CN104762354B

CN104762354B - 一种提高重组蛋白包涵体形成的方法

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Publication number: CN104762354B
Application number: CN201510106291.7A
Authority: CN
Inventors: 李云亮; 马海乐; 何华纲; 任晓峰
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2035-03-11
Also published as: CN104762354A

Abstract

本发明公开了一种促进重组蛋白在基因表达时形成包涵体的方法。此方法特征在于，在不提高诱导物浓度的前提下，低强度短时间的超声处理加速诱导物渗透至细胞内，使重组蛋白高表达时更容易形成包涵体。不仅可以通过降低诱导物的使用量来降低对宿主细胞的毒害作用，还适用于在较低的诱导温度下才能表达重组蛋白的工程菌。此方法操作简便，成本低。

Description

一种提高重组蛋白包涵体形成的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说，本发明涉及一种促进重组蛋白在基因表达时形成包涵体的方法。

背景技术

大肠杆菌的遗传背景清楚，目的基因表达水平高，表达系统成熟完善，易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短和抗污染能力强）和成本低，已经发展为一种有效基因工程体系。目前，大量的异源蛋白特别是真核生物的基因在大肠杆菌得到了高效表达，但由于宿主菌缺乏此种异源基因相应的表达调控机制，以及细胞内的化学环境与其天然环境差异（如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度等），表达产物缺少饭以后的修饰（如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等），同时高表达时易折叠错误，导致表达产物多数以无活性的包涵体的形式存在。

除了基因的表达宿主菌和表达的环境外，包涵体在一些外界压力下也可以形成，如温度，是影响包涵体形成的主要因素。有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体，这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。

包涵体是微生物细胞中密度最大的结构（密度在1.1~1.3之间），对机械搅拌和超声破碎作用不敏感。以包涵体形式表达的蛋白质在下游生产过程中具有一些优越性。表现在：

（1）以包涵体形式表达重组蛋白质，包埋了蛋白酶水解的作用位点，可以最大限度地降低异源表达的蛋白质被宿主细胞内的蛋白质酶降解；

（2）包涵体蛋白通常不具有活性，对机械搅拌和超声破碎作用不敏感，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质高级结构变化引起的失活问题；

（3）使用简单的离心或者过滤方法就能使以包涵体形式表达的外源蛋白与宿主细胞的其他蛋白成分进行有效的分离，与可溶性形式表达的重组蛋白相比，分离工艺简便和成本低；

（4）以包涵体形式表达的蛋白质通常也不具有生物活性，降低了异源蛋白对宿主细胞的毒性和致死效应，从而可以高效大量地表达和积累。

包涵体的形成的对结构蛋白质结构正确折叠是不利的，但是对于一些对蛋白质空间结构要求不严格的重组蛋白的表达是非常有利的，如复性容易的重组蛋白和一些后续需要化学试剂或蛋白酶处理的蛋白。

工程菌所表达的异源蛋白分为可溶性部分和不溶性的包涵体部分，促进异源蛋白以不溶性的包涵体形式表达的因素，除与异源蛋白质本身的性质和所用的宿主菌相关外，还跟表达的调控条件，表达的温度有关。一般表达速度越快，表达量越高越容易形成包涵体。常用以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为基因表达诱导物的pET系列载体，采取提高IPTG浓度或者提高表达温度的方法加速基因的高表达以促进包涵体的形成。前者由于IPTG对宿主细胞有毒性能增加的浓度有限，而后者在有些重组蛋白在温度提高时更易受到宿主菌蛋白酶的降解，使重组蛋白难以得到积累，造成表达量少甚至不表达的情况。因此这两种方法在很多重组蛋白包涵体表达上应用受到了限制。

发明内容

为克服已有技术存在的问题，本发明的目的提供一种工艺简单，所需要的溶剂少，成本低，用于促进重组蛋白包涵体形成的方法。

本发明提供的促进重组蛋白包涵体形成的方法，按照下述步骤进行：

（1）菌种活化：取超低温保藏的重组大肠杆菌，划线接种于固体培养基（胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH 7.0）上，37℃培养12~16小时。

（2）种子液的制备：固体培养基挑取单菌落，接种至液体培养基（胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH 7.0）恒温摇床培养过夜。

（3）IPTG诱导表达：将种子液接种于同样的液体培养基的三角形锥形瓶中，其中接种量为1%（体积比），恒温摇床培养至OD₆₀₀为0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，将三角形锥形至于超声设备中进行一个低强度短时间的处理。诱导培养6~12小时，离心收集湿菌体，进行细胞破碎，然后利用离心法对重组蛋白包涵体的进行提取。

进一步设置，采用超声设备为扫频式的超声设备（图1，扫频式超声波是指超声波的频率围绕中心频率在一个设定的范围内以一定扫频周期上下波动，频率变化如图2所示），处理时间为1~4分钟，超声强度为0.06~0.12 W/cm³。

通过本设定，在不提高诱导物IPTG浓度的前提下，低强度短时间的超声处理加速诱导物渗透至细胞内，缩短了达到启动异源蛋白诱导表达所需诱导物浓度的时间，即在短时间内增加了诱导物在细胞内的浓度，促进了重组蛋白高表达时更容易形成包涵体。

本发明的优点：与传统的增加诱导物浓度促进包涵体表达相比，不仅可以增加包涵体表达量，还可以降低诱导物的使用量，降低对宿主细胞的毒害作用。同增加诱导温度的方法相比，可以适用于异源蛋白需要较低的诱导温度下才能表达的工程菌。同时低强度短时间的超声处理对宿主细胞伤害少。此方法操作简便，成本低，可提高包涵体得率10.6~27.2%。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1扫频超声设备结构示意图，1为控制电脑，2为超声波发生器，3为超声处理槽，4为大肠杆菌培养液，5为换能器，6和8为循环水管，7为恒温器。

图2扫频超声频率示意图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例所用的重组菌种为大肠杆菌BL21-MF3A3（专利申请号为：CN201010546991，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为Escherichai coli BL21-MF3A3 CCTCC NO：M2010204）和大肠杆菌BL21-M32PD，（专利申请号为CN201010547009，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为Escherichai coli BL21-M32PD CCTCC NO：M2010205），重组基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。

对照方法具体如下实施：

（2）种子液的制备：从固体培养基挑取单菌落，接种至液体培养基（胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH 7.0）恒温摇床培养过夜。

（3）IPTG诱导表达：将种子液接种于同样的液体培养基的三角形锥形瓶中，其中接种量为1%（体积比），恒温摇床培养至OD₆₀₀为0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM，28℃诱导12 h（BL21-MF3A3）或37℃诱导6 h（BL21-M32PD），5000 rpm离心5min收集菌体，并进行重组蛋白包涵体的提取。

（4）将收集到的菌体反复冻融法处理（-20°C/37°C）5次，重悬浮于缓冲液1（100 mMNaH₂PO₄，10 mM Tris，pH 7.5)，利用超声细胞破碎仪破碎细胞3 min（300 W），8000 rpm离心5 min取沉淀，在冰浴的烧杯中加入450 ml预冷的缓冲溶液2（50 mM Tris，10 mM EDTA，100mM NaCl，1 M urea，pH 7.5），冰浴，超声工作10 min（400 W）。将混合液于4℃下8000 rpm离心20 min，收集包涵体沉淀，将沉淀溶于8 M尿素，12000 rpm离心收集上清，采用BCA试剂盒测定上清液的蛋白含量。

实施例

（1）菌种活化同对比方法

（2）种子液的制备同对比方法

（3）IPTG诱导表达：将种子液接种于同样的液体培养基的三角形锥形瓶中，其中接种量为1%（体积比），恒温摇床培养至OD₆₀₀为0.8时，添加IPTG至终浓度0.5 mM，将三角锥形瓶置于扫频式超声设备处理槽中，在处理槽中加水，使得锥形瓶内外的液面高度一致，打开超声波发生器，对发酵液进行一个低强度短时间的处理（如图1所示）。28℃诱导12 h（BL21-MF3A3）或37℃诱导6 h（BL21-M32PD），离心收集湿菌体，并进行重组蛋白包涵体的提取，提取方法同对比方法。

其中扫频式的超声设备工艺参数如下：

采用超声设备为扫频式的超声设备，温度为37℃，处理时间为1~4分钟，超声强度为0.06~0.12 W/cm³。

实施例1~8的超声处理参数及结果如下所示：

Claims

1.一种提高重组蛋白包涵体形成的方法，其特征在于，包括：工程菌发酵，重组蛋白的超声辅助诱导表达，细胞收集，包涵体纯化；

工程菌表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在；

工程菌在加入诱导物后立即进行超声辅助处理；

采用扫频超声进行辅助处理；

采用离心法进行包涵体纯化；

按照下述步骤进行：

（1）菌种活化：取超低温保藏的重组大肠杆菌，划线接种于固体培养基上，37℃培养12~16小时，固体培养基组成为：胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH 7.0;

（2）种子液的制备：固体培养基挑取单菌落，接种至液体培养基，恒温摇床培养过夜，液体培养基组成为：胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH7.0；

（3）IPTG诱导表达：将种子液接种于同样的液体培养基的三角形锥形瓶中，其中接种量为1%（体积比），恒温摇床培养至OD₆₀₀为0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，将三角形锥形至于超声设备中进行一个低强度短时间的处理；低强度短时间的处理是指采用扫频超声进行辅助处理，其中扫频式的超声设备工艺参数如下：

采用超声设备为扫频式的超声设备，温度为37℃，处理时间为1~4分钟；超声强度为0.06~0.12 W/cm³；

诱导培养6~12小时，离心收集湿菌体，进行细胞破碎，然后利用离心法对重组蛋白包涵体的进行提取。