CN105274085A - 一种由CS/SiO2超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法，属于固定化酶制备技术领域。该固定化漆酶是以由二氧化硅/壳聚糖超薄膜构筑的块体大孔复合材料为载体，将漆酶通过物理吸附法固定在载体上。其制备方法包括载体的制备和漆酶的固定两个步骤。载体的制备：将壳聚糖吸附在SiO₂大孔材料孔壁表面，再用双功能交联剂交联壳聚糖大分子，制备出由二氧化硅/壳聚糖超薄膜构筑的载体成品；漆酶的固定：将载体浸入漆酶溶液，在室温下振荡反应，经洗涤、干燥，得固定化漆酶成品。本发明提供了一种新型固定化漆酶及其制备方法，具有制备工艺简单，成本低廉，固定化漆酶活力高、性质稳定等特点。

Description

一种由CS/SiO2超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法。

背景技术

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于多种生物体内。漆酶具有宽泛的底物专一性和较好的稳定性，能催化氧化多种难降解有机污染物，包括酚类化合物、多环芳烃、多氯联苯及其衍生物、除草剂、杀虫剂等，它在废水处理、生物传感器构建、生物制浆、食品加工以及有机合成等方面有重要应用价值。因此，国内外科学家在生物、化学、物理、医学等多领域对漆酶开展了广泛的研究工作。

游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活、易混入产品和不易循环利用等使其应用受到限制。对漆酶进行固定化是实现其重复利用、改善其稳定性的有效方法。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

漆酶固定化的方法主要有物理方法和化学方法两种。物理方法主要有吸附法、包埋法和离子交换法，化学方法主要有共价结合法和交联结合法。近年来国际上对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，使用的载体包括壳聚糖、亲水性微滤膜、SiO₂纳米颗粒、介孔SiO₂和介孔碳等多种材料。但是现有的固定化漆酶普遍存在着生产成本高、制备工艺复杂、分离效果差、重复使用率低等缺点。

复合材料是由两种或两种以上不同性质的材料通过物理或化学的方法，在宏观上组成具有新性能的材料。各种材料在性能上互相取长补短，产生协同效应，使复合材料的综合性能优于原组成材料而满足各种不同的要求。壳聚糖的分子结构中含有大量自由的氨基和羟基，因此壳聚糖具有聚阳离子、螯合、易成膜、pH敏感、湿度敏感等性质和较高的化学活泼性，其分子中大量的氨基和羟基能与大孔二氧化硅材料中的羟基形成氢键，可以很好地吸附在SiO₂大孔材料孔壁表面成膜，形成有机-无机大孔复合材料。将该材料用于固定化漆酶，可体现其优异的性能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料为载体的固定化漆酶及其制备方法。

本发明所提供的固定化漆酶的制备方法是，以我们前期制备的块体(长、宽、高为0.2～0.4cm)SiO₂大孔材料(RuifengZhang，NengbingLong，LeleZhang，ThinSolidFilms，517(2009)，6677-6680)为原料；利用该大孔材料具有稳定的骨架结构、孔径大、传质效率高、孔道表面含有丰富的羟基等诸多特点，采用物理吸附法将壳聚糖吸附在SiO₂大孔材料孔壁表面，再用双功能交联剂交联壳聚糖大分子，形成一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料。以所制备的大孔复合材料为载体，将漆酶通过物理吸附作用固定在该载体上。具体制备方法如下：

(1)载体的制备：称取一定质量的壳聚糖溶于质量分数为1～3％的乙酸溶液中，配制成质量分数为0.5～5％的壳聚糖溶液；称取所需干燥的块体SiO₂大孔材料浸入壳聚糖溶液中，在室温下振荡1～12h，滤出大孔材料、真空干燥；先用碱溶液反复冲洗、再用蒸馏水反复冲洗，50～80℃下干燥2h；将干燥的大孔材料浸入含双功能交联剂质量分数为1～3％的溶液中振荡反应3～12h，滤出大孔材料、用蒸馏水反复冲洗、真空干燥，即得固定化酶所用的载体。

(2)漆酶的固定：将步骤(1)中得到的载体浸入用缓冲溶液配制的漆酶溶液中，在5～30℃下振荡2～12小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

步骤(1)中所述的碱溶液为氨水或碳酸钠水溶液中的一种；所述的双功能交联剂为戊二醛、乙二醛、乙二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的一种。

步骤(2)中所述的漆酶溶液的浓度为1～80mg·ml^-1、pH值为2～7；缓冲溶液可以是醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐中的一种或两种。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)本发明提供的固定化漆酶，制备工艺简单，成本低廉；(2)本发明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高，可以达到90％以上；(3)本发明使用块体大孔复合材料固定化漆酶，易从反应体系中分离出来、便于重复使用、应用于实际生产中。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，本发明的范围不受实施例的限制。

实施例1：

(1)称取0.4g壳聚糖，加入质量分数为2％的乙酸溶液中，配制成质量分数为1％的壳聚糖溶液；

(2)称取2g块状SiO₂大孔材料于80℃下干燥2h，置于含1％壳聚糖溶液的磨口锥形瓶中，在25℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡6小时、滤出大孔材料、在50℃下干燥2h，先用0.1M的碳酸钠溶液反复冲洗、再用蒸馏水反复冲洗，60℃下干燥2h；

(3)将上述干燥后的大孔材料浸入含乙二醇二缩水甘油醚质量分数为3％的溶液中振荡反应6h，滤出大孔材料、用蒸馏水反复冲洗、真空干燥，即得固定化酶用的载体；

(4)称取1g载体，浸入10ml用pH＝4.5缓冲溶液配置的浓度为20mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在30℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡2小时、滤出块体材料，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，即得固定化漆酶。其酶活为66.5U·g^-1(定义一分钟使1μmol的ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位U)。

实施例2：

(1)称取0.8g的壳聚糖，加入质量分数为2％的乙酸溶液中，配成质量分数为2％的壳聚糖溶液；

(2)称取2g块状SiO₂大孔材料于80℃下干燥2h，置于含2％壳聚糖溶液的磨口锥形瓶中，在30℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡10小时、滤出大孔材料、在50℃下干燥3h，先用0.1M的碳酸钠溶液反复冲洗、再用蒸馏水反复冲洗，60℃下干燥2h；

(3)将上述60℃下干燥后的大孔材料浸入含戊二醛质量分数为1％的溶液中振荡反应12h，滤出大孔材料、用乙醇和蒸馏水反复冲洗、真空干燥，即得固定化酶用的载体；

(4)称取2g载体，浸入20ml用pH＝4.5缓冲溶液配置的浓度为40mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在30℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡4小时后用8～10目的筛网滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，即得固定化漆酶。其酶活为136.8U·g^-1。

Claims (3)

1.一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶，其特征在于，该固定化漆酶呈大尺寸的块状，易从反应体系中分离，便于重复使用；孔径大，孔道完全开放，传质效率高。

2.一种由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用缓冲溶液配制一定浓度的漆酶溶液；将由CS/SiO₂超薄膜构筑的块体大孔复合材料浸入漆酶溶液中，在5～30℃下振荡2～12小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲溶液可以是醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐中的一种或两种，所述的漆酶溶液的浓度为1～80mg·ml^-1、pH值为2～7。