CN105193706B - 一种pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其制备方法包括以下步骤：(1)配制AgNO3溶液，置于微波反应器搅拌加热并逐滴加入半胱氨酸溶液，反应制得银纳米簇分散液；(2)将柠檬酸溶液添加到银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，采用紫外光照射，待溶液透明，加入NaHCO3溶液调节pH后，高速离心，加入盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内压力与温度，反应得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶。本发明选用银纳米簇水凝胶作为载体，包裹盐酸阿霉素，原位注射到肿瘤部位，响应于肿瘤部位pH，从而实现药物缓慢释放，提高肿瘤抑制率，减少心脏毒性。
Description
技术领域
本发明涉及纳米簇水凝胶技术领域，尤其是涉及一种对pH敏感的载药型水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
阿霉素(DOX)是一种蒽环类抗肿瘤药物，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤谱较广，对于乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、肺癌等多种癌症都有一定治疗效果。盐酸阿霉素为其盐制剂，橙红色疏松状块状物或粉末，易溶于水。阿霉素的毒副作用如，心脏毒性、抑制骨髓造血功能、肾脏毒性等，抑制了阿霉素的进一步应用。为了保证阿霉素的治疗效果，减少毒副作用，众多研究集中于研制阿霉素制剂，包括脂质体，磁性毫微粒及微球，聚合胶束和凝胶缓释剂。
水凝胶是一种三维立体的亲水性聚合物，它既有液体的运动性和流动性，又具有固体的形稳性。水凝胶含有大量水分，对人体不会产生不良免疫反应，具有很好的生物相容性，因而在干细胞和抗癌药物输送，细胞治疗，组织工程等生物医学领域有很好的应用。可注射的水凝胶可以方便地植入人体，不会引起注射部位炎症反应。水凝胶分为pH响应型，温度敏感性，触变型等。pH响应型是药物载体系统最常使用的一个不同组织和细胞的pH值不同，例如，肿瘤细胞pHe 6.5，血液pH 7.4，核内体和溶酶体的pH值甚至更低(约5.0-5.5)。载药水凝胶通过(EPR)效应积聚在肿瘤部位，响应于pHe值(pHe 6.5)，从而实现药物缓慢释放。Chang J.C.等人阿霉素连接于聚磷腈主链上，通过局部注射，有效抑制小鼠体内癌症细胞。Zentner G.M.等人应用ReGel包裹紫杉醇，注射到小鼠瘤内，有效地提高了肿瘤抑制率。
目前阿霉素制剂合成过程中，往往加入各种有机试剂，如交联剂，还原剂及保护剂，这些试剂可能会增加新的毒副反应。同时由于工艺复杂、生产条件苛刻等因素，导致阿霉素制剂包封率不高，且易泄露，进而限制了阿霉素制剂在临床上的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶及其用途。本发明选用银纳米簇水凝胶作为载体，包裹盐酸阿霉素，原位注射到肿瘤部位，响应于肿瘤部位pH，从而实现药物缓慢释放，提高肿瘤抑制率，减少心脏毒性。
本发明的技术方案如下：
一种pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其制备方法包括以下步骤：
(1)配制AgNO3溶液，置于微波反应器搅拌加热并逐滴加入半胱氨酸溶液，反应制得银纳米簇分散液；
(2)将柠檬酸溶液添加到银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，采用紫外光照射，待溶液透明，加入NaHCO3溶液调节pH后，高速离心，加入盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内压力与温度，反应得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶。
步骤(1)中AgNO3溶液浓度为0.01-0.04mol/L，半胱氨酸溶液浓度为0.05-0.1mol/L，两者体积之比为0.1-1:1，微波反应器的功率为100-200W，搅拌速度为300-1000r/min，反应时间为0.5-1.5h。
步骤(2)中银纳米簇分散液体积为5-50mL，柠檬酸溶液浓度为0.01-0.1mol/L，体积为0.5-10mL，NaHCO3溶液浓度为0.05-0.5mol/L，体积为0.1-5mL，盐酸阿霉素粉末质量为0.2-10mg。
步骤(2)中小型摇床振荡速度2.5-50r/min，紫外光波长为200-300nm，紫外光照射强度为15-40W，照射时间为1-2h，高速离心速度为6000-11000r/min，离心时间为5-30min。
步骤(2)中高压反应釜的釜内温度为20-50℃，釜内压力为8-20MPa，反应时间为10-30min。
步骤(2)所得pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶在72h内，在pH 5.8PB中，盐酸阿霉素累积释放量为80-99％，在pH 7.4PB中，盐酸阿霉素累积释放量为50-59％，在pH8.0PB中，盐酸阿霉素累积释放量为40-45％。
所述的pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶的用途，用于治疗淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞癌、食管癌、胃癌、肝癌、宫颈癌及头颈癌。
本发明有益的技术效果在于：
载药型银纳米簇水凝胶合成过程中避免加入有机交联剂及还原剂，对人体无毒副作用。载药水凝胶的药物释放速度随组织pH值的升高而降低，具有肿瘤靶向性，减少药物对正常组织的毒性。可原位注射到肿瘤部位，操作方便。具有良好的缓释功能，能维持药物有效作用浓度，提高肿瘤抑制率，并能降低阿霉素心脏毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶实物图；
图2为本发明测试例1pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶紫外扫描示意图；
图3为本发明测试例2pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶体外释放曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和检测例，对本发明进行具体描述。
实施例1
(1)配制0.01mol/L AgNO3溶液，取5mL置于微波反应器，搅拌速度为300r/min，加热功率为100W，并逐滴加入10mL，0.05mol/L半胱氨酸溶液，反应0.5h制得银纳米簇分散液。
(2)将0.5mL浓度为0.01mol/L柠檬酸溶液添加到5mL银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，振荡速度2.5r/min，采用200nm紫外光照射，照射功率为15W，照射时间为1h。待溶液透明，加入0.5mL浓度为0.05mol/L NaHCO3溶液调节pH为4后，6000r/min高速离心，离心时间为5min，加入0.2mg盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内温度为20℃，釜内压力为8MPa，反应10min得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶。
水凝胶产品的图片如图1所示。从图中可以看到，水凝胶在倒置状态下依然保持团聚状态，不会滴下来。
实施例2
(1)配制0.01mol/L AgNO3溶液，取5mL置于微波反应器，搅拌速度为500r/min，加热功率为150W，并逐滴加入15mL，0.05mol/L半胱氨酸溶液，反应1h制得银纳米簇分散液。
(2)将1mL浓度为0.05mol/L柠檬酸溶液添加到10mL银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，振荡速度25r/min，采用200nm紫外光照射，照射功率为15W，照射时间为1.5h。待溶液透明，加入2mL浓度为0.05mol/L NaHCO3溶液调节pH为5后，8000r/min高速离心，离心时间为10min，加入1mg盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内温度为20℃，釜内压力为10MPa，反应20min得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶。
实施例3
(1)配制0.02mol/L AgNO3溶液，取5mL置于微波反应器，搅拌速度为1000r/min，加热功率为200W，并逐滴加入50mL，0.01mol/L半胱氨酸溶液，反应1.5h制得银纳米簇分散液。
(2)将2mL浓度为0.1mol/L柠檬酸溶液添加到50mL银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，振荡速度50r/min，采用250nm紫外光照射，照射功率为40W，照射时间为2h。待溶液透明，加入5mL浓度为0.05mol/L NaHCO3溶液调节pH为6后，11000r/min高速离心，离心时间为30min，加入10mg盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内温度为25℃，釜内压力为20MPa，反应30min得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶。
上述实施例中所用的原料来自于Aladdin，其他为市售。
测试例1
将上述实例1得到的产品进行紫外分光光度计扫描测试。
测试方法和条件为：紫外分光光度计在200-800nm进行扫描。
测试结果如图2所示。从图2中可以看到：银纳米簇水凝胶的最大紫外吸收波长为408nm，盐酸阿霉素的最大紫外吸收波长为480nm。
测试例2
将上述实例1得到的产品进行体外释放测试。
测试方法和条件为：取5g pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶放入透析袋，置于37℃恒温振荡箱，透析介质为0.01M PB，pH值分别为5.8、7.4、8.0。于1、2、4、6、8、10、14、24、34、48、60、72h取5mL透析介质，同时加入5mL透析介质。紫外在480nm测DOX浓度，绘制释放曲线。
测试结果如图3所示。从图3中可以看到：pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶在pH 8.0，释放速率最慢，药物累积释放量在72h内为45％；当pH值降低时，释放速率加快，在pH 7.4时，盐酸阿霉素累积释放量为55％，当pH 5.8时，药物累积释放量达到了90％以上。由此可得出，该pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶具有很好的缓释性能，且其释放速度随缓冲液pH值的升高而降低，累积释放量也随之降低，pH值越高，其药物释放越不完全。
测试例3
将上述实例1得到的产品进行体内抗肿瘤实验测试。
测试方法和条件为：取BALB/C小鼠40只，将小鼠腋下毛剃去，用医用酒精消毒小鼠腋下皮肤，取小鼠乳腺癌肿瘤组织块接种于小鼠腋下皮下，12天后成瘤。剔除肿瘤体积较大或者较小的小鼠，实验小鼠数量共32只，分为4组，每8只。实验小鼠分组：
①生理盐水组：2.5mL/kg生理盐水；
②银纳米簇组：2.5mL/kg银纳米簇组；
③盐酸阿霉素组：2.5mL/kg盐酸阿霉素水溶液，盐酸阿霉素浓度为2mg/kg；
④pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶：2.5mL/kg pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶组，盐酸阿霉素浓度为2mg/kg。
当小鼠肿瘤体积约为35mm3时，每隔一天瘤旁皮下注射一次，注射5次后，观察两天，观察4天，第12天，小鼠麻醉处死。解剖小鼠取出肿瘤组织，生理盐水清洗，用滤纸吸干血迹，测量重量，计算肿瘤抑制率。测试结果如表4所示。
表4
**p<0.01vs生理盐水组
从表4中可以看到：pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶组肿瘤最小。银纳米簇组肿瘤抑制率为5.65％，与生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05)，由此可见银纳米簇不具有抑制肿瘤细胞的作用。盐酸阿霉素组肿瘤抑制率为43.23％，与生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05)。pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶组肿瘤抑制率为71.63％，与生理盐水组差异有高度统计学意义(P<0.01)，肿瘤组织环境呈弱酸性(pHe 6.5)，机体正常组织呈中性(pH 7.4)。pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶在肿瘤组织部位释放药物，延长药物蓄积时间，增加药物蓄积浓度，肿瘤组织局部药物浓度逐渐升高，从而抑制肿瘤细胞生长。游离药物在肿瘤组织部位累积时间短，血药浓度易出现“峰谷现象”。血药浓度处于“波谷”时，药物浓度低不能发挥作用。因此pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶更明显。
Claims (4)
1.一种pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其特征在于其制备方法包括以下步骤：
(1)配制AgNO3溶液，置于微波反应器搅拌加热并逐滴加入半胱氨酸溶液，反应制得银纳米簇分散液；步骤(1)中AgNO3溶液浓度为0.01-0.04mol/L，半胱氨酸溶液浓度为0.05-0.1mol/L，两者体积之比为0.1-1:1，微波反应器的功率为100-200W，搅拌速度为300-1000r/min，反应时间为0.5-1.5h；
(2)将柠檬酸溶液添加到银纳米簇分散液中，置于小型摇床上，采用紫外光照射，待溶液透明，加入NaHCO3溶液调节pH后，高速离心，加入盐酸阿霉素粉末，置于高压反应釜中，通入氮气，调节釜内压力与温度，反应得到红色澄清胶状物，即为pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶；
步骤(2)中银纳米簇分散液体积为5-50mL，柠檬酸溶液浓度为0.01-0.1mol/L，体积为0.5-10mL，NaHCO3溶液浓度为0.05-0.5mol/L，体积为0.1-5mL，盐酸阿霉素粉末质量为0.2-10mg。
2.根据权利要求1所述的pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其特征在于，步骤(2)中小型摇床振荡速度2.5-50r/min，紫外光波长为200-300nm，紫外光照射强度为15-40W，照射时间为1-2h，高速离心速度为6000-11000r/min，离心时间为5-30min。
3.根据权利要求1所述的pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其特征在于，步骤(2)中高压反应釜的釜内温度为20-50℃，釜内压力为8-20MPa，反应时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的pH敏感型载盐酸阿霉素银纳米簇水凝胶，其特征在于，步骤(2)所得pH敏感型载盐酸阿霉素水凝胶在72h内，在pH 5.8PB中，盐酸阿霉素累积释放量为80-99％，在pH 7.4PB中，盐酸阿霉素累积释放量为50-59％，在pH 8.0PB中，盐酸阿霉素累积释放量为40-45％。
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