CN105255787B

CN105255787B - 食窦魏斯氏菌xhr1及其应用、含有食窦魏斯氏菌xhr1的泡菜

Info

Publication number: CN105255787B
Application number: CN201510799941.0A
Authority: CN
Inventors: 饶瑜; 李成龙; 何鹏晖; 杨建涛; 罗军; 蒋倩; 常伟; 车振明
Original assignee: Xihua University
Current assignee: Xihua University
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: CN105255787A

Abstract

本发明提供一种食窦魏斯氏菌XHR1及其应用、含有食窦魏斯氏菌XHR1的泡菜。其中，泡菜的制备包括:在用于腌制泡菜的泡菜发酵起始液中加入食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液和植物乳杆菌CICC 20764菌粉，最终使食窦魏斯氏菌XHR1的终浓度为10⁶～10⁷CFU/mL，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁵～10⁶CFU/mL，然后加入蔬菜到泡菜发酵起始液中，按照传统蔬菜发酵工艺进行蔬菜泡制，最终得到本发明泡菜。本发明将抑制白色念珠菌生长的益生乳酸菌用于四川泡菜发酵，消费者群体更广泛，可以改善广大受众消化道的微生态水平，从公用卫生的角度控制白色念珠菌疾病。

Description

食窦魏斯氏菌XHR1及其应用、含有食窦魏斯氏菌XHR1的泡菜

技术领域

本发明涉及食品技术领域，尤其涉及一种食窦魏斯氏菌XHR1及其应用、含有食窦魏斯氏菌XHR1的泡菜。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)是一种在人类口腔、消化道和阴道中共生的酵母菌，是常见的人类致病真菌，可引起黏膜和全身性的感染，特别是免疫力低下的人群。念珠菌为阴道内正常寄生菌，对于维持阴道内正常生态平衡起重要作用。国外统计资料显示约75％的女性一生中至少患过一次外阴阴道念珠菌病，其中40％-50％的女性发病2次或以上。白色念珠菌也是口腔中重要的条件致病微生物，是包括儿童“鹅口疮”在内的许多口腔疾病的致病菌。目前用于治疗白色念珠菌病的药物包括唑类(如氟康唑(fluconazole))、多烯类(如两性霉素B)、丙烯胺类(如奈替芬(naftifine))等，也包括一些中药制剂。这些药物主要是抑制白念珠菌细胞膜中主要成分麦角甾醇的合成或与之结合，抑制细胞膜合成、改变白念珠菌细胞膜流动性与通透性，从而导致细胞死亡。但现有的药物治疗方式已逐渐出现一些问题，主要包括三个方面。首先，药物的副作用，譬如引起肝脏损害、阴道出血、出血性胃炎、精神障碍等。若妊娠期妇女感染白念珠菌，药物的副作用影响更大。其次，药物引起的阴道微生态失衡也是念珠菌性阴道炎发病与复发的重要原因。抗真菌药物大都具有广谱抗菌性，在治疗的同时会进一步引起机体的菌群失调，埋下健康隐患，对机体造成继发性影响。第三，由于外阴阴道念珠菌病的常见性和反复性，药物的反复治疗会引起白念珠菌的耐药性。

由于对白色念珠菌疾病采用抗真菌药进行局部或全身治疗的临床效果欠佳，复发率高，近年来，将乳酸菌制剂用于该病的治疗也逐渐发展起来。乳酸菌制剂对肠胃、阴道局部微生物环境具有稳定的作用，治疗念珠菌性阴道炎的临床效果良好，且与现有药物疗法不发生交叉反应。已有研究采用阴道直接给药的方式将复合乳酸菌制剂用于细菌性和念珠菌性阴道炎的治疗，结果表明乳酸菌能够在阴道中长期存活并减少阴道炎的复发。也有研究将产过氧化氢的瑞士乳杆菌HY7801(Lactobacillus helveticus HY7801)喂食老鼠，发现瑞士乳杆菌HY7801能通过老鼠消化道进入阴道中，并使白色念珠菌数量减少，能够有效的抑制外阴阴道念珠菌病。在我国也有报道乳酸菌阴道胶囊在念珠菌性阴道炎治疗中的作用，临床疗效满意。另外，目前治疗白色念珠菌疾病一般是在机体已患病后再采取治疗措施，而白色念珠菌病是常见的疾病，应从日常生活中对其进行较为普及和广泛的预防，比如食用能够特异性抑制白色念珠菌的乳酸菌，在机体中形成良好的微生物生态，有效预防白念珠菌性消化道、生殖道疾病的发生。乳酸菌是食品安全级微生物(generally regardedas safe,GRAS)，通过食用乳酸菌来控制念珠菌病，对患者或消费者更为安全。

通过食用富含乳酸菌的食品来补充机体中益生菌数量和改善消化道微生态，比直接使用乳酸菌粉剂、胶囊等更容易让消费者接受，酸奶就是该类食品的典型例子。四川泡菜也是典型的乳酸菌发酵食品，其消费者群体比酸奶更加广泛。四川泡菜是中国典型发酵蔬菜之一，其产、销量居全国第一。将新鲜洗净的蔬菜经简单切分后，置于含有盐卤的发酵坛或发酵池中，经过以乳酸菌为主的微生物通过厌氧发酵数十天，即可获得发酵成熟的蔬菜。在四川，几乎家家户户都进行蔬菜发酵，既是日常用餐的常见佐餐，也是川菜制作必不可少的调味品。通过食用富含乳酸菌的四川泡菜补充益生菌，受众广泛。

发明内容

本发明的目的在于通过制备食窦魏斯氏菌XHR1菌种，来制备一种有助于消费者健康，具体来说有助于抑制白色念珠菌生长的泡菜。

一种食窦魏斯氏菌XHR1菌株，保藏编号为CGMCC No.9840，分类命名为食窦魏斯氏菌Weissella cibaria。

如上所述的食窦魏斯氏菌XHR1菌株在泡菜发酵中的应用。

如上所述含有食窦魏斯氏菌XHR1的泡菜，通过以下制备方法制得：

(1)蔬菜模拟培养基的制备：

将新鲜洗净的蔬菜加水打成匀浆，然后将匀浆过滤，过滤后的蔬菜汁按质量百分比加入0.80％豆粕粉、4.00％食盐，灭菌后制得蔬菜模拟培养基；

(2)泡菜发酵：

将食窦魏斯氏菌XHR1菌株加入到蔬菜模拟培养基中进行培养，得到食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液；

给泡菜发酵起始液中加入所述食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液和植物乳杆菌CICC 20764菌粉，最终使食窦魏斯氏菌XHR1的终浓度为10⁶～10⁷CFU/mL，使植物乳杆菌CICC20764的终浓度为10⁵～10⁶CFU/mL；然后加入蔬菜到泡菜发酵起始液中，按照传统蔬菜发酵工艺进行蔬菜泡制，最终得到本发明泡菜。

如上所述的泡菜，步骤(1)中，所述蔬菜与水的质量比为1:4。

如上所述的泡菜，步骤(1)中，匀浆过滤时，用滤网孔径50目过滤。

如上所述的泡菜，步骤(2)中，所述食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液的培养方法为：

将食窦魏斯氏菌XHR菌粉加入蔬菜模拟培养基进行培养活化，34℃静置培养40～45h，使菌体浓度达到10⁸～10⁹CFU/mL。

如上所述的泡菜，所述食窦魏斯氏菌XHR1菌粉的制备包括以下步骤：

①将对数生长期的食窦魏斯氏菌XHR1菌株培养液10L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，得到发酵液；

②发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、12％的多孔淀粉及0.1％的聚乙烯吡咯酮，经喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g的食窦魏斯氏菌XHR1菌粉。

如上所述的泡菜，所述高密度培养的培养条件为：1.90％玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.20％酵母浸粉，0.06％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，单位：W/V，初始pH5.8～6.2，发酵温度30℃培养48h。

如上所述的泡菜，所述植物乳杆菌CICC 20764菌粉的制备包括以下步骤：

将对数生长期的植物乳杆菌2076410L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：2.00％玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.10％酵母浸粉，0.05％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，单位：W/V，初始pH5.8～6.2，发酵温度35℃培养48h，得到菌体密度可达6.18～8.29×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g的植物乳杆菌CICC 20764菌粉。

四川发酵蔬菜的产业化生产也逐年扩大，其年产量可达几十万吨，产生几十万产值，消费群体已远不止四川地区。因此，将抑制白色念珠菌生长的益生乳酸菌用于四川泡菜发酵，消费者群体更广泛，可以改善广大受众消化道的微生态水平，从公用卫生的角度控制白色念珠菌疾病。

附图说明

图1为食窦魏斯氏菌XHR1(A)和植物乳杆菌CICC 20764(B)对白色念珠菌的抑制对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的食窦魏斯氏菌XHR1菌株于2013年12月采用平板稀释法从发酵蔬菜盐卤样品中分离得到，经鉴定为食窦魏斯氏菌。抑菌实验表明，食窦魏斯氏菌XHR1培养上清液能够抑制白色念珠菌(Canidia albicans)的生长，抑制率达93％～100％。同时，食窦魏斯氏菌XHR1具有在人体消化道中定植的益生菌特性。

食窦魏斯氏菌XHR1已于2014年10月24日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.9840，分类命名为食窦魏斯氏菌Weissella cibaria。

实施例1：食窦魏斯氏菌XHR1用于笋壳青菜发酵

(1)菌粉1：食窦魏斯氏菌XHR1菌粉的制备

将对数生长期的食窦魏斯氏菌XHR1菌株培养液10L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：1.90％(W/V，以下相同)玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.20％酵母浸粉，0.06％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，初始pH5.8，发酵温度30℃培养48h，得到菌体密度为5.25×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹¹CFU/g的食窦魏斯氏菌XHR1；

(2)菌粉2：植物乳杆菌CICC 20764菌粉的制备

将对数生长期的植物乳杆菌20764菌株培养液10L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：2.00％(W/V，以下相同)玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.10％酵母浸粉，0.05％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，初始pH5.8～6.2，发酵温度35℃培养48h，得到菌体密度为6.18～8.29×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g的植物乳杆菌CICC 20764菌粉；

蔬菜模拟培养基的制备：将新鲜洗净的笋壳青菜切成约3cm×5cm的碎块，按蔬菜总质量与水的质量比为1:4加入自来水，并用匀浆机匀浆，匀浆液用滤网孔径50目过滤，过滤后的蔬菜汁按质量百分比加入0.80％豆粕粉、4.00％食盐，制得蔬菜模拟培养基。

(3)在泡笋壳青菜发酵中的应用：将菌粉1加入蔬菜模拟培养基进行培养活化，34℃静置培养40h，使菌体浓度达到10⁹CFU/mL；在已有2000kg自来水(食盐质量浓度为6％)泡菜池中加入20L XHR1菌粉活化培养液，XHR1的终浓度为10⁶CFU/mL；将菌粉2直接加至四川泡菜发酵起始液中，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁶CFU/mL。加入1000kg洗净的新鲜笋壳青菜，封池自然温度发酵30天，由此泡制好的四川泡菜中食窦魏斯氏菌XHR1占乳酸菌总量的30％，并仍具有白色念珠菌抗性。

实施例2：食窦魏斯氏菌XHR1用于卷心菜发酵

(1)菌粉1：食窦魏斯氏菌XHR1菌粉的制备

将对数生长期的食窦魏斯氏菌XHR1菌株培养液10L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：1.90％(W/V，以下相同)玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.20％酵母浸粉，0.06％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，初始pH6.0，发酵温度30℃培养48h，得到菌体密度为6.32×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹¹CFU/g的食窦魏斯氏菌XHR1；

(2)菌粉2：植物乳杆菌CICC 20764菌粉的制备

蔬菜模拟培养基的制备：将新鲜洗净的卷心菜、白萝卜、胡萝卜切成约3cm×5cm的碎块，按蔬菜总质量与水的质量比为1:4加入自来水，并用匀浆机匀浆，匀浆液用滤网孔径50目过滤，过滤后的蔬菜汁按质量百分比加入0.80％豆粕粉、4.00％食盐，制得蔬菜模拟培养基。

(3)在泡笋壳青菜发酵中的应用：将菌粉1加入蔬菜模拟培养基进行培养活化，34℃静置培养45h，使菌体浓度达到10⁸CFU/mL；在已有2000kg自来水(食盐质量浓度为5％)泡菜池中加入20L XHR1菌粉活化培养液，XHR1的终浓度为10⁶CFU/mL；将菌粉2直接加至四川泡菜发酵起始液中，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁶CFU/mL。加入1000kg洗净的新鲜笋壳青菜，封池自然温度发酵25天，由此泡制好的四川泡菜中食窦魏斯氏菌XHR1占乳酸菌总量的30％，并仍具有白色念珠菌抗性。

实施例3：食窦魏斯氏菌XHR1用于胡萝卜发酵

(1)菌粉1：食窦魏斯氏菌XHR1菌粉的制备

将对数生长期的食窦魏斯氏菌XHR1菌株培养液10L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：1.90％(W/V，以下相同)玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.20％酵母浸粉，0.06％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，初始pH6.2，发酵温度30℃培养48h，得到菌体密度为7.36×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹⁰CFU/g的食窦魏斯氏菌XHR1；

(2)菌粉2：植物乳杆菌CICC 20764菌粉的制备

(3)在泡笋壳青菜发酵中的应用：将菌粉1加入蔬菜模拟培养基进行培养活化，34℃静置培养42h，使菌体浓度达到10⁹CFU/mL；在已有2000kg自来水(食盐质量浓度为8％)泡菜池中加入20L XHR1菌粉活化培养液，XHR1的终浓度为10⁵CFU/mL；将菌粉2直接加至四川泡菜发酵起始液中，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁵CFU/mL。加入1000kg洗净的新鲜笋壳青菜，封池自然温度发酵45天，由此泡制好的四川泡菜中食窦魏斯氏菌XHR1占乳酸菌总量的20％，并仍具有白色念珠菌抗性。

实施例4：食窦魏斯氏菌XHR1用于泡白萝卜发酵

在已有2000kg自来水(食盐质量浓度为6％)泡菜池中加入20L XHR1菌粉活化培养液(制备方法同实施例1)，XHR1的终浓度为10⁶CFU/mL；将菌粉2直接加至四川泡菜发酵起始液中，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁶CFU/mL。加入1000kg洗净的新鲜白萝卜，封池自然温度发酵45天，由此泡制好的泡菜中食窦魏斯氏菌XHR1占乳酸菌总量的30％，并仍具有白色念珠菌抗性。

一、食窦魏斯氏菌XHR1抑制白色念珠菌活性的检测

下述实验中，白色念珠菌均采用菌株ATCC 90028。

1.双层平板法

双层平板法，使用接种环将活化后的食窦魏斯氏菌XHR1和植物乳杆菌CICC 20764(此处作为不能抑制白色念珠菌的阴性对照)在MRS平板表面划2cm左右的直线，于37℃条件下培养36-48h至形成菌株条带。

在10mL的YM软琼脂培养基中加入终浓度约10⁴cfu/mL的白色念珠菌菌悬液，混匀后倾倒于含乳酸菌条带的平板表面，待凝固后于各指示菌适宜温度下倒置培养24-48h，观察食窦魏斯氏菌XHR1和植物乳杆菌E11条带周围抑制指示菌生长受抑制情况。

以乳酸菌线形菌斑中部距离抑菌圈边缘的距离为抑菌效果的衡量标准：“-”表示乳酸菌菌斑完全被指示菌覆盖或中部抑菌距离<1mm，无抑菌效果；“+”表示中部最大抑菌距离在1～4mm之间，“++”表示最大抑菌距离在4-8mm之间；“+++”表示中部最大抑菌距离在8mm以上。

结果如图1和表1所示，食窦魏斯氏菌XHR1对白色念珠菌的生长具有良好的抑制效果。

表1食窦魏斯氏菌XHR1和植物乳杆菌E11对白色念珠菌的抑制效果

2.微量孔板法

将食窦魏斯氏菌XHR1接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24-6h。所得菌液在4℃、8000r/min离心10min后经0.22μm滤膜过滤得食窦魏斯氏菌XHR1培养上清液，4℃保存备用。使用96孔板，每孔中加入190μL的食窦魏斯氏菌XHR1培养上清液以及10μL浓度约10⁴cfu/mL的白色念珠菌菌悬液，每孔重复三组。设置对照组为每孔190μL的MRS肉汤培养基，并加入10μL相同浓度白色念珠菌菌悬液。在30℃条件下培养48h后于酶标仪630nm下测定其吸光值。乳酸菌的抑菌活性以其对指示菌的抑菌率表示，见下式。

抑菌率(％)＝(1-OD_XHR1/OD_Control)×100

OD_XHR1：乳酸菌无菌体发酵液孔OD值；OD_Control：对照组OD值。

实验结果表明，食窦魏斯氏菌XHR1培养上清液对白色念珠菌的抑制率可达93％-100％。

二、食窦魏斯氏菌XHR1用于四川泡菜发酵

1.食窦魏斯氏菌XHR1作为发酵菌剂发酵四川泡菜

以笋壳青菜为原料制作四川泡菜。将20,000g笋壳青菜加入50L的泡菜坛中，再倒入盐卤直至完全覆盖笋壳青菜，盖上泡菜坛进行厌氧发酵。盐卤的制备方法为：将食窦魏斯氏菌XHR1用蔬菜模拟培养基进行培养活化，30℃静置培养36h，使菌体浓度达到10⁸-10⁹CFU/mL；将食窦魏斯氏菌XHR1活化液加入食盐含量为6％(w/v)的盐水中，使食窦魏斯氏菌XHR1的终浓度为10⁷-10⁸CFU/mL；同时，将植物乳杆菌CICC 20764菌粉同样加入到该盐水中，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁶-10⁷CFU/mL，得到泡菜发酵盐卤。

将泡菜坛置于室温下发酵7-10天后，测坛中盐卤pH，pH达到3.5-4.0时，认为发酵完毕。经该方法制备的泡菜，具有四川泡菜的纯正口味。将发酵好的泡菜盐卤进行微生物检测，分析盐卤中的微生物分布。具体方法为：取1mL泡菜盐卤样品，用无菌生理盐水进行十倍稀释至10^-3-10^-4后，涂布MRS培养基，30℃培养24h。进行平板计数后，分别挑取MRS培养基上的单克隆于5mLMRS液体培养基中，30℃培养过夜，得到若干菌体培养液。用细菌DNA提取试剂盒分别对若干菌体培养液进行基因组提取。以各基因组为模板，Eu27F和1490R为引物进行16S rDNA片段的体外扩增。扩增条件：95℃ 5min，95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min。进行16S rDNA片段的扩增，引物序列见表2。将扩增的16S rDNA片段送至上海华津生物科技有限公司进行测序。将测序结果与GenBank中的序列进行比对，序列相似度在98％以上的两个菌株被认为属于同一个菌种。

表2 16S rDNA PCR扩增引物序列表

实验结果表明，在上述方法发酵的四川泡菜盐卤中，仍可检测到食窦魏斯氏菌XHR1，数量可达10^-5-10^-6CFU/mL。

2.四川泡菜中食窦魏斯氏菌XHR1的抑菌活性

将上述从四川泡菜中分离并鉴定为食窦魏斯氏菌XHR1的菌株进行抑制白色念珠菌活性的检测，方法同“1.双层平板法”。检测结果如下：

表3食窦魏斯氏菌XHR1用于四川泡菜发酵前和发酵后对白色念珠菌的抑制效果

结果表明，食窦魏斯氏菌在发酵四川泡菜后，能够在泡菜产品中检测到，数量可达10^-5-10^-6CFU/mL，并仍具有抑制白色念珠菌生长的活性。

三、食窦魏斯氏菌的益生活性

能够在消化道中存活和定植是益生菌的重要特征之一，研究人员常常利用人工胃液、人工肠液来模拟人体的消化道环境，检测待试菌株在人工胃液和人工肠液中的存活情况。同时，还应检测待测菌株对其他环境压力如高温、高盐的抗性，检测待测菌株的生物安全性如抗生素抗性，对细胞的粘附能力如待测菌株细胞表面疏水性、粘蛋白结合特性、自凝聚以及与治病菌株的共凝聚能力测定等。

1.食窦魏斯氏菌XHR1在人工消化液中的耐受实验

人工消化液的配制：

人工胃液：NaCl 0.20g/100mL，胃蛋白酶0.35g/mL，用1mol/L的HCl调整pH值为2.0、3.0和4.0后，过滤除菌备用。

人工肠液：将下述A液和B液以2:1混合即为人工肠液。

A.胰腺液：重碳酸钠1.1g/100mL，NaCl 0.2g/100mL，胰蛋白酶0.1g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。

B.胆汁液：胆汁酸盐1.8g/100mL，调整pH值为6.8，过滤除菌备用。

挑取食窦魏斯氏菌XHR1单克隆在MRS液体培养基中培养过夜后，取培养液1mL分别接种于9mL pH值为2.0,、3.0和4.0的人工胃液或人工肠液中，37℃培养10小时，测定其活菌数。接种于9mL MRS液体培养基的食窦魏斯氏菌XHR1作为阳性对照。

存活率(100％)＝(人工消化液中XHR1数量/MRS中XHR1数量)*100％

表4食窦魏斯氏菌XHR1在人工胃液和肠液中的存活率

实验结果表明，食窦魏斯氏菌XHR1能够耐受pH3.0的人工胃液和pH6.8的人工肠液，即食窦魏斯氏菌XHR1能够在人体消化道中存活。

2.食窦魏斯氏菌XHR1的抗生素抗性

将200μL食窦魏斯氏菌XHR1菌液(10⁸CFU/mL)涂布MRS琼脂培养基，37℃过夜培养。用灭菌的滤纸片(直径5mm)蘸取不同稀释浓度的抗生素后置于长有食窦魏斯氏菌XHR1的MRS琼脂培养基上，30℃培养24h，滤纸片周围形成可见抑菌圈的，认为对该浓度抗生素不耐受。

实验结果表明(如表5)，食窦魏斯氏菌XHR1对各抗生素均敏感，不会引起生物危害。

表5食窦魏斯氏菌XHR1的抗生素敏感性

注：S，敏感；R，耐受。圆括号中是抗生素对食窦魏斯氏菌XHR1的最小抑制浓度(ug/mL)。SEP，壮观霉素；GEN，庆大霉素；AMP，氨苄青霉素；CEF，头孢噻肟；TET，四环素；CLI，克林霉素；STR，链霉素；PEN，青霉素。

3.食窦魏斯氏菌XHR1对消化道上皮细胞的粘附能力

通过细胞表面疏水性、粘蛋白结合特性实验，来检测食窦魏斯氏菌XHR1对消化道上皮细胞的粘附能力。

细胞表面疏水性：将10mL过夜培养的食窦魏斯氏菌XHR1培养液离心沉淀后，重悬于10mL林格液(6％NaCl，0.0075％KCl，0.01％CaCl₂，and 0.01％NaHCO₃)中，测OD_600nm(前)。将菌悬液分别与等体积的n-十六烷，二甲苯，甲苯，氯仿和乙酸乙酯混合后，漩涡震荡2min。静置分层30min后，测水相OD_600nm(后)。食窦魏斯氏菌XHR1的疏水性计算如下：

疏水性(％)＝(OD_600nm(前)-OD_600nm(后))/OD_600nm(前)

粘蛋白结合实验：将食窦魏斯氏菌XHR1单克隆接种于含0.1％粘蛋白的MRS液体培养基中，37℃培养24h。用50mM Na₂CO₃溶液配制600μg/mL粘蛋白溶液，并加入96孔板中，每孔150μL，4℃静置过夜。用磷酸缓冲液冲洗孔板3次后，加入食窦魏斯氏菌XHR1菌悬液，30℃保温24h，倒掉菌液，并用磷酸缓冲液洗孔板2次后，测定孔板OD_450nm。

结果如表6所示，食窦魏斯氏菌XHR1具有良好的表面吸附性，能够吸附并定植于消化道上皮细胞。

表6食窦魏斯氏菌XHR1的表面吸附性

注：以上结果为3次试验的平均值±标准偏差。

4.自聚和共聚试验

自聚试验：将过夜培养的食窦魏斯氏菌XHR1离心沉淀后，重悬于磷酸缓冲液中，使OD_600nm达到0.5。取4mL菌悬液漩涡震荡10s后，于室温保温5h。取上层悬浮液0.1mL于900μL磷酸缓冲液，测OD_600nm。

自聚率(％)＝1-(A_t/A₀)×100

其中A_t是5h后的光吸收值，A₀是0h时的光吸收值。

共聚试验：将过夜培养的食窦魏斯氏菌XHR1离心沉淀后，重悬于磷酸缓冲液中，使OD_600nm达到0.5。取2mL食窦魏斯氏菌XHR1和2mL白色念珠菌菌悬液(OD_600nm＝0.5)混匀并漩涡震荡10s后，于室温保温5h后，测菌悬液的OD_600nm。

共聚率(％)＝{(A_x+A_y)/2-A(_x+y)}/(A_x+A_y/2)×100

其中x和y分别代表食窦魏斯氏菌XHR1和白色念珠菌。

表7食窦魏斯氏菌XHR1自聚、与白色念珠菌共聚

注：以上结果为3次试验的平均值±标准偏差。

结果如表7所示，食窦魏斯氏菌XHR1具有良好的自聚和共聚能力，能够吸附并抑制白色念珠菌的生长。

总之，食窦魏斯氏菌XHR1能够抑制白色念珠菌的生长；食窦魏斯氏菌XHR1可作为菌剂用于四川泡菜发酵，发酵好的四川泡菜盐卤中仍可检测到10^-5-10^-6CFU/mL的食窦魏斯氏菌XHR1，且食窦魏斯氏菌XHR1仍具有抑制白色念珠菌生长的活性；食窦魏斯氏菌XHR1能够在人体消化道中定植，并能粘附和抑制白色念珠菌的生长。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种食窦魏斯氏菌XHR1菌株，保藏编号为CGMCC No.9840。

2.权利要求1所述的食窦魏斯氏菌XHR1菌株在泡菜发酵中的应用。

3.一种含有权利要求1所述食窦魏斯氏菌XHR1的泡菜，其特征在于，通过以下制备方法制得：

(1)蔬菜模拟培养基的制备：

(2)泡菜发酵：

将食窦魏斯氏菌XHR1菌粉加入到蔬菜模拟培养基中进行培养，得到食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液；

给泡菜发酵起始液中加入所述食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液和植物乳杆菌CICC20764菌粉，使食窦魏斯氏菌XHR1的终浓度为10⁶～10⁷CFU/mL，使植物乳杆菌CICC 20764的终浓度为10⁵～10⁶CFU/mL；然后加入蔬菜到泡菜发酵起始液中，按照传统蔬菜发酵工艺进行蔬菜泡制，得到所述泡菜。

4.根据权利要求3所述的泡菜，其特征在于，步骤(1)中，所述蔬菜与水的质量比为1:4。

5.根据权利要求3所述的泡菜，其特征在于，步骤(1)中，匀浆过滤时，用滤网孔径50目过滤。

6.根据权利要求3所述的泡菜，其特征在于，步骤(2)中，所述食窦魏斯氏菌XHR1菌株的培养液的培养方法为：

7.根据权利要求6所述的泡菜，其特征在于，所述食窦魏斯氏菌XHR1菌粉的制备包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的泡菜，其特征在于，所述高密度培养的培养条件为：1.90％玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.20％酵母浸粉，0.06％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，单位：W/V，初始pH5.8～6.2，发酵温度30℃培养48h。

9.根据权利要求3所述的泡菜，其特征在于，所述植物乳杆菌CICC20764菌粉的制备包括以下步骤：

将对数生长期的植物乳杆菌2076410L接种到1000L的发酵罐中进行高密度培养，培养条件：2.00％玉米浆，2.00％葡萄糖，1.00％乳清粉，1.10％酵母浸粉，0.05％硫酸镁，0.02％硫酸锰，0.20％磷酸氢二钾，0.80％氯化钠，单位：W/V，初始pH5.8～6.2，发酵温度35℃培养48h，得到菌体密度6.18～8.29×10⁹CFU/mL的发酵液；发酵液经80目过滤器过滤，在滤液中添加滤液质量12％的麦芽糊精、滤液质量12％的多孔淀粉及滤液质量0.1％聚乙烯吡咯酮，经低温喷雾干燥后，添加滤液质量4％磷酸三钙做填充剂，涂布平板法检测菌粉菌数，得到活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g的植物乳杆菌CICC 20764菌粉。