CN110613708A

CN110613708A - 二氢丹参酮ⅰ用作p53激动剂和信号传导及转录激活因子3抑制剂的用途

Info

Publication number: CN110613708A
Application number: CN201910585525.9A
Authority: CN
Inventors: 朱臻宇; 邢心睿; 陈思; 曹奇; 柴逸峰; 曹颖瑛
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2019-12-27

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂和信号传导及转录激活因子3抑制剂中的应用。本发明利用网络药理学和代谢组学数据构建“二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标‑肝纤维化相关蛋白‑代谢物相关蛋白‑代谢物”网络，经网络分析后识别出二氢丹参酮Ⅰ最相关靶蛋白信号传导及转录激活因子3和P53，并通过细胞增殖、细胞凋亡、SPR和Western blotting等体外实验和TAA诱导肝纤维化大鼠的体内实验验证二氢丹参酮Ⅰ通过作用信号传导及转录激活因子3和P53靶标，抑制肝星状细胞活化，并降低肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的积累，发挥改善肝功能、降低肝损伤和抗肝纤维化的作用。

Description

二氢丹参酮Ⅰ用作P53激动剂和信号传导及转录激活因子3抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是提供二氢丹参酮Ⅰ的新的医药用途，具体是二氢丹参酮Ⅰ用作P53激动剂和信号传导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂的用途。

背景技术

肝纤维化是一种可逆的损伤-修复应答反应，是多种致病因素引起肝损伤时的病理反应，是肝损伤发展到肝硬化的必经阶段，其特征是肝损伤后ECM 大量增生。肝纤维化并不是一个独立的疾病，造成肝纤维化的主要原因包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、非酒精性的脂肪肝炎、化学毒物或药物、胆汁淤积性疾病，自身免疫性肝炎和遗传性代谢等疾病。由于ECM积累形成纤维性的瘢痕导致肝脏结构扭曲，随后肝再生结节发展成为肝硬化。肝硬化导致肝细胞功能障碍，肝内血流阻力增加，进而引起肝功能不全、门静脉高压症、急慢性肝功能衰竭和肝细胞癌。目前，在我国约有70％的肝纤维化患者发展成肝癌。而肝移植是肝纤维化晚期-肝硬化患者唯一可用的治疗方法，因此，亟待新的抗纤维化治疗策略。

中药蕴含大量结构多样的天然活性成分，是抗肿瘤新药研发的重要来源。二氢丹参酮Ⅰ是丹参中的亲脂性成分，被认为是肝纤维化的潜在治疗药物。已有的研究报道了二氢丹参酮Ⅰ具有的一些生物学功能，包括肝脏保护作用、抗炎作用，心脏保护作用和抗癌的作用。(Xu J K,Hiroshi K,Zheng J J,Jiang T,Yao X S.[Protective effect oftanshinones against liver injury in mice loaded with restraint stress][J].Yaoxue xue bao＝Acta pharmaceutica Sinica,2006,41(7): 631-5.Wang F,Ma J,Wang KS,Mi C,Lee J J,Jin X.Blockade of TNF-alpha-induced NF-kappaB signalingpathway and anti-cancer therapeutic response of dihydrotanshinone I[J].International immunopharmacology,2015, 28(1):764-72.Wei Y,Xu M,Ren Y,Lu G,XuY,Song Y,Ji H.The cardioprotection of dihydrotanshinone I against myocardialischemia-reperfusion injury via inhibition of arachidonic acid omega-hydroxylase[J].Canadian journal of physiology and pharmacology,2016,94(12):1267-75.Wang L,Hu T,Shen J, Zhang L,Chan R L,Lu L,Li M,Cho C H,Wu WK.Dihydrotanshinone I induced apoptosis and autophagy through caspasedependent pathway in colon cancer[J]. Phytomedicine:international journal ofphytotherapy and phytopharmacology, 2015,22(12):1079-87.)。然而，其抗组织器官纤维化直接作用靶蛋白尚不完全明确。

发明内容

本发明的目的在于利用“蛋白-代谢物”分析策略，将网络药理学和代谢组学结合，筛选出二氢丹参酮Ⅰ最相关靶蛋白；并通过实验验证该靶蛋白。

本发明的第一方面，提供二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂和信号传导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂中的应用。

进一步的，本发明提供二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂中的应用。

本发明实验结果表明，二氢丹参酮Ⅰ通过与P53结合，发挥其对LX-2细胞和T6细胞活性的抑制作用。Western blotting结果分析显示二氢丹参酮Ⅰ可以剂量依赖性地促进LX-2细胞和T6细胞中P53和p-P53的表达。

进一步的，本发明提供二氢丹参酮Ⅰ在制备信号传导及转录激活因子3 (STAT3)抑制剂中的应用。

本发明实验结果表明，二氢丹参酮Ⅰ通过与STAT3蛋白结合，发挥其对 LX-2和T6细胞活性的抑制作用。二氢丹参酮Ⅰ可以剂量依赖性地抑制LX-2 细胞中STAT3和p-STAT3的表达，二氢丹参酮Ⅰ虽不能剂量依赖性地抑制T6 细胞中STAT3的表达，但能明显的抑制其p-STAT3的表达。

本发明还提供二氢丹参酮Ⅰ在制备促进肝星状细胞凋亡，抑制肝星状细胞活化和增殖的药物中的应用。

进一步的，二氢丹参酮Ⅰ通过作用P53和STAT3，促进肝星状细胞凋亡，抑制肝星状细胞活化和增殖。

本发明还提供二氢丹参酮Ⅰ在制备降低肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的积累的药物中的应用。

进一步的，二氢丹参酮Ⅰ可以改善由TAA诱导的肝损伤，并具有改善肝功能、降低肝损伤和治疗肝纤维化的作用。

本发明的第二方面，提供二氢丹参酮Ⅰ作为P53激动剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

本发明的第三方面，提供二氢丹参酮Ⅰ作为信号传导及转录激活因子3 (STAT3)抑制剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

本发明的第四方面，提供二氢丹参酮Ⅰ作为P53激动剂和信号传导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

本发明的第五方面，提供二氢丹参酮Ⅰ作为P53激动剂在制备动脉粥样硬化、乳腺癌、或结肠癌治疗药物中的应用(Biao Hao,Yan Xiao,Fang Song, Xiangshu Long,JingHuang,Maobo Tian,Shiyan Deng,and Qiang Wu， Metformin-induced activation ofAMPK inhibits the proliferation and migration of human aortic smooth musclecells through upregulation of p53 and IFI16.Int J Mol Med.2018 Mar；41(3):1365–1376.Akaogi K,Ono W,Hayashi Y,Kishimoto H, Yanagisawa J.MYBBP1Asuppresses breast cancer tumorigenesis by enhancing the p53 dependentanoikis.BMC Cancer.2013 Feb 7；13:65.Makovski A,Yaffe E, Shpungin S,NirU.Down-regulation of Fer induces ROS levels accompanied by ATM and p53activation in colon carcinoma cells.Cell Signal.2012 Jul；24(7):1369-74.)。

本发明的第六方面，提供二氢丹参酮Ⅰ作为信号传导及转录激活因子3 (STAT3)抑制剂在制备膀胱癌、食管癌、或前列腺癌治疗药物中的应用(Tsujita Y,Horiguchi A,Tasaki S,Isono M,Asano T,Ito K,Asano T,Mayumi Y,Kushibiki T.STAT3 inhibitionby WP1066 suppresses the growth and invasiveness of bladder cancercells.Oncol Rep.2017 Oct；38(4):2197-2204.Zhou C,Ma J,Su M,Shao D, Zhao J,ZhaoT,Song Z,Meng Y,Jiao P.Down-regulation of STAT3 induces the apoptosis and G1cell cycle arrest in esophageal carcinoma ECA109 cells.Cancer Cell Int.2018Apr 4；18:53.Jeon YJ,Jung SN,Chang H,Yun J,Lee CW,Lee J, Choi S,Nash O,Han DC,Kwon BM.Artocarpus altilis(Parkinson)Fosberg Extracts and GeranylDihydrochalcone Inhibit STAT3 Activity in Prostate Cancer DU145Cells.Phytother Res.2015 May；29(5):749-56.)。

本发明有益效果在于：

肝纤维化是大多数慢性肝病中常见的病理过程。本发明利用网络药理学和代谢组学数据构建“二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络，经网络分析后识别出二氢丹参酮Ⅰ最相关靶蛋白STAT3和 P53，并通过细胞增殖、细胞凋亡、SPR和Western blotting等体外实验和TAA 诱导肝纤维化大鼠的体内实验验证二氢丹参酮Ⅰ通过作用STAT3和P53靶标，抑制肝星状细胞活化，并降低肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的积累，发挥改善肝功能、降低肝损伤和抗肝纤维化的作用。

二氢丹参酮Ⅰ在体内外对肝纤维化都具有一定的治疗效果，并具有改善肝功能、降低和改善肝损伤的作用，可成为改善肝功能、降低肝损伤和治疗肝纤维化的一种新型治疗策略。

附图说明

图1.用膜联蛋白V-FITC和PI染色细胞的流式细胞术分析二氢丹参酮Ⅰ 诱导LX-2细胞(A/B)和T6细胞(C/D)的凋亡。以上实验重复三次，并以平均值 (±SD)表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示与对照组相比差异有统计学差异。

图2.二氢丹参酮Ⅰ靶蛋白-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物网络图，图中圆圈中分别表示P53和STAT3靶蛋白。

图3.(A)P53-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物网络；(B) 二氢丹参酮Ⅰ与P53相互作用的SPR分析，P53使用一组连续稀释液一式三份进行动力学测量。该数据是三次独立实验的代表。(C)二氢丹参酮Ⅰ处理后 LX-2细胞(a)和T6细胞(b)对P53、p-P53Western blotting分析。

图4.(A)STAT3-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物网络；(B) 二氢丹参酮Ⅰ与STAT3相互作用的SPR分析。使用一组连续稀释液一式三份进行动力学测量。该数据是三次独立实验的代表。(C)二氢丹参酮Ⅰ处理后 LX-2细胞(a)和T6细胞(b)中STAT3、p-STAT3 Western blotting分析。

图5.二氢丹参酮Ⅰ对血清肝功能标志物、肝脏形态和结构的影响。(A、 B、C、D)分别表示血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的值。(E)H&E染色，放大倍数×100。(F)Sirius Red的三色染色，放大倍数×100。(G、H)分别表示肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的面积。以上实验重复三次，并以平均值 (±SD)表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示与对照组相比差异有统计学差异；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001表示与模型组相比差异有统计学差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

一、试剂与方法：

(一)试剂

二氢丹参酮Ⅰ(纯度≥98％)、索拉非尼(纯度≥98％)购自上海一飞生物科技有限公司，硫代乙酰胺购自东京化成工业株式会社(上海)，Nutlin3购自于Selleck Chemicals(美国)，LX-2细胞(人肝星状细胞)和T6细胞(大鼠肝星状细胞)购自上海复旦IBS细胞资源中心。青链霉素(PS)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、0.25％胰蛋白酶购自康宁公司(美国)；胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司(美国)；培养基购自Sigma(美国)。细胞裂解液、单克隆抗体STAT3、P-STAT3、P-P53、GADPH兔抗获自Cell Signaling Technology(美国)，P53、β-actin鼠抗购自圣克鲁斯生物技术公司(美国)，IRDye680RD 缀合羊抗兔和IRDye800RD羊抗鼠二抗购自LI-COR Biosciences(美国)。

(二)实验方法

1、化学信息数据库的构建

首先，在美国国家生物技术信息中心Pubmed数据中进行文本挖掘，我们获取了271个二氢丹参酮Ⅰ相关的潜在靶标，然后在UniProt Database和RCSB Protein Data Bank数据库中下载每种靶蛋白的晶体结构。

2、二氢丹参酮Ⅰ靶标的预测

采用相似性匹配和分子对接的方法筛选二氢丹参酮Ⅰ的潜在靶标。首先运用相似性匹配的方法，由于具有相似结构的药物可能具有共同的靶标，因此，我们使用药物相似性搜索数据库-ChEMBL寻找与二氢丹参酮Ⅰ结构相似的化合物，为获得更准确结果仅挑选出具有高相似性得分(≥0.9)的化合物；此外，还在ChEMBL中搜索这些相似化合物的靶标，以假设这些可能是二氢丹参酮 Ⅰ的靶标。其次，采用分子对接的方法，分子对接不仅可用于预测药物与其靶蛋白的结合位点和姿势，还可用于评估其结合亲和力(Kitchen D B,Decornez H, Furr J R,Bajorath J.Docking and scoring in virtual screening fordrug discovery: methods and applications[J].Nature reviews Drug discovery,2004,3(11): 935-49.)。随后，我们在分子对接软件Discovery Studio 3.08中使用了libdock 来获得二氢丹参酮Ⅰ相关的潜在靶标和二氢丹参酮Ⅰ之间对接打分。并将靶蛋白与其结合共结晶配体之间的对接打分视为阈值，如果对接打分高于阈值，则此蛋白将被视为二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标。

3、代谢物信息的获取

通过在Pubmed数据中进行文本挖掘，我们获取了肝纤维化的相关代谢物。基于BRENDA数据库可以提供调节代谢物的上游蛋白，我们在此数据库中检索到肝纤维化相关代谢物的蛋白。

4、网络的构建与分析

基于已获取的二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标、肝纤维化靶标、代谢物相关蛋白及代谢物相关数据，在Cytoscape 3.5.1(Smoot M E,Ono K,Ruscheinski J,Wang P L,IdekerT.Cytoscape 2.8:new features for data integration and network visualization[J].Bioinformatics(Oxford,England),2011,27(3):431-2.)中构建“二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标-肝纤维化相关蛋白标-代谢物相关蛋白-代谢物”相互作用网络，靶标或代谢物用节点表示，之间的相互作用关系用边表示。

5、细胞凋亡检测

LX-2细胞和T6在含有10％FBS、0.1％PS的培养基中培养，并在37℃、 5％CO₂的孵箱中进行繁殖生长，培养基每2天换一次。取指数生长期的细胞进行后续实验。使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)通过流式细胞术测定凋亡细胞。将细胞(2×10⁵)接种在六孔板的每个孔上，并用不同浓度的二氢丹参酮Ⅰ处理24h。收获漂浮和贴壁细胞并在PBS中洗涤两次。将细胞重悬于PBS中，室温下在黑暗中用膜联蛋白V/FITC 染色细胞15min，然后加入碘化丙啶(PI)。使用FACS Calibur仪器(BectonDickinson，Mountain View，CA，USA)分析染色细胞。

6、表面等离子体共振(SPR)分析

采用Biacore T200仪器(GE Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，United Kingdom)，使用PBS和5％DMSO流动相，通过应用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联反应，将信号转导与转录激活因子3(STAT3，Abcam，英国)蛋白和P53(Abcam，英国)蛋白固定在 CM4芯片上，恒定流速为30mL/min。根据GEHealthcare提供的方案进行检测。将化合物按梯度浓度(0.5-256μM)溶解在流动相中，注入通道中60s，然后解离120s。使用BIA评估软件3.0(BIAcore)进行分析1：1结合模型的数据。

7、蛋白质的提取及Western blotting

将T6细胞和LX-2细胞接种于6孔板(每孔3×10⁵个细胞)中过夜，然后用各浓度的二氢丹参酮Ⅰ(溶于0.1％DMSO)处理24h。收集二氢丹参酮Ⅰ处理的细胞在冰上用裂解缓冲液进行裂解。然后将裂解物在4℃下以12,000r/min 离心20min以除去不溶物质并在12％SDS-PAGE凝胶上分离。电泳后，将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，室温下用5％脱脂奶粉-TBST中封闭1h，将膜与总STAT3(1：1000)、p-STAT3(1：1000)、P53(1：1000)、p-P53(1：1000)、GADPH(1：5000)一抗在4℃下孵育过夜，最后在室温下用HRP缀合的山羊抗兔(1：10000)或山羊抗鼠二抗(1：10000)孵育2h。使用Odyssey 红外成像系统(LI-COR，UnitedStates)扫描分析蛋白灰度条带。实验中GADPH 作为内参。

8、动物实验

所有动物实验在海军军医大学动物实验中心遵循动物实验的标准操作规范进行。在该研究中使用38只雄性SD大鼠(200-250g，中国科学院上海实验动物中心)，将大鼠在22±2℃，40-60％相对湿度，12h交替光/暗循环的条件下笼养。将动物随机分成5组：对照组(n＝6)，硫代乙酰胺(Thioacetamide， TAA)模型组(n＝8)，TAA+二氢丹参酮Ⅰ(15mg/kg，n＝8)，TAA+二氢丹参酮Ⅰ(30mg/kg，n＝8)，TAA+索拉非尼(n＝8)。除对照组，其余每组连续 8周腹腔注射200mg/kg TAA(每周三次)；从第5周开始，每天灌胃10mL/kg 的生理盐水(对照组/模型组)、15mg/kg的二氢丹参酮Ⅰ(低剂量组)、30mg/kg 的二氢丹参酮Ⅰ(高剂量组)和10mg/kg索拉非尼(阳性药组)，持续四周。对照组大鼠接受正常饮食，不注射TAA，持续8周。

最后一次灌胃24h后，腹腔注射10％水合氯醛将大鼠麻醉(0.3mL/100g)，腹腔主动脉取血，静置。全血以4000r·min-1离心10min取血清，在-80℃ 下储存直至测定。快速切除肝脏后，用冰冷的盐水冲洗并称重，然后将肝脏立即放于液氮中快速冷冻并储存于-80℃直至分析。此外，将每个肝脏的一部分固定在10％多聚甲醛中用于组织学观察。

9、血清生化与肝组织学

使用Hitachi 7100分析仪分析血清丙氨酸转氨酶(Alanine aminotrans， ALT)，天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)，γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)，按照西唐生物科技有限公司(上海)试剂盒的操作说明进行检测。肝组织石蜡切片用苏木精和曙红(Haematoxylin and eosin，H&E)及天狼猩红染色。在低放大倍数(10×物镜，Olympus，IX73)下观察来自每只动物的组织切片，并使用ImageJ分析以计算纤维化区域的百分比。

二、结果与讨论

(一)二氢丹参酮Ⅰ对LX-2细胞和T6细胞凋亡的影响

前期研究(Xing X,Chen S,Li L,Cao Y,Chen L,Wang X,Zhu Z.The ActiveComponents of Fuzheng Huayu Formula and Their Potential Mechanism of Actionin Inhibiting the Hepatic Stellate Cells Viability-A Network Pharmacology andTranscriptomics Approach.Front Pharmacol.2018 May 24；9:525.)已表明二氢丹参酮Ⅰ可以明显抑制LX-2细胞和T6细胞的增殖，其IC₅₀值分别是14.4和5.6μM。为探究二氢丹参酮Ⅰ是否能引起细胞凋亡，采用流式细胞术进行检测。如图1 所示，二氢丹参酮Ⅰ分别作用LX-2细胞和T6细胞24h后发现，细胞凋亡率随着二氢丹参酮Ⅰ浓度升高而增大。二氢丹参酮Ⅰ以0、2.5、5、10μM的浓度作用于LX-2细胞时，其凋亡百分率(图1A/B)分别为4.6％、7.6％、16.6％和 20.5％(p＜0.001)；二氢丹参酮Ⅰ以0、5、10、20μM的浓度作用于T6细胞时，其凋亡百分率(图1C/D)分别为3.8％、36.8％、59.8％和60.8％(p＜0.001)。结果表明二氢丹参酮Ⅰ能以不同程度诱导LX-2细胞和T6细胞凋亡，由此推测二氢丹参酮Ⅰ可能通过促进肝星状细胞凋亡，进而抑制肝星状细胞活化。

(二)二氢丹参酮Ⅰ预测的靶标

基于文本挖掘已获得的79个肝纤维化相关靶标。采用分子对接和相似性匹配识别了182个二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标，其中158个靶标来自相似性匹配， 29个靶标来自分子对接。有趣的是，这两种方法都识别出的靶标有：STAT3、 PTN1、NF2L2、PAK1、MK08。并根据文本挖掘的数据整理了肝纤维化相关蛋白和二氢丹参酮Ⅰ潜在靶标在其抗肝纤维化过程中发挥的作用(抑制或促进作用)。

(三)代谢物信息的获取

在Pubmed数据库经过文本挖掘，找到35个肝纤维化相关的代谢物，我们将这些代谢物输入到BREDNA数据库中，共检索到235个关于肝纤维化代谢物相关的蛋白。基于文本挖掘的数据整理了肝纤维化相关代谢物在肝纤维化过程中的变化(上调、下调变化)。

(四)网络的构建与分析

我们使用上述已获得的数据构建了“二氢丹参酮Ⅰ靶标-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络(图2)，该网络中包含162个节点(18个二氢丹参酮Ⅰ靶标、33个肝纤维化相关蛋白、85个代谢物相关蛋白和26个代谢物)和719条边。网络中绿色和粉红色椭圆分别表示二氢丹参酮Ⅰ抗肝纤维化过程中对靶蛋白的抑制和促进作用，青色和橘黄色的六边形分别表示肝纤维化过程中相关靶蛋白下调和上调，浅蓝色椭圆形表示代谢物相关蛋白，深蓝色和红色的矩形表示抗肝纤维化过程中相关代谢物发生下调和上调。

为提高二氢丹参酮Ⅰ靶蛋白识别的准确性，对“二氢丹参酮Ⅰ靶标-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络分析后，整理了与二氢丹参酮Ⅰ靶蛋白相互作用蛋白的数量，如表1。一般来说，网络中与其相互作用的蛋白数量越多，则该蛋白可能是该网络发挥作用的关键蛋白(Chen S,Jiang H,Cao Y, Wang Y,Hu Z,Zhu Z,Chai Y.Drug targetidentification using network analysis: Taking active components in Sinidecoction as an example[J].Scientific reports, 2016,6:24245.)。从表1中发现P53和STAT3在18个二氢丹参酮Ⅰ靶蛋白中相互作用蛋白数量最多；由此我们推测P53和STAT3(图2中已标出)是二氢丹参酮Ⅰ治疗肝纤维化过程中发挥作用的关键蛋白。因此，后续实验从验证二氢丹参酮Ⅰ与P53和STAT3靶蛋白出发，进一步研究其对肝纤维化相关靶标、代谢物相关蛋白以及代谢物的影响。

表1二氢丹参酮Ⅰ靶蛋白相互作用蛋白的数量

实施例2：二氢丹参酮Ⅰ作用P53靶蛋白的实验验证

基于“二氢丹参酮Ⅰ靶标-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络的分析结果，我们构建了“P53-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物” 网络(图3A)，并推测二氢丹参酮Ⅰ可能通过作用P53靶蛋白发挥抗肝纤维化作用。为了验证上述问题，我们通过SPR分析、细胞活性实验和Western blotting实验进行验证。

1、二氢丹参酮Ⅰ与P53靶蛋白结合分析

基于SPR技术检测二氢丹参酮Ⅰ与P53靶蛋白间结合的亲和力。实验结果表明二氢丹参酮Ⅰ与P53靶蛋白间结合的Kd值为4.18μM，此结果与抑制细胞活性实验的结果基本一致，表明二氢丹参酮Ⅰ通过与P53结合，发挥其对 LX-2细胞和T6细胞活性的抑制作用。

2、Western blotting验证P53相关靶蛋白

首先对“P53-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络中P53蛋白在LX-2和T6细胞中的表达进行实验验证。Western blotting结果分析显示二氢丹参酮Ⅰ可以剂量依赖性地促进LX-2细胞和T6细胞(图3C-a/b)中P53和 p-P53的表达。

实施例3：二氢丹参酮Ⅰ作用STAT3的实验验证

基于“二氢丹参酮Ⅰ靶标-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络的分析结果，我们构建了“STAT3-肝纤维化靶蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物” 网络(图4A)，并推测二氢丹参酮Ⅰ可能通过作用STAT3靶蛋白发挥抗肝纤维化作用。为了验证上述问题，我们通过SPR分析和Western blotting实验进行验证。

1、二氢丹参酮Ⅰ与STAT3结合的SPR分析

SPR可以进行化合物与蛋白的结合检测，因此可以于检测二氢丹参酮Ⅰ与 STAT3靶蛋白间结合的亲和力。SPR结果表明二氢丹参酮Ⅰ与STAT3靶蛋白之间Kd值为5.66μM，此结果与抑制细胞活性实验的结果基本一致，表明二氢丹参酮Ⅰ通过与STAT3蛋白结合，发挥其对LX-2和T6细胞活性的抑制作用。

2、Western blotting验证STAT3相关靶标

首先对“STAT3-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络中STAT3 在LX-2和T6细胞中的蛋白表达进行实验验证。Western blotting结果分析显示二氢丹参酮Ⅰ可以剂量依赖性地抑制LX-2细胞(图4C-a)中STAT3和p-STAT3 的表达，二氢丹参酮Ⅰ虽不能剂量依赖性地抑制T6细胞(图4C-b)中STAT3 的表达，但能明显的抑制其p-STAT3的表达。由于已有的研究显示，在治疗肝纤维化过程中VEGFA、GCR、OTC的表达水平受到抑制(Salum GM,Bader El Din N G,Ibrahim M K,Anany M A,Dawood R M,Khairy A,El Awady M K.Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Hepatitis C Virus-InducedLiver Fibrosis:A Potential Biomarker[J].Journal of interferon&cytokineresearch:the official journal of the International Society for Interferon andCytokine Research, 2017,37(7):310-6.Zhang C,Bian M,Chen X,Jin H,Zhao S,YangX,Shao J, Chen A,Guo Q,Zhang F,Zheng S.Oroxylin A prevents angiogenesis ofLSECs in liver fibrosis via inhibition of YAP/HIF-1alpha signaling[J].2018,119(2):2258-68. Wang L,Bell P,Morizono H,He Z,Pumbo E,Yu H,White J,Batshaw ML,Wilson J M.AAV gene therapy corrects OTC deficiency and prevents liverfibrosis in aged OTC-knock out heterozygous mice[J].Molecular genetics andmetabolism,2017, 120(4):299-305.Kim K H,Lee J M,Zhou Y,Harpavat S,Moore D D.Glucocorticoids Have Opposing Effects on Liver Fibrosis in Hepatic Stellateand Immune Cells[J].Molecular endocrinology(Baltimore,Md),2016,30(8): 905-16.)。因此，可以推断出二氢丹参酮Ⅰ通过与STAT3结合抑制其蛋白的表达水平。

实施例3：二氢丹参酮Ⅰ改善了TAA诱导的肝损伤并降低了肝纤维化指数

为了研究二氢丹参酮Ⅰ对肝功能的影响，检测血清肝功能标志物水平。 ALT、AST、ALT和γ-GT是反映肝脏生理功能的指标，当这些指标高于正常值时表明肝功能出现不同程度的问题。如图5A/B/C/D所示，与对照组相比，模型组血清中ALT、AST、ALT和γ-GT的值显著增加，表明模型组大鼠的肝脏已被损伤。与模型组相比，二氢丹参酮Ⅰ给药组可以显著地降低大鼠血清中 ALT、AST、ALT和γ-GT的值，显示出二氢丹参酮Ⅰ具有一定保肝的功效，且二氢丹参酮Ⅰ高剂量组保肝比低剂量组功效略好；与阳性药索拉非尼组相比，二氢丹参酮Ⅰ改善肝功能效果要比阳性药组好。

H&E染色测定结果证明模型组大鼠的肝脏组织结构已严重受损，观察到有大量的肝细胞坏死和脂肪滴、新胆管形成。与正常对照组相比，二氢丹参酮 Ⅰ给药组显著地减少了这些病理变化(图5E)。天狼星红染色可以将胶原蛋白可视化，用于评估纤维化的程度和特征。在模型组中(图5F)，天狼星红染色的胶原原纤维不仅延伸到门静脉区域，还延伸到肝实质；从图5F中发现二氢丹参酮Ⅰ给药组中染色区域显著减少，表明二氢丹参酮Ⅰ可以减轻肝脏中胶原蛋白的积累。正常肝脏中的胶原蛋白主要由IV与VI型组成；而肝损伤后，由于基质代谢发生变化，胶原转变成I与III型胶原蛋白(Olaso E,Ikeda K,Eng F J,Xu L,WangL H,Lin H C,Friedman S L.DDR2 receptor promotes MMP-2-mediated proliferationand invasion by hepatic stellate cells[J].The Journal of clinicalinvestigation,2001,108(9):1369-78.刘蒲芳.柔肝灵颗粒对肝纤维化模型大鼠血清TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响[D]；陕西中医药大学；陕西中医学院,2008.)。所以对肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维面积进行数据统计如图5G/H，数据分析后发现二氢丹参酮Ⅰ可以降低肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的积累，且其效果比阳性药索拉非尼组好。这些数据表明二氢丹参酮Ⅰ可以改善由TAA诱导的肝损伤，并具有改善肝功能、降低肝损伤和治疗肝纤维化的作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂和信号传导及转录激活因子3抑制剂中的应用。

2.二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂中的应用。

3.二氢丹参酮Ⅰ在制备信号传导及转录激活因子3抑制剂中的应用。

4.二氢丹参酮Ⅰ在制备促进肝星状细胞凋亡，抑制肝星状细胞活化和增殖的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的二氢丹参酮Ⅰ在制备促进肝星状细胞凋亡，抑制肝星状细胞活化和增殖的药物中的应用，其特征在于，二氢丹参酮Ⅰ通过作用P53和STAT3，促进肝星状细胞凋亡，抑制肝星状细胞活化和增殖。

6.二氢丹参酮Ⅰ在制备降低肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的积累的药物中的应用。

7.二氢丹参酮Ⅰ作为P53激动剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

8.二氢丹参酮Ⅰ作为信号传导及转录激活因子3抑制剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

9.二氢丹参酮Ⅰ作为P53激动剂在制备动脉粥样硬化、乳腺癌、或结肠癌治疗药物中的应用。

10.二氢丹参酮Ⅰ作为信号传导及转录激活因子3抑制剂在制备膀胱癌、食管癌、或前列腺癌治疗药物中的应用。