CN105315357A - Trpm8蛋白和相关多肽片段及其抗体的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TRPM8相关多肽片段，氨基酸序列如SEQ？ID？No:1-6所示。本发明还公开了TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂中的应用，通过检测患者体液中的TRPM8蛋白分子或TRPM8相关多肽片段或其抗体的水平，有效的对慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征进行诊断，并且能够有效区别其它前列腺疾病。此外，通过静脉或皮下注射1000～30000IU的TRPM8蛋白或其相关多肽片段的单克隆或多克隆抗体，可以治愈或明显缓解慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的临床表现。

Description

TRPM8蛋白和相关多肽片段及其抗体的新用途
技术领域
本发明属于免疫诊断试剂领域以及治疗药物领域，具体涉及一种TRPM8蛋白、相关多肽片段或其抗体在慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征诊断中的应用以及针对该蛋白的单克隆或多克隆抗体在治疗慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征中的应用。
背景技术
前列腺炎是成年男性的常见疾病。我国前列腺炎症状的男性人群发生率为8.4％，就诊患者占泌尿外科门诊患者总量的的8～25％。有资料显示约有50％的男性在一生中的某个时期会受到前列腺炎的影响。
前列腺炎目前分为四种类型，其中Ⅲ型，即：慢性前列腺炎(Ⅲa型)/慢性骨盆疼痛综合征(Ⅲb型)(chronicprostatitis/chronicpelvicpainsyndromes,慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征)，相当于传统分类方法中的CNP和PD，是前列腺炎中最常见的类型，约占慢性前列腺炎的90％以上。主要表现为长期、反复的骨盆区域疼痛或不适，持续时间超过3个月，可伴有不同程度的排尿症状和性功能障碍，严重影响患者的生活质量。同时，其庞大的患者人群和高昂的医疗费用给公共卫生事业造成了较大的经济负担。
由于目前对慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的病因、发病机制至今未能明确，病理生理学改变还不十分清楚，对前列腺炎的确诊、病情轻重的判断、治疗方法的选择以及疗效评价等诸多方面，国内外均无明确的标准可依，所以目前绝大多数临床医师在临床诊治前列腺炎过程中感到比较困难。
2001年，Tsavaler等用人类前列腺特异性互补DNA文库的方法鉴别出了一种新型基因。这种基因编码分子量约为130ku的蛋白，与TRP通道蛋白有高度同源性，被命名为TRPM8。人类编码TRPM8的基因位于染色体部位2q37.1，全长102.12kb，由25个外显子构成。它编码的mRNA可以翻译为含有1104个氨基酸的蛋白质。对已公布的基因组序列的分析说明TRPM8在所有被研究的恒温脊椎动物中均有表达。Julius等发现TRPM8是一种冷激活的温度觉TRP通道。Tsavaler等在一些原发肿瘤如乳腺、结肠、肺和皮肤来源的肿瘤中也有表达。随后的研究发现TRPM8mRNA或蛋白还存在与背根神经节和三叉神经的感觉神经元，以及肠系膜迷走神经节，胃底、血管平滑肌、肝脏、膀胱上皮和男性生殖系统中。
发明内容
本发明公开了TRPM8蛋白及抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂与治疗药物中的应用，运用“单克隆抗体”技术原理研制的抗TRPM8抗体酶联免疫诊断试剂盒或荧光免疫层析法/均相免疫荧光法诊断试剂，能快速、特异性的诊断出患者所患的疾病是否为慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征并评估出病情的进展情况或治疗效果，使慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者得到及时的治疗，有效提高患者的生活质量；或者通过给慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者以抗TRPM8抗体来治疗该疾病。
本发明具体技术方案如下：
一种TRPM8相关多肽片段，其特征在于氨基酸序列片段如SEQIDNo:1-6所示。
本发明所述的TRPM8相关多肽片段选自TRPM8蛋白全部氨基酸序列中的不同长度多肽片段，以人源的TRPM8蛋白为例，例如：1025-1104段选择如下序列：TRPM8-1:KINTKANDTSEEMRHRFRQLDTKLND(SEQID:No1)，TRPM8-2:FKNEDNETLAWEGVMKENYL(SEQID:No2)，或者在916-953段选择如下序列：TRPM8-3:DGTTYDFAHCTFTGNESKPL(SEQID:No3)，或者在1-692段选择如下序列：TRPM8-4:VSRNLGPKIIMLQ(SEQID:No4)，TRPM8-5:DEVRQWYVNGVNYFTD(SEQID:No5)，TRPM8-6:LTVIKMEEAGDEIVSNA(SEQID:No6)。
本发明还公开了TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂中的应用。
本发明所述TRPM8蛋白可选自任意动物来源的TRPM8蛋白，优选哺乳动物来源，更优选人源。以人源或鼠源为例，其信息如表1所示：
表1
物种 人类 鼠类
Entrez 79054 171382
Ensembl ENSG00000144481 ENSMUSG00000036251
UniProt Q7Z2W7 Q148W9
mRNA序列 NM_024080 NM_134252
蛋白序列 NP_076985 NP_599013
基因位置 Chr 2:234.49–234.59Mb Chr 1:90.15–90.22Mb
本发明所述的应用，所述诊断试剂可以但不限于免疫诊断试剂、生化诊断试剂、荧光免疫层析法诊断试剂或者均相免疫荧光法诊断试剂。
本发明所述的应用的一种优选方案为通过免疫学方法利用TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段，检测生物体，例如人，包括但不限于血清、血浆、前列腺液等体液中的TRPM8蛋白分子或TRPM8相关多肽片段的抗体，或者利用由任何种属动物制备的或基因工程方法合成的TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的多克隆或单克隆抗体检测人包括但不限于血清、血浆、前列腺液等体液中的TRPM8蛋白分子或TRPM8相关多肽片段的水平。
上述免疫学方法包括但不限于括酶免疫分析(包括非均相酶免疫测定方法、均相酶免疫测定方法)，利用荧光免疫测定方法、电化学发光免疫测定方法或化学发光免疫方法进行测定的发光免疫分析(包括酶促化学发光、非酶促化学发光)，放射免疫分仪析(包括放射免疫分析方法、免疫放射分析或免疫放射度量分析方法)，免疫浊度分析(包括免疫透射比浊法、免疫散射比浊法)，时间分辨荧光免疫分析等技术方法。
以ELISA方法为例，具体方法为：用纯化的人TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段通过包被缓冲液稀释后包被在酶标版上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体的酶标试剂，形成TRPM8-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液，所述酶底物溶液在辣根过氧化物酶催化下变色，并在酸作用下转化为最终的颜色，利用颜色深浅来检测样品中TRPM8蛋白抗体的水平。
或者，用纯化的抗人IgG抗体通过包被缓冲液稀释后包被在酶标版上的微孔内制成固相抗体，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗体测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的人TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段抗体的酶标试剂，形成TRPM8-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液，所述酶底物溶液在辣根过氧化物酶催化下变色，并在酸作用下转化为最终的颜色，利用颜色深浅来检测样品中TRPM8蛋白的水平。
以免疫均相法为例，具体方法为：在支撑板上依次贴上NC膜、吸水垫、喷涂有荧光标记抗体的结合垫及已于展开剂中浸润并烘干的玻璃纤维，组装好免疫层析试纸条。在三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，均匀平行地将TRPM8蛋白或TRPM8蛋白相关多肽片段作为包被抗原(T线)和羊抗人或鼠IgG(C线)在NC膜上喷洒成粗细适中的2条线。置于37℃控温箱烘干1h后取出，切条机切成4mm±2mm等宽试纸条，与干燥剂一起装入铝箔袋中密封保存。然后取待检品滴加于试纸条样品垫适宜位置，层析后在特征激发(320nm)、发射(620nm)波长下拍照检测。按照上述方法分别进行灵敏度、特异性及模拟阳性样品检测。当待检品沿试纸条通过毛细作用从下向上虹吸时，根据层析原理，在层析移动过程中，经试纸条检测端，向另一端移动，先后依次经过结合垫、NC膜上T线和C线到达吸水垫。层析后，若C线不显色，则试纸条视为无效；若C线显色，则试纸条视为有效。若C线显色而T线不显色，则测试结果为阳性；若C、T线均显色，则测试结果为阴性。
以通过荧光法检测进行的酶免疫均相法为例，具体方法为：将0.1ml的标准液或血清与0.01ml抗体试剂或空白抗体试剂于30℃孵育30min。然后加入酶试剂(0.04ml),混合物于30℃孵育15min。最后加入0.45ml底物,于30℃孵育1h后,加入13g/L十二烷基硫酸钠0.05ml中止反应,用荧光法测定形成的NADPH。
本发明公开了慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征和人体内包括但不限于血清、血浆、前列腺液等体液中的TRPM8或其抗体含量的关联性。慢性前列腺炎(CP)和慢性骨盆疼痛综合征(CPPS)是自身免疫系统对体内的TRPM8蛋白耐受性降低转而攻击表达有该蛋白的细胞所导致的一种自身免疫疾病。因此可以通过检测人体内包括但不限于血清、血浆、前列腺液等体液中的TRPM8或其抗体含量水平来明确慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的临床诊断并评估出病情的进展情况或治疗效果。
根据临床慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者发病情况，经过统计分析，慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征发病与TRPM8或其抗体表达量或者检测量的关系如表2所示：
表2
本发明所述TRPM8蛋白或其相关多肽片段的单克隆抗体，可采用本领域常规方法制备而成。
本发明还公开了一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征ELISA诊断试剂盒，其特征在于试剂盒包括：
(1)已包被TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段的固相载体(免疫吸附剂)和酶标记的抗IgG抗体(结合物)，优选抗人IgG抗体；或者，已包被抗IgG抗体的固相载体(免疫吸附剂)，优选抗人IgG抗体，和酶标记的TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段的抗体(结合物)，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示；
(2)酶的底物；
(3)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中)；
(4)结合物及标本的稀释液；
(5)洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05％吐温20磷酸缓冲盐水；
(6)酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
本发明还公开了一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试纸，其特征在于所述试纸以固定有检测线T和控制线C的条状纤维层析材料为固定相，检测线T处以条带状包被有TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段，控制线C处以条带状包被有IgG抗体，待测样品中的TRPM8抗体在检测线T处发生特异性免疫反应，待测样品中的其它游离物在C线处发生免疫反应；
或者，所述试纸以固定有检测线T和控制线C的条状纤维层析材料为固定相，检测线T处以条带状包被有TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段相应的抗体，控制线C处以条带状包被有IgG抗体，待测样品中的TRPM8蛋白在检测线T处发生特异性免疫反应，待测样品中的其它游离物在C线处发生免疫反应；所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。
本发明还公开了TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备治疗慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征药物中的应用，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。可通过免疫学方法利用任何种属动物制备的或基因工程方法合成TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的多克隆或单克隆抗体。
具体的，通过静脉或皮下注射1000～30000IU的TRPM8蛋白或其相关多肽片段的单克隆或多克隆抗体，可以治愈或明显缓解慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的临床表现。
本发明有益效果：
1.本发明公开了TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂中的应用，通过检测患者体液中的TRPM8蛋白分子或TRPM8相关多肽片段或其抗体的水平，有效的对慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征进行诊断，并且能够有效区别其它前列腺疾病；
2.本发明还公开了TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备治疗慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征药物中的应用，通过静脉或皮下注射1000～30000IU的TRPM8蛋白或其相关多肽片段的单克隆或多克隆抗体，可以治愈或明显缓解慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的临床表现。
附图说明
图1为各组前列腺病理切片HE染色结果。
图2为各组前列腺组织病理评分结果(**p＜0.01VS空白对照组)。
图3为各组前列腺组织CD3免疫荧光染色结果。
图4为TRPM8相关的多肽片段各组前列腺病理切片HE染色结果。
图5为TRPM8相关的多肽片段各组前列腺组织病理评分结果(**p＜0.01VS空白对照组)。
具体实施方式
实施例1TRPM8相关多肽片段的制备
从TRPM8的跨膜分析来看：处于膜外的有如下几段：1-692，758-796，849-862，916-953，1025-1104。综合各种软件分析，最终选择了以下6个跨膜蛋白的胞外段，选择的氨基酸序列基本上全覆盖了胞外段。即：
T-1:KINTKANDTSEEMRHRFRQLDTKLND(26AA)；
T-2:FKNEDNETLAWEGVMKENYL(20AA)；
T-3:DGTTYDFAHCTFTGNESKPL(20AA)；
T-4:VSRNLGPKIIMLQ(13AA)；
T-5:DEVRQWYVNGVNYFTD(16AA)；
T-6:LTVIKMEEAGDEIVSNA(17AA)。
以上肽段，委托武汉百意欣生物技术有限公司合成得到。TRPM8蛋白购自于ProteinTechGroup公司。
实施例2TRPM8蛋白以及TRPM8相关多肽片段抗原性的检测
为了证明TRPM8蛋白是CP/CPPS诱发的关键以及TRPM8相关多肽片段的抗原致病性，进行了如下实验，基本的实验设计如下：首次使用纯TRPM8蛋白联合完全弗氏佐剂(CompleteFreund'sadjuvant,CFA)来建立CP/CPPS的动物模型，并与前列腺蛋白匀浆造模方法相比较。与此同时，使用免疫磁珠法将前列腺蛋白匀浆内的TRPM8去除，用之造模作为阴性对照。采用HE染色方法来评价各造模组动物前列腺组织内的炎症严重程度，并对前列腺内的炎症严重程度进行病理评分；采用CD3免疫荧光的方法来观察造模动物前列腺内T淋巴细胞的浸润情况。
取40只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重250±20g(购于上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0006)。无菌条件下摘取SD大鼠前列腺，制备前列腺匀浆蛋白以及去TRPM8蛋白匀浆。免疫动物。实验分组：40只8周龄SD大鼠随机分成4组，即蛋白匀浆组、去TRPM8蛋白匀浆组、纯TRPM8蛋白组和空白对照组，每组10只。免疫8周后，按0.3ml/100g比例腹腔注射10％水合氯醛麻醉各组实验动物，分别收集各组动物的血浆、前列腺。制备前列腺病理切片，将各实验组动物的前列腺切片放入烘箱内，60℃烤片30min，然后按照常规方法，依次将病理切片放入各染色缸内。经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、苏木素和伊红染色、梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，用中性树脂封片，镜下观察和拍照，封片后的病理切片4℃保存。
另外取各各组待检测动物的前列腺组织切片，烘箱内60℃烤片30min，然后进行CD3免疫荧光，最后滴加抗荧光猝灭剂封片，镜下观察，拍照。
参考上述方法，使用TRPM8蛋白相关多肽片段免疫大鼠，制得相应的前列腺组织切片。
T-1组：对应TRPM8相关多肽片段KINTKANDTSEEMRHRFRQLDTKLND(SEQID:No1)；
T-2组：对应TRPM8相关多肽片段FKNEDNETLAWEGVMKENYL(SEQID:No2)；
T-3组：对应TRPM8相关多肽片段DGTTYDFAHCTFTGNESKPL(SEQID:No3)；
T-4组：对应TRPM8相关多肽片段VSRNLGPKIIMLQ(SEQID:No4)组；
T-5组：对应TRPM8相关多肽片段DEVRQWYVNGVNYFTD(SEQID:No5)组；
T-6组：对应TRPM8相关多肽片段LTVIKMEEAGDEIVSNA(SEQID:No6)；Control组：空白对照组；
根据HE染色的结果，对各组动物前列腺炎症程度进行病理评分。0分：无任何炎性细胞浸润，无任何炎症迹象；1分：有少量上皮腺泡萎缩；2分：有大量上皮腺泡萎缩且有轻微的炎性细胞浸润；3：上皮腺泡萎缩严重、腺体内严重充血且有大量炎性细胞浸润。每张前列腺切片均经三名病理学副教授根据上述标准按照随机、双盲原则进行评分，将最后计算得到的平均值作为该动物前列腺炎症程度的病理评分。
采用SPSS19.0进行统计学分析，对各组动物前列腺组织炎症严重程度的病理评分均值进行方差齐性检验和单因素方差分析(One-WayANOVA)，p＜0.05有显著性差异，p＜0.01有极显著性差异。
1.HE染色和病理评分结果
由图1(1为10倍物镜；2为20倍物镜；3为40倍物镜，A：空白对照组；B：蛋白匀浆组；C：纯TRPM8蛋白组；D：去TRPM8蛋白匀浆组)和图2可知，所有蛋白匀浆组动物的前列腺间质内都可见大量的炎性细胞浸润，腺体内可见严重充血；病理评分的均值为2.7778±0.4410(M±SD)。而空白对照组动物的前列腺间质以及血管周围未发现有炎性细胞浸润，病理评分(0.4000±0.5164)也远低于蛋白匀浆造模组。
为了研究是否是前列腺蛋白匀浆内的TRPM8在诱导CP/CPPS发病中的作用，采用免疫磁珠法将TRPM8蛋白从蛋白匀浆中去除。结果显示，去TRPM8蛋白匀浆联合CFA造模组动物前列腺内病理形态学改变、炎性细胞浸润都大大降低；病理评分(0.8000±0.9190)提示，去TRPM8蛋白匀浆组动物前列腺内的炎症程度与空白对照组无显著性差异。
同时，用纯TRPM8蛋白联合CFA来免疫SD大鼠，来进一步验证TRPM8蛋白在CP/CPPS发病中的作用。由图1可知，TRPM8蛋白成功诱导了CP/CPPS的产生：前列腺充血严重、间质内特别是血管周围有大量炎性细胞浸润，病理评分(2.7000±0.4830)也与蛋白匀浆组非常接近。
2.CD3免疫荧光染色结果
由HE染色结果可知，蛋白匀浆组和纯TRPM8蛋白组大鼠前列腺组织内有大量炎性细胞浸润。为了证明这些浸润的细胞含有大量的T淋巴细胞，对CD3分子进行免疫荧光染色。结果如图3(A：空白对照组；B：蛋白匀浆组；C：纯TRPM8蛋白组；D：去TRPM8蛋白匀浆组)所示，在前列腺间质内可见大片红色荧光标记的CD3分子，表明这些浸润的炎性细胞中绝大数为T淋巴细胞，而不是中性粒细胞或巨噬细胞等固有免疫细胞。而空白对照组和去TRPM8蛋白匀浆组中，本来前列腺间质内几乎就没有炎性细胞浸润，而CD3免疫荧光染色又呈阴性，表明其内没有出现T淋巴细胞。
3.TRPM8相关多肽片段的抗原致病性的检测结果，如图4和图5所示，在TRPM8相关多肽片段抗原致病性研究中的实验结果显示：TRPM8相关的多个多肽片段均显示出较强的导致CP/CPPS的致病性。
综上所述，无论TRPM8蛋白本身还是TRPM8相关多肽片段均具有较强的导致CP/CPPS发生的抗原致病性。
实施例3TRPM8蛋白以及TRPM8相关多肽片段抗体的制备
(一)动物的选择与免疫
1.动物的选择：纯种BALB/C小鼠。
2.免疫方案：选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
选择人源TRPM8蛋白全序列以及SEQIDNo:1-6所示的多肽片段为作为抗原，使用福氏完全佐剂，分别免疫小鼠。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8～1ml,0.2ml/点)。3周后，第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml)。3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip(5～7天后采血测其效价)。2～3周后，加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv(静脉内注射)。3天后，取脾融合。
(二)细胞融合
1.细胞融合前准备
(1)骨髓瘤细胞系的选择：
骨髓瘤细胞源自小鼠，接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
(2)饲养细胞：在组织培养中，加饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞。饲养细胞的量为2×104或105细胞/孔。
2.细胞融合的步骤
(1)制备饲养细胞层：选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，用BALB/C小鼠，6～10周。拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)，反复冲洗，吸出冲洗液。冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min，用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，放入37℃CO2孵箱培养。
(2)制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死。无菌取脾脏，培养液洗一次。脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗2次。计数，取108脾淋巴细胞悬液备用。
(3)制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心。用无血清培养液洗2次，计数，取得×107细胞备用。
(4)融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm,6min。
⑤充上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
⑦将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。
(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测
1.HAT选择杂交瘤细胞：脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
2.TRPM8抗体的检测：采用放射免疫测定(RIA)的方法进行。
(四)杂交瘤的克隆化
本发明采用的是有限稀释法克隆：
(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。
(3)调整细胞为3～10个细胞/ml。
(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5％CO2孵箱中。
(5)在第7天换液，以后每2～3天换液1次。
(6)8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。
(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
(8)每个克隆应尽快冻存。
(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏。
1.杂交瘤细胞的冻存细胞冻存液：50％小牛血清；40％不完全培养液；10％DMSO(二甲基亚砜)。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。
2.细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
(六)单克隆抗体的大量生产
本发明应用实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml。
(七)抗体的鉴定
表3
用量 特异性 亲和力 效价
TRPM8 1μg 强 1012L/mol 1:128
T-1 35ng 强 1012L/mol 1:128
T-2 35ng 强 1012L/mol 1:128
T-3 35ng 强 1012L/mol 1:128
T-4 35ng 强 1012L/mol 1:128
T-5 35ng 强 1012L/mol 1:128
T-6 35ng 强 1012L/mol 1:128
实施例4一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征ELISA诊断试剂盒
(1)已包被TRPM8蛋白(1μg)或者TRPM8相关多肽片段(35ng)的固相载体和酶标记的抗人IgG抗体；或者，已包被抗人IgG抗体(1μg)的固相载体和酶标记的TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段的抗体(1μg)，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示；
(2)酶的底物；
(3)阴性对照品、阳性对照品和/或参考标准品和控制血清各0.5毫升；
(4)结合物及标本的稀释液各1.0毫升；
(5)洗涤液5毫升；
(6)酶反应终止液2毫升。
选取60例临床检测者，使用本发明所述试剂盒(TRPM8和TRPM8相关多肽片段的试剂盒)对检测者血浆进行检测，包括15例健康人，15例临床上已经确诊为CP/CPPS的患者，15例细菌性前列腺炎患者，15例前列腺癌患者，验证本发明所述试剂盒的检测准确率。结果如表5所示。其中15例细菌性前列腺炎患者中有12例的检测值小于10ng/ml，排除率为80％，15例前列腺癌患者的检测值均大于500ng/ml，排除率为100％。说明本发明所述试剂盒能够有效的对CP/CPPS患者进行诊断，并且能够有效鉴别CP/CPPS与其它前列腺疾病，如细菌性前列腺炎和前列腺癌。
表4诊断标准
表5
实施例5一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试纸
在支撑板上依次贴上NC膜、吸水垫、喷涂有荧光标记抗体的结合垫及已于展开剂中浸润并烘干的玻璃纤维，组装好免疫层析试纸条。在三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，均匀平行地将TRPM8蛋白或TRPM8蛋白相关肽段，浓度10ng/kg，用量100ul作为包被抗原(T线)和羊抗人或鼠IgG，浓度10ng/kg，用量100ul(C线)在NC膜上喷洒成粗细适中的2条线。置于37℃控温箱烘干1h后取出，切条机切成4mm±2mm等宽试纸条，与干燥剂一起装入铝箔袋中密封保存。然后取待检品滴加于试纸条样品垫适宜位置，层析后在特征激发(320nm)、发射(620nm)波长下拍照检测。按照上述方法分别进行灵敏度、特异性及模拟阳性样品检测。当待检品沿试纸条通过毛细作用从下向上虹吸时，根据层析原理，在层析移动过程中，经试纸条检测端，向另一端移动，先后依次经过结合垫、NC膜上T线和C线到达吸水垫。层析后，若C线不显色，则试纸条视为无效；若C线显色，则试纸条视为有效。若C线显色而T线不显色，则测试结果为阳性；若C、T线均显色，则测试结果为阴性。
表6
无效：质控区(C)未出现色带，表明不正确的操作过程或试剂条已变质损坏，重新进行检测。
注意：试剂条质控线与测试线的色带可因体液中TRPM8或TRPM8抗体含量多少而显现出颜色深浅，结果判定按上述标准进行。为保险起见，可以在3天后再测一次。
实施例6TRPM8蛋白以及TRPM8相关多肽抗体对慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者的治疗作用分别制备TRPM8蛋白以及TRPM8相关多肽的单克隆抗体，静脉或皮下注射1000～30000单位，日一次，每疗程14天，使用剂量与临床表现之间的关系如表7所示。
表7
结果如表8所示，结果表明TRPM8以及TRPM8相关多肽的单克隆抗体可以有效治愈或减轻慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征。
表8

Claims (9)

1.一种TRPM8相关多肽片段，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。
2.TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂中的应用，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述诊断试剂是免疫诊断试剂、生化诊断试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用通过免疫学方法利用TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段检测生物体体液中的TRPM8蛋白分子抗体或TRPM8相关多肽片段抗体的表达水平；
或者，利用任何种属动物制备或基因工程方法合成TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的多克隆或单克隆抗体，检测生物体体液中的TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的表达水平。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述免疫学方法包括酶免疫分析，利用荧光免疫测定方法、电化学发光免疫测定方法或化学发光免疫方法进行测定的发光免疫分析、放射免疫分析，免疫浊度分析，时间分辨荧光免疫分析的技术方法。
6.一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征ELISA诊断试剂盒，其特征在于试剂盒包括：
(1)已包被TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段的固相载体和酶标记的抗IgG抗体，或者，已包被抗IgG抗体的固相载体和酶标记的TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段的抗体，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示；
(2)酶的底物；
(3)阴性对照品、阳性对照品和/或参考标准品和控制血清；
(4)结合物及标本的稀释液；
(5)洗涤液；
(6)酶反应终止液。
7.一种慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试纸，其特征在于所述试纸以固定有检测线T和控制线C的条状纤维层析材料为固定相，检测线T处以条带状包被有TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段，控制线C处以条带状包被有IgG抗体，待测样品中的TRPM8抗体在检测线T处发生特异性免疫反应，待测样品中的其它游离物在C线处发生免疫反应；
或者，所述试纸以固定有检测线T和控制线C的条状纤维层析材料为固定相，检测线T处以条带状包被有TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片段相应的抗体，控制线C处以条带状包被有IgG抗体，待测样品中的TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段在检测线T处发生特异性免疫反应，待测样品中的其它游离物在C线处发生免疫反应；
所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。
8.TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备治疗慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征药物中的应用，所述TRPM8相关多肽片段氨基酸序列如SEQIDNo:1-6所示。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于通过免疫学方法利用任何种属动物制备的或基因工程方法合成TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的多克隆或单克隆抗体；或者通过化学方法或基因工程方法合成TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段。
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