CN107468680A - 二氢丹参酮ⅰ在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了二氢丹参酮Ⅰ在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，用于治疗溃疡性结肠炎的包含所述二氢丹参酮I的药物组合物，以及制备所述药物组合物的方法。实验显示二氢丹参酮I(DHT)能安全有效地抗溃疡性结肠炎，包括有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的一般状态，明显改善病理变化、显著减轻炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等。

Description

二氢丹参酮Ⅰ在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体提供了二氢丹参酮I在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途，用于治疗溃疡性结肠炎的包含所述二氢丹参酮I的药物组合物，以及制备所述药物组合物的方法。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,简称IBD)是一类病因和发病机制尚不十分明确的肠道炎症性疾病。根据其病理特征可分为克罗恩病(Crohn’s disease,简称CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,简称UC)。

溃疡性结肠炎，又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，是胃肠道最严重的疾病之一。流行病学统计数据显示，近年来UC在国内外的发病率和患病率均呈现明显增高趋势。UC病变多涉及大肠黏膜和黏膜下层，累及直肠和乙状结肠，呈连续性弥漫性分布。其临床表现主要为腹痛、腹泻、黏液脓血便；内镜下结肠呈糜烂、溃疡等弥漫性炎症；组织病理学表现为黏膜或黏膜下弥漫性炎症反应、杯状细胞减少、隐窝结构破坏。部分患者有肠外表现，如关节、肝胆管类疾病或眼睛、皮肤的损伤等。由于UC病程迁延不愈，反复无常，不但给患者造成精神和肉体上的痛苦，而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。UC的发病机制尚不十分明确，目前已知肠道黏膜免疫系统异常所导致的炎症反应在UC中起到重要作用。目前对溃疡性结肠炎尚未有根治方法，即便是在达到显效的治疗方面，也缺少有效药物和其它疗法。UC是一种难治性肠道疾病，已成为严重威胁人类健康的重要疾病。

目前，溃疡性结肠炎的治疗药物主要有：水杨酸类如柳氮磺胺吡啶、糖皮质激素如强的松、免疫调节剂如硫唑嘌呤，等等。这些药物虽具有一定疗效，但经治疗后仍经常复发，并存在较严重的不良反应。因此，临床亟待新型抗UC的药物。

丹参，为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，最早记载于《神农本草经》。丹参味苦、性微寒，有活血祛瘀、安神宁心之传统功效。植物化学研究显示，丹参的化学成分主要包括脂溶性和水溶性两部分。丹参酮类是丹参中的主要脂溶性成分，是具有橙黄色或橙红色特征的松香烷型二萜类化合物。药理研究证明，丹参酮类化合物具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤方面的作用。二氢丹参酮I(Dihydrotanshinone I,简称DHT)是丹参酮大家族的一员，其分子式为C₁₈H₁₄O₃，分子量为278.3，其化学结构式如下。研究显示，DHT具有抗肿瘤、心血管保护的药理活性。DHT构式如下：

发明内容

一方面，本申请提供了二氢丹参酮I(简称DHT)在抗溃疡性结肠炎方面的用途，以及DHT用于制备抗溃疡性结肠炎药物的用途。

实验显示二氢丹参酮I(DHT)能有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的包括体重下降、腹泻、血便和精神状态等多方面的一般状态，明显改善病理变化、显著减轻炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等，显示出DHT具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。

二氢丹参酮I治疗溃疡性结肠炎的优点在于作用迅速、疗效确切且药效良好。此外，二氢丹参酮I为丹参中提取的天然成分，在实验过程中未见明显副作用及毒性反应，揭示了二氢丹参酮I是一种安全有效的抗溃疡性结肠炎的药物。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含二氢丹参酮I或其溶剂合物，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。

再一方面，本申请提供了一种包含二氢丹参酮I的药物组合物的制备方法，其特征在于，将二氢丹参酮I或其药学上可接受的溶剂合物与药学上可接受的载体混合来制备，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。

二氢丹参酮I在本文中也简称为DHT。

本申请所述的二氢丹参酮I的溶剂合物，是指二氢丹参酮I与有机溶剂形成的稳定溶剂合物。有机溶剂包括常见的醇、酮或水等。有效成分与水形成的溶剂合物，也称为该有效成分的水合物。

术语“药物组合物”表示包含治疗有效量的一种或多种所述有效成分及其药学上可接受的溶剂合物，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向对象给药。

本申请所述的药物组合物可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。

本申请所述的药学上可接受的载体，是药学上可接受的成分或者介质，包括但不限于溶剂、赋形剂、稀释剂、佐剂、填充剂等。常见的药学上可接受的载体包括生理盐水，缓冲剂、糖类、明胶、淀粉、林格氏溶液、纤维素等。所述载体的pH通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。

除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

附图说明

图1为DHT对葡聚糖硫酸钠((Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化和DAI评分的影响结果图。其中，A为体重变化趋势的曲线图；B为DAI评分的曲线图，图中^**为DSS组与空白组比较p<0.01。

图2为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度和重量影响。其中，A为小鼠结肠长度差异的条形图；B为小鼠结肠重量变化条形图。

图3为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠H&E染色图。其中A为空白对照组(×200)；B为DSS模型组(×200)；C为DHT低剂量组(10mg/kg)(×200)；D为DHT高剂量组(25mg/kg)(×200)。

图4为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中髓过氧化酶(Myeloperoxidase,MPO)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1)的影响。其中A为MPO活力；B为HMGB1的含量。

图5为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆炎症因子水平的影响。A为TNF-α；B为IL-1β；C为IL-6。

具体实施方式

本申请描述了优选的实施方式，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请请求保护的内容包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。

实施例

葡聚糖酸钠(简称为DSS)是一种人工合成的类肝素硫酸多糖，目前常用于构建动物的实验性急慢性溃疡性结肠炎模型，因其引起的临床表现及病理改变类似于人类结肠炎而被广泛采用。

实验动物及药品：SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，18-22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。实验动物分笼饲养，适应性饲养1周，实验期间自由饮高压水和进食无菌饲料。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

供试药品：二氢丹参酮I(DHT)购自成都彼斯特生物科技有限公司(纯度大于98％)。葡聚糖硫酸钠(DSS)购自美国MP Biomedicals公司。

实验分组：空白对照组给予1％吐温80；模型组给予5％DSS；DHT低、高剂量组给予5％DSS以及同时给予DHT(低剂量组：10mg/kg，高剂量组：25mg/kg)。

实验过程：动物适应性喂养1周后，按体重随机分组如上所述。实验期间每日上午称重1次，记录并计算相应给药体积(0.1mL/20g)。DHT溶于1％吐温80后进行给药。在模型建立期以及实验期内，DHT以及空白对照用吐温80均通过灌胃给药，每日1次；实验期内，5％DSS通过小鼠自由饮用。

实验开始前3天，建立模型。自第4天开始，进行连续7天的实验：模型组小鼠自由饮用5％DSS；DHT低、高剂量组小鼠自由饮用5％DSS以及分别给予低(10mg/kg)和高(25mg/kg)剂量DHT；空白对照组只给予1％吐温80对照。

测试一：实验小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分测定：每天观察小鼠精神状态、体重变化、大便性状(稀便、腹泻、血便)及死亡情况等。

DAI评分按以下标准进行：

体重变化评分：体重未变化，记为0分；体重下降1-5％，记为1分；5-10％，记为2分；10-20％，记为3分；体重变化大于20％，记为4分。

大便性状评分：正常，0分；粪便较软，1分；粪便湿软2分；半稀便，3分；稀便，4分。

便潜血评分：无血便，0分；便血检测阳性，2分；肉眼血便，4分。

评分后计算3部分评分并求得平均值。DAI评分的范围为0分(健康状态)-4分(严重结肠炎)。

实验结果：图1为DHT对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化和DAI评分的影响结果图。其中，图A为体重变化趋势的曲线图；图B为DAI评分的曲线图，图中**是指DSS组与空白组比较，p<0.01；表明统计学显著差异。

结果显示，DHT对实验性溃疡性结肠炎模型小鼠一般状态的影响是：给予DSS造模后，小鼠从第3天开始体重下降。到第4天，DSS组小鼠体重明显下降且呈持续下降状态。给药组小鼠体重下降程度较模型组有所降低，如图1A所示。

给予DSS造模期间发现，模型组小鼠血便情况严重，而给药组明显缓解血便的症状。根据每天记录小鼠体重变化及血便症状进行DAI评分，结果如图1B所示，DHT处理可显著降低DAI评分。

结论：DHT可显著改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的DAI，延缓模型小鼠体重降低。

测试二：实验小鼠的结肠观察

结肠取材：实验第8天处死小鼠，剖取结肠。观察结肠有无水肿、粘连、溃疡、坏死等。然后测量结肠长度并拍照比较，称取结肠重量。

实验结果：图2显示了DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度和重量影响。其中，图2A为小鼠结肠长度差异的条形图；图2B为小鼠结肠重量变化条形图；图2C为处死后各组小鼠的结肠照片，每组随机抽取一只小鼠结肠为代表。

图2A、图2C显示了：与空白对照组相比，模型组小鼠结肠显著缩短；而给予DHT治疗后情况有明显改善，小鼠结肠长度均较模型组显著增长。

图2B显示了：与空白对照组相比，模型组小鼠结肠重量明显减轻；而给DHT治疗后情况明显改善，小鼠结肠重量均较模型组显著增加。

结论：DHT可显著增加DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度，增加结肠重量。

测试三：实验小鼠结肠H&E染色观察

实验第8天处死小鼠，剖取结肠。每只小鼠结肠取一小段置于10％甲醛中固定、石蜡包埋，用于H&E染色。

H&E染色：脱蜡(二甲苯I 10min—二甲苯Ⅱ10min—无水乙醇5min—95％乙醇5min—80％乙醇5min)；蒸馏水洗10min；苏木素染10min；流水冲洗苏木素液，1％盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗10min；伊红染2min，蒸馏水稍洗；脱水(80％乙醇—95％乙醇—95％乙醇—无水乙醇—无水乙醇)；中性树胶封片，显微镜观察，拍照。

实验结果：图3为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠H&E染色图。其中A图为空白对照组(×200)，小鼠结肠组织外膜、浆膜层、肌层结构完整，粘膜层杯状细胞排列整齐，形态完整；粘膜下层无水肿，无炎性细胞浸润；B图为DSS模型组(×200)，结肠组织结构完整性被破坏、肌层组织水肿增大、粘膜层细胞坏死脱落、杯状细胞排列紊乱且数量减少、粘膜下层大量炎性细胞浸润，腺体结构部分甚至完全消失；C、D图分别为DHT低剂量组(10mg/kg)(×200)和DHT高剂量组(25mg/kg)(×200)，上述结肠病变均有明显改善，病理变化明显减轻。

结论：DHT可改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠的病理变化。

测试四：实验小鼠的结肠组织中髓过氧化酶MPO以及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的 测定

A)：髓过氧化酶MPO测定：

测定方法参照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书：制备组织匀浆液，准确称定组织重量，以试剂盒配备的试剂二为匀浆介质，按重量体积比为1：19加入匀浆介质制备成5％的组织匀浆，无需离心。按照试剂盒说明书操作，在460nm处，测吸光度值。按以下公式计算：

MPO活力(U/g组织湿重)＝(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量(g)。

B)：ELISA法测定HMGB1

测定方法参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书：提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。按照说明书要求配置最高浓度的标准(4000ng/L)，随后依次倍比稀释标准品(4000、2000、1000、500、250ng/L)：

空白孔：空白对照孔不加样品，生物素标记的抗HMGB1抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步骤操作相同。

标准品孔：加入标准品50μl，链霉亲和素-HRP50μl(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)。

待测样品孔：加入样本40μl，然后各加入抗-HMGB1抗体10μl、链霉亲和素-HRP50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。

配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1×应用液，备用。

洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体。甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。

终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色。测定：450nm处测量各孔吸光度。

实验结果：图4为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中髓过氧化酶(MPO)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的影响。其中A图为MPO活性；B图为HMGB1的结肠组织含量。

如图4，结肠组织中MPO活性以及HMGB1含量测试显示：与空白对照组相比，模型组MPO活性显著增加，HMGB1含量明显增加；而高、低剂量DHT处理后可显著降低MPO活性，DHT高剂量组显著降低HMGB1含量。结肠MPO活性和HMGB1含量增加是溃疡性结肠炎的重要生物标志。

结论：DHT可显著降低溃疡性结肠炎生物标志物；表明DHT可显著改善溃疡性结肠炎。

测试五：ELISA法测定结肠组织的炎症因子(TNF-α，IL-1β、IL-6)

测定方法按照试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)说明书：提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。稀释标准品，按照说明书要求配置最高浓度的标准品(1000pg/ml)，随后依次倍比稀释标准品(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/ml)。样品稀释5倍(22μl品+88μl准品&标本通用稀释液)。

洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30s后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干。

空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度的标准品(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育90min。提前20min准备生物素化抗体工作液；洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵育60min。提前20min准备酶结合物工作液，避光室温(22-25℃)放置。洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃避光孵育30min。洗板5次。加入显色底物(TMB)100μl/孔，36℃避光孵育15min。加入终止液100ul/孔，混匀后即刻测量OD₄₅₀值(3min内)。

实验结果：图5为DHT对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆炎症因子水平的影响。A图为TNF-α；B图为IL-1β；C图为IL-6。如图5，小鼠血浆中炎症因子测定显示：与空白对照组相比，模型组炎症因子(TNF-α，IL-1β、IL-6)水平显著增加，DHT处理可显著抑制这三种炎症因子水平。TNF-α，IL-1β、IL-6是溃疡性结肠炎发生发展中的重要的促炎因子。

结论：DHT可显著改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠的炎症反应。

以上所有测试中，数据的统计学分析：各数据以均数±标准差表示，应用GraphpadPrism 6软件制图，SPSS22.0软件进行统计学分析，各组间差异比较，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时，组间两两多重比较采用LSD法；方差不齐时，组间两两多重比较采Dunnett’s T3法，以p<0.01表明统计学显著差异。

实验显示，二氢丹参酮I(DHT)能有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的包括体重下降、腹泻、血便和精神状态等多方面的一般状态，明显改善病理变化、显著减轻炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等，显示出DHT具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。

Claims (5)

1.二氢丹参酮I或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于抗溃疡性结肠炎的药物中的用途。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含二氢丹参酮I或其药学上可接受的溶剂合物，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制备为片剂、丸剂、滴丸、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂或乳剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制备为片剂、丸剂、滴丸、软胶囊剂、硬胶囊剂或乳剂。

5.根据权利要求2-4任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，将二氢丹参酮I或其药学上可接受的溶剂合物与药学上可接受的载体混合来制备，所述药物组合物用于治疗溃疡性结肠炎。