CN105175536A

CN105175536A - 一种适于大规模工业生产的卵黄抗体提取方法

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Publication number: CN105175536A
Application number: CN201510644260.7A
Authority: CN
Inventors: 李晓宇; 靖凯霖; 徐永平; 王丽丽; 李淑英
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一种适于大规模工业生产的卵黄抗体提取方法，包括以下步骤：从免疫鸡蛋中分离得到蛋黄，搅拌均匀，得到蛋黄液；蛋黄液中加入5-10倍蛋黄液体积的蒸馏水，调节pH值在5.0-5.2之间；在-20℃冷冻过夜后，于4℃解冻；重复冷冻和解冻1～3次，离心，取上清液。本发明提供了一种适于工业化大规模提取卵黄抗体的方法，该方法步骤简便、成本低，高效和绿色无污染的特点。

Description

一种适于大规模工业生产的卵黄抗体提取方法

技术领域

本发明涉及工业大规模提取卵黄抗体的方法，尤其涉及一种经济、简便和绿色的提取卵黄抗体的方法。

背景技术

卵黄抗体(eggyolkantibodies，IgY)是指存在于禽类卵黄中的免疫球蛋白，由于其具有良好的治疗效果、较高的特异性、安全无残留、不产生耐药性菌、且制备量大、工艺简单等优势在抗生素替代品的研究热潮中脱颖而出。自1898年由Klemperer首次发现以来，已广泛应用于畜禽疾病的防治和疾病诊断等方面。美国食品和药品管理局(FDA)将卵黄抗体列入“公认安全使用物质(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)”把卵黄抗体看作药效营养品(Nutraceuticals)。但蛋黄中含有丰富的营养物质，是细菌生长的良好培养基，易使卵黄抗体腐败变质，因此，大规模工业化生产卵黄抗体必须解决提取纯化这一关键难题。

目前卵黄抗体的提取方法有很多种，常用的脂质凝集剂如：卡拉胶、黄原胶、海藻酸钠等，还有使用无机化学物质、有机溶剂提取，如氯仿、聚乙二醇、硫酸葡聚糖、硫酸钠、硫酸铵等。这些除脂方法步骤较多，工艺流程复杂，多使用离心，耗能大，使用试剂消耗大、成本高，而且化学物质残留，会对生物体产生危害，破坏环境，要想再进一步除去残留，则又会耗费人力物力，得不偿失，给工业化生产带来巨大困难。现将常规方法列出：

1.聚乙二醇法：向分离的卵黄液中加入3-5倍体积的磷酸缓冲液(PBS)或Tris缓冲液(TBS)，再加入3.5％PEG6000，以10000r/min低温离心20min取上清，加入12％PEG，4℃静置30min后，10000r/min离心20min，将沉淀物溶于适量PBS中，即得到卵黄抗体粗提物。聚乙二醇(PEG)是非离子型水溶性聚合物，易溶于水，且不会导致温度变化，高浓度不会引起蛋白质变性，沉淀蛋白质的时间比盐析蛋白常用的硫酸铵还短，对后续的离心提取没有影响，利于蛋白质的结晶。但现在没有办法除去溶于水中的PEG，残留的PEG对畜禽类动物是否存在危害尚无定论。该方法中的使用化学药品，会增加部分成本，而且使用10000r/min的高速离心，耗能较高，此法较适合小量制备。

2.氯仿法：将卵黄、生理盐水和氯仿按1：2：2的比例混匀后，10000r/min低温高速离心25min后提取水层。中间层再用适量TBS萃取一遍，两步得到的水层均为卵黄抗体粗体物。此法虽然去除脂的效果比较好，上清澄清，抗体回收率较高，但上清中残留有机溶剂氯仿，会影响抗体活性，同时氯仿有剧毒性，严重污染环境，要想除去氯仿还得结合其他方法提纯IgY，耗能费力，因而此法仅适合实验室少量制备。

3.辛酸法：将蛋黄与醋酸盐缓冲液体积按照1：8混合，调节pH值为5.2，4℃静置6h，收集沉淀，加入终浓度1％-3％的辛酸，采取4000r/min离心30min，去除沉淀，取上清即得含卵黄抗体的粗提物。在酸性、低离子强度条件下，辛酸可与大多数卵黄蛋白结合成不可逆的沉淀，只有IgY类抗体蛋白仍在上清中与其不发生反应，而且辛酸在水中溶解度极低，20℃时溶解度为0.68g/L，提取后残留量极微，因此，在医学工业中辛酸已被广泛应用，对生物不具有毒副作用，但整个提取过程，需要使用离心机及加入大量辛酸，考虑工业生产的经济问题，其成本过高。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种适于工业化大规模生产的卵黄抗体的提取方法，该方法经济方便、最大限度地降低了成本、提取效果良好、高效和绿色无污染。

本发明的目的是采用如下技术方案来实现的：

一种适于大规模工业生产的卵黄抗体的提取方法，包括如下步骤：

(1)从免疫鸡蛋中分离得到蛋黄，搅拌均匀，得到蛋黄液；

(2)步骤(1)的蛋黄液中加入5-10倍蛋黄液体积的蒸馏水，调节pH值在5.0-5.2之间；

(3)将步骤(2)得到的混合液在-20℃冷冻过夜后，于4℃解冻；

(4)重复步骤(3)1～3次，离心，取上清液。

进一步地，在步骤(2)中，所述蛋黄液中加入6倍蛋黄液体积的蒸馏水，调节pH为5.0。

进一步地，步骤(3)中，所述混合液在-20℃冷冻12h后，于4℃解冻。

进一步地，在步骤(2)中，调节pH值的试剂为盐酸。

卵黄中含有48％的水、30.5％的脂肪和17.6％的蛋白质，几乎所有的脂肪均与蛋白质结合形成脂蛋白，而α活性蛋白、β活性蛋白和γ活性蛋白(IgY)属于水溶性蛋白，其不与脂肪结合，因此，分离纯化IgY的关键是去除蛋黄中高含量的脂肪及脂蛋白，本发明中，将蛋黄溶于水中，再将其pH值调节在5.0-5.2之间，使脂蛋白的结合力改变，进而影响其在水溶液中的稳定性，从而达到初步分离卵黄抗体的目的。

冻融过程会使蛋黄中的脂蛋白发生自凝集，即粒径小的脂蛋白会互相融合聚集形成大的脂蛋白，这就会使整个环境中的脂蛋白粒径趋于均匀化，这样脂蛋白之间就形成了某种暂时的孔洞空隙，极大地利于水溶性蛋白在平衡状态前由脂相进入到水相中，加速了水溶性蛋白的溶解，达到彻底分离的目的。对于冻融次数，三次以上会影响卵黄抗体的活性，而两次与三次冻融除脂效果相比没有较大差异，因此从省时高效、节能降低成本方面考虑，冻融两次最宜。

冻融法常用于制备脂质体包被蛋白实验中，通过冻融可显著增加脂质体包被率，冻融前后的脂质体均具有较好的稳定性，冻融后脂质体凝聚活性明显高于冻融前，且冻融次数对包被率影响不大，但本实验发现，冻融次数超过三次会影响蛋白质活性，且除脂率并未显著增加。

本发明的有益效果：本发明提供了一种适于工业化大规模提取卵黄抗体的方法，该方法步骤简便、成本低，高效和绿色无污染的特点。

附图说明

图1为稀释倍数对除脂率影响；

图2为稀释倍数对IgY含量的影响；

图3为稀释倍数对效价的影响；

图4为pH值对除脂率的影响；

图5为pH值对IgY含量的影响；

图6为pH值对效价的影响；

图7为冻融对除脂率的影响；

图8为冻融对IgY含量的影响；

图9为冻融对效价的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

1.菌株：灿烂弧菌(Vibriosplendidus)

2.疫苗制备：将上述菌株接种于2216E液体培养基于28℃培养至对数期，计数为108cfu/mL时，收集菌悬液于灭菌的离心管中，5000r/min离心，弃去上清液，用磷酸缓冲液重悬沉淀3次，加入1％的甲醛溶液灭活后与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混匀制成疫苗。

3.蛋鸡免疫：用疫苗免疫产蛋母鸡(来航蛋鸡，120日龄，20羽，商业化饲料隔离饲养)。

4.收集免疫后的鸡蛋，分离蛋黄与蛋清，将分离得到的蛋黄分别以4、5、6、7倍体积的水稀释，用盐酸调节pH为5.0后，静置过夜，以3000r/min离心10min，取上清，测定其除脂率、蛋白质含量和效价，确定最佳稀释倍数，6倍；再以优化的最佳水稀释倍数，稀释蛋黄后用盐酸调节pH为4.8，5.0，5.2和5.4，静置过夜，3000r/min离心10min，取上清测定除脂率、蛋白质含量和效价，确定最佳pH值5.0；再以优化的最佳稀释倍数(6倍)稀释蛋黄，并以最佳pH值(5.0)调节蛋黄稀释液后，分别采取静置过夜后3000r/min离心10min；取上清在-20℃冷冻过夜，于4℃缓慢解冻，分别重复冻融一次、冻融两次和冻融三次后，在3000r/min离心10min，取上清，即为含卵黄抗体的水溶性组分(WSF)。

5.脂肪和蛋白质含量的测定：分别取处理后的蛋黄混合液上清，使用香草醛显色法测定脂肪含量。使用单向琼脂扩散法测定卵黄水溶性组分(WSF)中IgY含量。使用ELISA法检测IgY的效价。

结果：

1)稀释倍数对除脂率的影响：稀释倍数在4-6倍时，除脂率逐渐上升，从85％上升到94％，稀释7倍除脂率略有下降(图1)；IgY(WSF中)含量在稀释4-6倍时，由8.5mg/mL上升到9.0mg/mL，7倍时下降到8.9mg/mL(见图2)；稀释4-6倍时测定效价，结果如图3：由1：80000上升到1：160000，稀释7倍时效价不变，因此从成本角度考虑，选择6倍最适。

2)酸碱度对除脂率的影响：pH从4.8-5.0除脂率逐渐上升，从60％上升到94％，pH为5.0时除脂率最高，从5.0-5.4除脂率逐渐下降，从94％下降到90％(图4)；IgY(WSF中)含量在pH4.8-pH5.0时，由8.7mg/mL上升到9.0mg/mL，而pH为5.2时即开始下降，到pH为5.4时下降到8.8mg/mL(图5)；而效价在pH4.8时为80000，pH从5.0到pH5.4都为160000，没有变化，因此pH为5.0为最适酸度(图6)。

3)冻融次数对除脂率的影响：未冻融而采取离心的实验组除脂率94％，冻融一次除脂率即达到97％，冻融两次除脂率进一步达到99％，而冻融三次除脂率为99.3％，仅提升0.3个百分点(图7)；未冻融离心组IgY(WSF中)含量最高可达8.9mg/mL，冻融一次实验组IgY(WSF中)含量为9.0mg/mL，冻融两次组IgY(WSF中)含量为9.2mg/mL，冻融三次组IgY(WSF中)含量降至9.1mg/mL(图8)；效价检测结果(图9)显示，未冻融组与冻融组(包括冻融一次和两次)效价没有变化，但冻融三次组，效价略微下降。由于未冻融组会残留前期未除去的脂蛋白，因此蛋白质含量较高，而冻融后脂蛋白会被大部分除去，虽然蛋白质含量降低，但杂蛋白的含量也相应降低，但多次反复冻融会破坏蛋白质的活性，因此冻融三次组，蛋白质含量降低，因此从成本及最后效果考虑，冻融两次最宜。

以上所述，仅是本专利的较佳的制备提取工艺和实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种适于大规模工业生产的卵黄抗体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从免疫鸡蛋中分离得到蛋黄，搅拌均匀，得到蛋黄液；

(3)将步骤(2)得到的混合液在-20℃冷冻过夜后，于4℃解冻；

(4)重复步骤(3)1～3次，离心，取上清液。

2.根据权利要求1所述的卵黄抗体提取方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述蛋黄液中加入6倍蛋黄液体积的蒸馏水，调节pH值为5.0。

3.根据权利要求1或2所述的卵黄抗体提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述混合液在-20℃冷冻12h后，于4℃解冻。

4.根据权利要求1所述的卵黄抗体提取方法，其特征在于，在步骤(2)中，调节pH值的试剂为盐酸。