的ACE抑制活性都不明显。此外、两个N末端为Cys的二肽的ACE抑制活性则都较强。以上结果提示：一、N端为Cys可能是短肽具有较强ACE抑制活性的又一特征，短肽N末端的Cys有可能通过促进二肽和ACE的结合，从而提高短肽的ACE抑制活性；二、短肽的ACE抑制活性除受氨基酸一级序列影响外，可能还受到其他因素制约，如肽段的二级结构等。

在本研究中我们发现：除1mg/kg外给药后2h不同剂量下CI基本达到最大药效，最大药效持续到给药后4小时。类似研究曾表明，不同长度的短肽在SHR大鼠体内的有效作用时间不同。二肽或三肽(IW、VW、LW、IY及LKP)因为较容易被肠粘膜完整的吸收，其达到最大药效的时间一般在给药后2h左右，当时间超过2h后其降压效果就逐步降低。而相对长一些的生物活性肽(LKPNM、LVGRPRHQG等)和卡托普利的最大药效时间则是在给药后4～8h不等。在本研究中我们发现CI的最大药效时间从给药后2小时持续到给药后4小时，结果与上述研究部分一致，更提示CI的作用半衰期可能更长。此外我们还发现当CI剂量为1mg/kg时，给药后2h无明显降压效果，而给药后4h SHR大鼠各项血压指标均显著下降(p≤0.05)，此结果说明当CI剂量较低时仍然在动物体内有降压作用，该特性对CI作为抗高血压药物候选物或保健食品添加成份有重要意义。

研究利用可见光分光光度法完成对34种合成二肽的ACE活性的测定，发现CI和CK具有较高的ACE抑制活性，提示N端的Cys可能起到关键作用(Ile和Lys属于人体必需氨基酸，三者共同属于脂肪族氨基酸)。进一步通过SHR降血压实验证明了CI在SHR大鼠体内确有明显的降压效果。由于实验模拟口服用药采取灌胃方式给药，加之二肽为生物体内故有的分子，具有易吸收、药效持久等优点，因此，二肽分子CI和CK可以用于降血压药物或抗高血压保健食品添加成份的。此外，实验结果同时提示研究二肽的ACE抑制活性具有重要科学和应用价值，实验计划进一步完成所有二肽的ACE抑制活性研究。

Claims (2)

1.ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用，所述的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CI。

2.ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用，所述的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CI。