TWI694835B

TWI694835B - 短胜肽用於治療/預防高血壓及其相關疾病之用途

Info

Publication number: TWI694835B
Application number: TW107145188A
Authority: TW
Inventors: 林万登
Original assignee: 東海大學
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-06-01
Also published as: CN111317811A; TW202021610A; CN111317811B

Abstract

本發明係揭露提供一種短胜肽用於治療/預防高血壓及其相關疾病之用途，意即藉由投予有效量之短胜肽或含有該短胜肽之組合物至一罹患高血壓之個體，係能夠使該個體之血壓恢復至正常血壓範圍內，或是調控該個體血壓，使之血壓下降，以達到治療或預防高血壓及其相關疾病之功效。

Description

短胜肽用於治療/預防高血壓及其相關疾病之用途

本發明係有關於胜肽之用途，特別係指一種短胜肽用於治療/預防高血壓及其相關疾病之用途。

按，高血壓係為一種影響全世界數百萬人之慢性疾病，並且為心肌梗塞、心臟衰竭、中風、腎臟損傷等危險因子。目前臨床上對於高血壓之治療與預防，除了改善生活習慣及飲食習慣之外，對於已經罹患高血壓之患者來說，多採用ACE抑制劑做為治療高血壓之藥物，雖然ACE抑制劑能夠達到控制血壓，並保護其他器官免於受高血壓影響而損傷，惟，如captopril、enalapril或lisinopril等合成之ACE抑制劑，係已經被研究指出長期服用會對於人體有不良副作用，例如咳嗽、頭暈、頭痛、腎臟及肝臟損傷等。

由此可知，目前臨床上所使用之藥物長期服用會對於人體產生健康上之疑慮，造成部分患者對於藥物治療產生抗拒而面臨心血管疾病之高風險，因此，倘若能夠提供一種對於高血壓治療及預防有良好效果之組成物，並且能夠減少對人體之副作用，將對於高血壓及其相關疾病之防治有極大助益。

本發明之主要目的係在於提供一種短胜肽用於治療/預防高血壓及其相關疾病之用途，意即藉由投予有效量之短胜肽或含有該短胜肽之組合物至一罹患高血壓之個體，係能夠使該個體之血壓恢復至正常血壓範圍內，或是調控該個體血壓，使之血壓下降，以達到治療或預防高血壓及其相關疾病之功效。

本發明之另一目的在於提供一種短胜肽用於製備抑制與心肌細胞病變相關蛋白質之組合物之用途，具體來說，該短胜肽係能夠抑制與心肌細胞病變相關蛋白質表現，以降低與心肌細胞病變相關疾病發生之風險，尤其是與高血壓相關之心臟疾病。換言之，藉由投予一有效量之該短胜肽或含有該短胜肽之組合物至一罹患高血壓之個體，係能夠有效地治療或預防與高血壓相關心血管疾病。

其中，該與心肌細胞病變相關之蛋白質係得為磷酸化p38、磷酸化-ERK及磷酸化-JUN、BNP、IL-6、Rac1、磷酸化-JAK2、STAT3、MMP-2、TIMP1、CTGF、uPA、TLR-4、p-NFkB p65、TNF-α、BAD、細胞凋亡酶3、活化之之細胞凋亡酶3（Cleaved caspase 3）、細胞色素C或上述至少二蛋白質。

本發明之又一目的在於提供一種短胜肽用於製備粒線體再生促進劑之用途，意即藉由投予一有效量之該短胜肽至一罹患高血壓之個體，係能夠維持該個體心肌細胞內粒線體之活性，以達到預防或治療與高血壓相關疾病之功效。

而為能達成上述目的，於本發明之實施例中係揭露一種短胜肽，其胺基酸序列係包含有SEQ ID No.1。

於本發明之一實施例中，該短胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.1。

於本發明之另一實施例中，該短胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.2。

本發明係揭露一短胜肽，其胺基酸序列係包含有SEQ ID No.:1所示序列，具體來說，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2，或是包含SEQ ID No.:2之序列。

由於本發明所揭短胜肽係能夠調控血壓，使個體血壓由高血壓恢復至正常血壓範圍內，因而能夠用於作為治療或預防高血壓及其相關疾病之組合物，舉例來說，透過治療高血壓，係能夠有效地避免高血壓腎臟病、高血壓心臟病、肝臟病變等疾病之發生。

更進一步來說，透過動物實驗證實，本發明所揭短胜肽還能夠有效抑制造成心肌細胞病變之相關蛋白質之表現，以及促進心肌細胞內粒線體再生，以保護心肌細胞不受高血壓影響而產生病變，並且能夠有效改善心肌細胞受損之情形，使受損心肌細胞恢復到與正常心肌細胞相類似之狀態。

本發明所揭短胜肽係得作為一組合物，而該組合物中除了以該短胜肽作為活性成分外，更得搭配一藥學上或一食品上能夠接受之載體。

而本發明所揭短胜肽係能夠以本發明所屬技術領域之通常方法製備而得，例如生物體中萃取或水解而分離，亦得以胜肽化學合成方式、或是以重組微生物、基因轉殖動物作為產製平台而製備，並且，於發明所屬技術領域且具通常知識者可理解，於不影響本發明所揭短胜肽之正常生理作用之情況下，得於胺基酸序列之5’端或3’端額外增加用以修飾之其他胜肽片段，達到提昇本發明所揭短胜肽之穩定性或特性，亦能達成本發明之功效。

本發明所揭IF胜肽，係指胺基酸序列為SEQ ID No.:1之胜肽，其說明如下表一所示。表一：IF胜肽之說明

本發明所揭DF胜肽，該指胺基酸序列為SEQ ID No.:2之胜肽，其說明如下表二所示。表二：DF胜肽之說明

以下，為能證實本發明所揭技術特徵之功效，將茲舉若干實例並搭配圖式作更進一步說明如后。

以下實例中之動物試驗係由中國醫藥大學動物研究委員會依據之實驗動物使用及照顧指引（No. 85-23, 1996）進行。

以下實例中所使用之SHR（spontaneously hypertensive rats）大鼠係為自發形成高血壓之大鼠，目前大多研究皆以SHR大鼠作為模擬人類高血壓之動物模式。

實例一：製備短胜肽

以化學合成方式製備本發明所揭IF胜肽及DF胜肽，並且，以HPLC法確認IF胜肽及DF胜肽之純度，結果如第一圖及第二圖所示，顯示藉由化學合成方法製得之胜肽具有高純度。

實例二：動物試驗

取複數雄性SHR大鼠，飼養於22℃及12小時光/暗循環之環境下。將大鼠隨機分為6組，各組6隻，並且於17週齡時依據下列各組條件進行飼養8週，其中：第一組：WHY大鼠，給予磷酸鹽緩衝液；第二組：SHR大鼠，給予磷酸鹽緩衝液；第三組：SHR大鼠，投予IF胜肽，每天投予劑量為10mg/kg；第四組：SHR大鼠，投予DF胜肽，每天投予劑量為10mg/kg；第五組：SHR大鼠，投予ACE抑制劑（Captopril），每天劑量為5mg/kg。

於前述試驗結構後，以儀器（Softron, BP-2010 series）檢測各組大鼠之血壓，而後將各該大鼠予以犧牲，並且取其心臟組織、肌肉、血清進行後續試驗。

實例三：血壓檢測

測量各組大鼠之心率及血壓，結果如表三所示。由表三之結果顯示，相較於第一組大鼠來說，第二組大鼠確實有高血壓之現象，意即第二組大鼠係為高血壓模式大鼠；投予臨床藥物之第五組大鼠，其收縮壓係較第二組大鼠些許下降，但是其舒張壓及其平均動脈壓係與第二組大鼠間相近，未有明顯降低之功效存在；而第三組及第四組大鼠不論是在收縮壓、舒張壓或平均動脈壓上皆分別較第二組大鼠之數據降低，並且於舒張壓之降低效果係明顯優於第五組大鼠。

由上述結果可知，本發明所揭DF胜肽及IF胜肽係分別具有降低血壓之功效，並能達到相同或優於臨床ACE抑制劑調控血壓之功效。換言之，本發明所揭DF胜肽及IF胜肽確實能夠作為治療或預防高血壓及其相關疾病之組合物。

表三：各組大鼠之心率及血壓

實例四：心臟機能測試

各組大鼠犧牲後之心臟係如第三圖所示，並且，檢測各組大鼠之體重、心臟重量、脛骨長度，並進行統計分析，結果如表四所示。表四：測量並計算各組大鼠之體重、心臟重、脛骨長及彼此間比例之結果

又，以心臟超音波檢測各組大鼠，結果如第四圖所示，其中，長藍色箭頭表示心臟舒張，短黃色箭頭表示心臟收縮；並且，檢測分析各組大鼠心臟超音波之結果，如下表五所示，其中：IVSd為舒張末期之心室中膈厚度；LVIDd為舒張末期的左心室內部尺寸； LVPWd為舒張末期左心室後壁厚度；IVSs為收縮末期的室間隔厚度； LVIDs為收縮末期左心室內部尺寸；LVPWs為收縮末期左心室後壁厚度； EDV為舒張末期容量；ESV為收縮末期體積；EF為心室射出率；FS為縮短分率，意即每次心臟收縮時左心室腔室縮小的程度；SV為心博出量，意即每一次心室收縮時所排出的血量；LVd Mass為左心室舒張末期質量；LVs 左心室收縮末期質量。

表五：以心臟超音波檢測各該大鼠心臟之分析結果

由表四及第三圖之結果可知，顯示相較於其他組大鼠來說，第二組大鼠之心臟係明顯增大，並且，投予本發明所揭短胜肽之第三組及第四組大鼠之心臟尺寸係與第一組大鼠間無明顯差異。由此顯示，本發明所揭短胜肽係能夠有效地改善心臟肥大之病徵。

再者，由表五及第四圖之結果可知，第二組大鼠之心臟功能性係明顯地降第一組大鼠差，顯示SHR大鼠會因高血壓而導致心臟功能損傷，引發心臟相關疾病之發生相較於第二組大鼠，投予ACE抑制劑之第五組大鼠之心臟機能係明顯提升，顯示ACE抑制劑確實能夠治療高血壓，並達到改善心臟機能受損之情形；相較於第二組大鼠來說，第三組及第四組大鼠之臟機能係分別恢復至相近於第一組大鼠之狀態，並且，相較於第五組大鼠來說，第三組及第四組大鼠之心臟機能係明顯較佳。

由上述結果可知，藉由投予本發明所揭IF胜肽及DF胜肽係能夠用於治療或預防由高血壓所引起之心臟疾病，並且，能夠使已受損之心臟機能恢復至將近於正常狀態。換言之，本發明所揭所揭IF胜肽及DF胜肽係能分別作為治療高血壓及其相關疾病之醫藥組合物。

實例五：組織染色切片試驗

將各組大鼠心臟進行組織切片，並分別進行H&E染色及梅生三色染色，結果如第五圖及第六圖所示。

由第五圖及第六圖之結果可知，第一組大鼠之心肌細胞排列緊密且結構完整；第二組大鼠之心肌細胞則排列鬆散而具有較多之間質空間，並且心肌組織中含有許多膠原蛋白，顯示第二組大鼠之心肌細胞係受到高血壓影響而受損，並且有纖維化之病徵；相較於第二組大鼠，不論是投予臨床藥物之第五組大鼠，或是投予本發明所揭短胜肽之第三組或是第四組大鼠，其心肌細胞之排列係如第一組大鼠一般排列整齊，且沒有膠原蛋白於組織間累積。

由此可知，本發明所揭IF胜肽及DF胜肽不僅能夠用於治療或預防由高血壓所引起之心臟疾病，更能修復受損心肌細胞，因此，本發明所揭IF胜肽及DF胜肽係能夠作為治療或預防高血壓及其相關疾病之組合物。

實例六：血液生化值檢測

檢測各組大鼠血清中尿酸、肌酸酐、AST（Aspartate Aminotransferase）、ALT（Alanine transaminase）及肌酸激酶（creatine kinase）之含量，結果如第七圖至第十一圖所示。

由第七圖至第十一圖之結果可知，高血壓模式之第二組大鼠因未投予任何藥物，因此血清中之尿酸、肌酸酐、AST、ALT及肌酸激酶之含量皆較第一組大鼠高，顯示第二組大鼠之心臟、肝臟及腎臟功能受到高血壓影響而損傷，甚而會有罹患心肌梗塞、腎臟疾病之風險；而透過投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽，係能夠使大鼠血液中與肝功能相關之指標：ALT、AST，及與心臟功能相關指標：肌酸激酶之含量下降，顯示本發明所揭IF胜肽及DF胜肽係能夠保護器官免於受到高血壓造成之血流壓力而損傷，大幅降低個體罹患腎臟疾病、心臟疾病、心肌梗塞、心肌炎之風險。

由上述結果可知，本發明所揭IF胜肽及DF胜肽係能夠用於治療或預防由高血壓所引起之疾病，並且，能夠作為治療或預防肝臟損傷、心臟疾病及腎臟疾病之組合物。

實例七：檢測心臟細胞中蛋白質之表現（一）

以西方墨點法檢測各組大鼠心臟細胞內蛋白質之表現，並經統計分析後，結果如第十二圖至第二十七圖所示。更進一步地，以TUNEL法及DAPI染色法觀察各組大鼠心肌組織，結果如第二十八圖所示，再以西方墨點法檢測各組大鼠心肌細胞中與細胞凋亡及細胞存活相關之蛋白質表現，進行量化統計後，結果如第二十九圖至第三十二圖所示。

由第十二圖至第二十圖之結果可知，第二組大鼠係會使與心臟肥大相關蛋白質：磷酸化p38、磷酸化-ERK及磷酸化-JUN、BNP、IL-6、Rac1、磷酸化-JAK2、STAT3之表現量增加，而會誘導心臟肥大及其相關疾病發生；相較於第二組大鼠，投予本發明所揭所揭IF胜肽或DF胜肽之第三組及第四組大鼠，其係能夠降低與心臟肥大相關蛋白質表現量，能夠有效達到預防及治療高血壓引起之心臟疾病之功效。

由第二十一圖至第二十四圖之結果可知，第二組大鼠係會使與心臟纖維化相關蛋白質：MMP-2、TIMP1、CTGF及uPA之表現量增加，而會使心肌細胞走向纖維化而誘發心臟疾病；相較於第二組大鼠，投予本發明所揭所揭IF胜肽或DF胜肽之第三組及第四組大鼠，其係能夠降低與心臟纖維化相關之蛋白質表現量，以預防及治療高血壓引起之心臟疾病。

由第二十五圖至第二十七圖之結果可知，第二組大鼠之高血壓病症係使心肌細胞內與發炎相關之蛋白質：TLR-4、p-NFkB p65及TNF-α表現量增加，顯示心臟面臨高氧化壓力而會損傷；相較於第二組大鼠，投予本發明所揭所揭IF胜肽或DF胜肽之第三組及第四組大鼠，其係能夠降低上述與發炎相關因子之表現，以達到預防高血壓引起之心臟疾病的功效。

由第二十八圖至第三十二圖之結果可知，基於第二組大鼠係會使與心臟凋亡相關蛋白質：BAD、細胞凋亡酶3、活化之之細胞凋亡酶3（Cleaved caspase 3）及細胞色素C表現量增加，並使細胞存活相關蛋白質：Beclin表現下降，意即高血壓會使心肌細胞逐漸凋亡而導致心臟疾病之發生率增加；相較於第二組大鼠，投予本發明所揭所揭IF胜肽或DF胜肽之第三組及第四組大鼠，由於能夠治療高血壓之症狀及調控血壓，進而能夠使與心臟凋亡相關之蛋白質表現量降低，且使與細胞存活相關蛋白質表現量上升，以達到預防及治療高血壓引起之心臟疾病的功效。

實例八：檢測心臟細胞中蛋白質之表現（二）

以西方墨點法檢測各組大鼠心肌細胞中與粒線體再生相關蛋白質：SIRTI、FOXO3a及CREB之表現，並經量化統計後得到如第三十三圖至三十五圖所示結果。

由第三十三圖至第三十五圖之結果顯示，罹患高血壓之第二組大鼠，其心肌細胞內之粒線體係處於受損之狀態，意即心肌細胞粒線體合成ATP之能力下降，無法供給足夠能量予心臟細胞，使得心臟之功能會受到影響而提高發生心臟相關疾病之可能性；相較於第二組大鼠來說，投予本發明所揭所揭IF胜肽或DF胜肽之第三組及第四組大鼠，不僅能夠治療高血壓之症狀、調控血壓及降低發炎反應，更能夠調控粒線體再生之路徑，使心肌細胞之粒線體維持活性，以持續合成足夠之ATP予心肌細胞，降低心臟相關疾病發生之可能性。

第一圖係為以HPLC分析IF胜肽之結果。第二圖係為以HPLC分析DF胜肽之結果。第三圖係為各組大鼠經試驗後犧牲所取出之心臟。第四圖係以心臟超音波觀察各組大鼠心臟之影像。第五圖係各組大鼠心臟組織切片經H&E染色後之結果。第六圖係各組大鼠心臟組織切片經梅生三色染色後之結果。第七圖係為檢測各組大鼠血清中尿酸含量之結果。第八圖係為檢測各組大鼠血清中肌酸酐含量之結果。第九圖係為檢測各組大鼠血清中AST含量之結果。第十圖係為檢測各組大鼠血清中ALT含量之結果。第十一圖係為檢測各組大鼠血清中肌酸激酶含量之結果。第十二圖係以TUNEL法及DAPI染色法檢測各組大鼠心臟組織之結果。第十三圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內p-ERK之表現量。第十四圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內p-JUK之表現量。第十五圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內p-p38之表現量。第十六圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內BNP之表現量。第十七圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內IL-6之表現量。第十八圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內Rac1之表現量。第十九圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內p-JAK2之表現量。第二十圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內STAT3之表現量。第二十一圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內MMP-2之表現量。第二十二圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內TIMP1之表現量。第二十三圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內CTGF之表現量。第二十四圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內之uPA表現量。第二十五圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內TLR-4之表現量。第二十六圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內p-NFkB p65之表現量。第二十七圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內TNF-α之表現量。第二十八圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內BAD之表現量。第二十九圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內細胞凋亡酶3之表現量。第三十圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內活化之細胞凋亡酶3之表現量。第三十一圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內細胞色素C之表現量。第三十二圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內Beclin之表現量。第三十三圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內SIRTI之表現量。第三十四圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內FOXO3a之表現量。第三十五圖係以西方墨點法檢測並量化分析各組大鼠心肌組織內CREB之表現量。

Claims

一種將短胜肽用於製備治療或預防高血壓及其相關疾病之組合物之用途，其中，該短胜肽之胺基酸係為SEQ ID No.2。
依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該組合物更包含有另一短胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。
依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，與高血壓相關疾病係選自由高血壓腎臟病、高血壓心臟病及肝臟疾病所組成之群。
一種將短胜肽用於製備抑制與心肌細胞病變相關蛋白質之組合物之用途，其中，該短胜肽之胺基酸係為SEQ ID No.2；以及該與心肌細胞病變相關蛋白質係為磷酸化p38、磷酸化-ERK及磷酸化-JUN、BNP、IL-6、Rac1、磷酸化-JAK2、STAT3、MMP-2、TIMP1、CTGF、uPA、TLR-4、p-NFkB p65、TNF-α、BAD、細胞凋亡酶3、活化之之細胞凋亡酶3(Cleaved caspase 3)或細胞色素C。
依據申請專利範圍第4項所述用途，其中，該組合物更包含有另一短胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。
一種將短胜肽用於製備粒線體再生促進劑之用途，其中，該短胜肽之胺基酸係為SEQ ID No.2。
依據申請專利範圍第6項所述用途，其中，該粒線體再生促進劑更包含有另一短胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。