CN105213405A - 二氢丹参酮i在制备抗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用，通过对TGFβ1诱导LX-2细胞中纤维化主要标志物(COL1A1、TGFB1、ACTA2、MMP2)mRNA和蛋白水平的抑制作用、对BDL大鼠血清中ALT和AST含量的影响、对BDL大鼠肝脏组织病理变化的改善、对BDL大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响、对大鼠肝脏组织纤维化主要标志物mRNA和蛋白水平的抑制以及对大鼠肝纤维化程度的影响等系统研究证明，二氢丹参酮I具有良好的抗肝纤维化活性，有望研发成为新型的抗肝纤维化药物。

Description

二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用

技术领域：

本发明属于医药领域，涉及一种丹参有效成分二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用。

背景技术：

肝纤维化是继发于各种病因引起肝损伤之后的组织修复代偿反应。肝纤维化发生时肝星状细胞(HSC)异常活化增殖，导致细胞外基质成分(ECM)大量合成及分泌，ECM合成和降解失衡，破坏肝脏的正常结构与功能。肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是慢性肝病发展为肝硬化甚至是原发性肝癌的必经病理过程。因此，所有导致肝硬化损伤的因素同样是肝纤维化的病因。临床上最常见的病因有病毒感染、乙醇过量摄人、肝内脂肪沉积、毒物等。而在我国，乙型肝炎是导致肝纤维化的主要原因(全国约1.3亿人是HBV携带者，慢性肝炎患者2300万)。传统观点认为，肝纤维化这一疾病是不可逆转的，但是近年来研究发现，无论是消除病因或是应用有效的抗纤维化药物，都可能部分或完全逆转患者及模型动物中的肝纤维化，即肝纤维化在一定程度上是可逆的。这对人类能够有效控制肝脏疾病由肝炎、肝损伤向肝硬化、肝癌的恶性进展具有重大意义。迄今为止，虽然已经发现多种药物具有治疗肝纤维化的作用，但由于这些药物仅针对肝纤维化的病因，且多数不良反应较为严重，因此临床上尚未得到推广及认可，如γ-干扰素能逆转免疫紊乱引起的肝纤维化，但因其具有恶心呕吐、头晕头痛，骨髓抑制等副作用，使得其在临床上应用治疗肝纤维化受到极大的限制。中药作为我国文化瑰宝在治疗肝纤维化上展示出了极大的潜力。我国临床使用的抗肝纤维化药物主要有中药及中成药组成，如扶正化瘀胶囊、复方鳖甲软肝片、鳖甲煎丸、小柴胡汤丸等，上述药物均为中药复方制剂，目前暂无中药单方药物上市。

丹参(Salviamiltiorrhiza)为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，是一味常见的中草药，《本草纲目》中记载其具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痈之功效。临床多用于治疗胸痹心痛，脘腹胁痛，心烦不眠，月经不调，疮疡肿痛等症。二氢丹参酮I(DihydrotanshinoneI)为丹参的单体组分之一，CAS号：87205-99-0，分子式C₁₈H₁₄O₃，分子量278.3，分子结构式为：

二氢丹参酮I的药理作用尚未明确阐述，仅有少量文献报道其具有降血脂和放射增敏作用。近年来，本实验室通过对二氢丹参酮I研究发现：作为单药组分，其在体外实验具有良好抗肝纤维化的活性，继而进行了后续的体内研究工作。本实验研究所述二氢丹参酮I的抗肝纤维化作用，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了二氢丹参酮I为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明利用人肝星状细胞LX-2作为体外研究对象，以real-timePCR、WesternBlot为研究方法，验证了二氢丹参酮I对TGFβ1诱导LX-2细胞中肝纤维化主要标志物的mRNA和蛋白水平均具有显著抑制作用。为进一步确定二氢丹参酮I的抗肝纤维化作用，本发明利用胆总管结扎的SD大鼠模型，并对大鼠肝功能、肝组织病理改变、肝组织纤维化程度、胶原纤维含量及肝纤维化相关标志物进行检测，结果显示，二氢丹参酮I能够有效缓解肝纤维化，改善肝脏功能。

本发明用于抗肝纤维化治疗时，二氢丹参酮I腹腔注射给药安全有效，可为日后制备注射剂提供依据。

本发明临床用药可以制成二氢丹参酮I口服剂型和非口服剂型；口服剂型包括片剂、胶囊、散剂、颗粒等，非口服剂型可以是注射液针剂等。

本发明所述二氢丹参酮I给药剂量可根据患者具体病情、年龄及肝肾功能等因素进行调整。

本发明用于制备抗肝纤维化药物时，其辅料及制备方法可选用药学上可接受的任何形式。

附图说明：

图1-Real-timePCR检测二氢丹参酮I对TGFβ1诱导LX-2细胞中肝纤维化主要标志物mRNA水平的影响

其中：**p<0.01与TGFβ1诱导组(给药浓度为零)相比。

图2-WesternBlot检测二氢丹参酮I对TGFβ1诱导LX-2细胞中肝纤维化主要标志物蛋白水平的影响。

图3-二氢丹参酮I对大鼠肝脏组织病理结构的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织HE染色切片结果；B为模型组大鼠肝脏组织HE染色切片结果；C为给药二氢丹参酮I组大鼠肝脏组织HE染色切片结果；D为对所有动物肝脏组织胆管增生情况的统计图；E为对所有动物肝脏组织坏死情况的统计图；*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。图4-二氢丹参酮I对大鼠肝纤维化程度的影响

其中：A为假手术组大鼠肝脏组织天狼星红染色切片结果；B为模型组大鼠肝脏组织天狼星红染色切片结果；C为给药二氢丹参酮I组大鼠肝脏组织天狼星红染色切片结果；D为对所有动物组织天狼星红染色阳性面积的统计图；*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图5-二氢丹参酮I对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响

其中：*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图6-real-timePCR检测二氢丹参酮I对大鼠肝脏组织中肝纤维化主要标志物mRNA水平的影响

其中：*p<0.05与BDL组相比；##p<0.01与假手术组相比。

图7-WesternBlot检测二氢丹参酮I对大鼠肝脏组织中肝纤维化主要标志物蛋白水平的影响

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。

《实施例1》二氢丹参酮I在mRNA及蛋白水平上抑制TGFβ1诱导LX-2细胞中肝纤维化主要标志物试验

1.1TGFβ1诱导LX-2细胞，在含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基，37℃，5％CO2条件下培养LX2细胞。按照每孔1×10⁵个细胞铺于6孔板，培养24小时后，使用真空泵去除6孔板内原有的培养基并加入不含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基。饥饿培养24h后，加入TGF-β1(2ng/ml)诱导，同时加入浓度梯度的二氢丹参酮I(CAS号：87205-99-0)，浓度分别为1μmmol/L、5μmmol/L、10μmmol/L，并且设置对照组(不加入TGF-β1诱导)和TGF-β1诱导组(仅加入TGF-β1诱导)。

1.2继续培养24小时后，弃去培养基，按照AZfresh^TM总RNA小量/微量提取试剂盒说明书操作步骤提取LX-2细胞总RNA。按照RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作步骤，将LX-2总RNA逆转录为cDNA。将所得的cDNA、无菌水、RocheFastStartUniversalProbeMaster(Rox)以及ABITaqManprobes(COL1A1,TGFB1,ACTA2,MMP2)配制成20μl反应体系，使用ABI7500FastReal-TimePCRSystem进行检测。结果显示，随着二氢丹参酮I剂量的增加，COL1A1、TGFB1、ACTA2、MMP2的表达量降低，并且在10μmmol/L时可在mRNA水平上显著抑制COL1A1、TGFB1、ACTA2、MMP2的表达(图1)。

1.3TGFβ1诱导后，继续培养24小时，6孔板中每孔加入1mlRipa裂解液(含1％PMSF)提取蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。以每孔25μg/20μl上样，经电泳、转膜、5％脱脂牛奶封闭、抗体孵育后，使用ChemiImager5500imagingsystem获得所需蛋白条带。结果显示，随着二氢丹参酮I浓度的升高，COL1A1、TGFβ1、α-smoothmuscleactin、MMP2、MMP9的表达量降低，在10μmmol/L时可显著抑制上述标志物蛋白的表达(图2)。

《实施例2》SD大鼠胆总管结扎诱导的肝纤维化模型制备

选体重在180-220g的SD雄性大鼠22只，随机分为假手术组、模型组、二氢丹参酮I给药(25mg/kg)组，其中假手术组6只，模型组8只，二氢丹参酮I组8只。动物实验前禁食不禁水12h后，用异氟烷麻醉动物进行手术。其中模型组和给药组行胆总管结扎(BDL)术，在无菌操作台中，于上腹正中切口，抬高肝缘，拨开十二指肠，分离总胆管2-3cm。在近十二指肠处和近肝门处用000号手术缝合线各结扎两道，从中间剪断胆总管。假手术组仅作上腹正中切口并缝合，不做胆总管结扎。动物麻醉清醒后，正常饮食，自由饮水，腹腔注射青霉素及维生素K3天，以防感染和脏器出血，实验温度(22±2)℃。造模后第2天开始腹腔注射给药，分别给予生理盐水(假手术组、模型组)和二氢丹参酮I25mg/kg(二氢丹参酮I给药组)，每天1次，连续给药14天。

《实施例3》二氢丹参酮I对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST/γ-GT水平升高的抑制作用

取样前禁食不禁水12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，取腹主动脉血。1500rpm离心10min，取血清进行谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)的活性检测。结果显示，二氢丹参酮I能够明显抑制大鼠血清中ALT、AST和γ-GT的含量(表1)，表明二氢丹参酮I能够改善大鼠肝功能。

表1.二氢丹参酮I对BDL诱导的大鼠血清ALT/AST/γ-GT水平的影响

*p<0.05与BDL组相比；#p<0.05与假手术组相比。

《实施例4》二氢丹参酮I对BDL诱导的大鼠肝脏病理结构改变的抑制作用

取样前禁食不禁水12h，处死大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放入10％福尔马林中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。使用苏木素-伊红(HE)染色液进行染色，显微镜下观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示，假手术组大鼠肝脏组织肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，未见胆管增生；BDL后大鼠肝脏组织病理结构发生明显改变，胆管增生十分明显，组织坏死明显增多；二氢丹参酮I给药组的大鼠肝组织结构病理改变缓解，胆管增生情况得到抑制，组织坏死程度显著降低(图3)。表明，二氢丹参酮I能够明显改善BDL大鼠肝脏组织的病理结构。

《实施例5》二氢丹参酮I对BDL诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用

将石蜡切片用天狼星红染液染色，通过观察大鼠肝脏组织纤维化改变情况。结果显示，BDL后大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，二氢丹参酮I给药后，纤维化程度得到明显抑制(图4)。表明，二氢丹参酮I能够明显抑制BDL诱导的大鼠肝纤维化。

《实施例6》二氢丹参酮I对大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量的影响

取样前禁食不禁水12h，处死大鼠，取肝脏组织，精确称取60-100mg，按照南京建成生物工程研究所羟脯氨酸测试盒说明书进行操作。结果显示，与假手术组大鼠相比，BDL组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显升高；与BDL组相比，给药二氢丹参酮I后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量显著降低(图5)。表明，二氢丹参酮I能够明显降低肝脏组织中羟脯氨酸的含量，即二氢丹参酮I能够明显抑制BDL大鼠中胶原纤维的产生。

《实施例7》二氢丹参酮I对BDL诱导的大鼠肝脏组织肝纤维化标志物的抑制作用

取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，切成小块于液氮中暂时保存，随后转移到-80℃保存。准确称取组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1:10的比例加入Trizol和Ripa裂解液(含1％PMSF)，于冰浴中研磨，制备10％肝脏组织匀浆，在3000-4000rpm离心10-15min，取匀浆上清提取总RNA及制备蛋白样品。进行Real-timePCR和WesternBlot检测大鼠肝组织中COL1A1(Col1a1)、TGFβ1(Tgfb1)、α-smoothmuscleactin(Acta2)和MMP2(Mmp2)的表达量变化。结果显示，与假手术组的大鼠相比，BDL组的大鼠肝脏组织中纤维化标志物含量明显升高；与BDL组相比，二氢丹参酮I给药后，大鼠肝脏组织中纤维化标志物含量显著降低(图6、图7)。表明，二氢丹参酮I能够明显抑制大鼠肝脏组织纤维化标志物mRNA和蛋白水平的表达。

Claims (4)

1.二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用。

2.权利要求1所述二氢丹参酮I为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在

制备抗肝纤维化药物中的应用。

3.权利要求1或2所述的应用，其特征是，临床用药可以制成二氢丹参酮I口服

剂型和非口服剂型；口服剂型包括片剂、胶囊、散剂、颗粒等，非口服剂型

可以是注射液针剂等。

4.权利要求1、2或3所述的应用，其特征是，二氢丹参酮I给药剂量可根据病

情轻重以及患者年龄等因素调整改变。