CN105142642A - 癌症治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过向有需要的受试者投与EZH2抑制剂化合物和医药组合物来治疗癌症的方法。本发明还涉及所述化合物用于研究或其它非治疗性目的的用途。

Description

癌症治疗方法
相关申请
本申请要求以下各者的优先权和权益：2012年10月15日提交的美国临时申请第61/714,045号、2013年1月31日提交的美国临时申请第61/758,972号、2012年10月15日提交的美国临时申请第61/714,140号、2012年10月15日提交的美国临时申请第61/714,145号、2013年3月13日提交的美国临时申请第61/780,703号以及2013年3月14日提交的美国临时申请第61/786,277号。这些临时申请中的每一个的完整内容以其全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及癌症治疗领域，并且具体来说，治疗与SWI/SNF复合物相关的癌症(即，SWI/SNF介导的癌症)。更具体来说，本发明提供治疗、缓解、预防、减少或以其它方式改善与SWI/SNF复合物相关的癌症的症状的方法和组合物。
背景技术
疾病相关的染色质修饰酶(例如，EZH2)在例如增生性病症、代谢障碍和血液病症的疾病中起一定作用。因此，需要研发能够调节EZH2的活性的小分子。
发明内容
本发明提供一种用于通过向有需要的受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂来治疗或缓解受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的群组的癌症：脑和中枢神经系统癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、乳癌以及前列腺癌。举例来说，SWI/SNF相关癌症的特征在于SWI/SNF复合物或SWI/SNF复合物的一或多种组分的降低表达和/或功能缺失。
举例来说，受试者患有选自由以下组成的群组的癌症：成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤以及非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤。
举例来说，所述一或多种组分选自由以下组成的群组：SNF5、ATRX和ARID1A。
举例来说，所述功能缺失是由点突变、缺失和/或插入产生的功能缺失突变引起的。
举例来说，受试者具有SNF5缺失。
举例来说，受试者具有选自由以下组成的群组的ATRX突变：天冬酰胺(N)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置688处的野生型残基赖氨酸(K)(K688N)和异亮氨酸(I)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置366处的野生型残基蛋氨酸(M)(M366I)。
举例来说，受试者具有选自由以下组成的群组的ARID1A突变：在SEQIDNO:11的氨基酸位置884处的野生型残基半胱氨酸(C)的无义突变(C884*)；赖氨酸(K)取代在氨基酸位置966处的野生型残基谷氨酸(E)(E966K)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1411处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1411*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1720处在野生型残基苯丙氨酸(F)处的移码突变(F1720fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)之后的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1874处在野生型残基半胱氨酸(C)处的移码突变(C1874fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1957处的野生型残基天冬氨酸(D)(D1957E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1430处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1430*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1721处在野生型残基精氨酸(R)处的移码突变(R1721fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1255处的野生型残基甘氨酸(G)(G1255E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置284处的野生型残基甘氨酸(G)的移码突变(G284fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1722处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1722*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置274处在野生型残基蛋氨酸(M)处的移码突变(M274fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)处的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置559处在野生型残基P处的移码突变(P559fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1276处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1276*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2176处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q2176fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置203处在野生型残基组氨酸(H)处的移码突变(H203fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置591处在野生型残基丙氨酸(A)处的移码突变(A591fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1322处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1322*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2264处的野生型残基丝氨酸(S)的无义突变(S2264*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置586处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q586*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置548处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q548fs)；以及在SEQIDNO:11的氨基酸位置756处在野生型残基天冬酰胺(N)处的移码突变(N756fs)。
本发明还提供一种治疗或缓解有需要的受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；(b)选择在步骤a中的至少一种基因的表达水平降低的受试者；以及(c)向在步骤b中所选择的受试者投与有效量的EZH2抑制剂，由此治疗或缓解受试者的癌症症状。
本发明进一步提供一种治疗或缓解有需要的受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；(b)选择在步骤a中的至少一种基因的表达水平增加的受试者；以及(c)向在步骤b中选择的受试者投与有效量的EZH2抑制剂，由此治疗或缓解受试者的癌症症状。
举例来说，所述癌症可以是成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
举例来说，神经元分化基因是CD133、DOCK4或PTPRK。
举例来说，细胞周期抑制基因是CKDN1A或CDKN2A。
举例来说，肿瘤遏制基因是BIN1。
举例来说，刺猬路径基因是GLI1或PTCH1。
举例来说，myc路径基因是MYC。
举例来说，组蛋白甲基转移酶基因是EZH2。
本发明还提供一种通过使细胞与EZH2抑制剂接触来诱导神经元分化、细胞周期抑制或肿瘤遏制的方法。EZH2抑制剂的量可以足以增加至少一个选自由CD133、DOCK4、PTPRK、CKDN1A、CDKN2A以及BIN1组成的群组的基因的表达。
本发明还提供一种通过使细胞与EZH2抑制剂接触来抑制刺猬信号传导的方法。EZH2抑制剂的量可以足以降低GLI1和/或PTCH1的表达。
本发明还提供一种通过使细胞与EZH2抑制剂接触来诱导基因表达的方法。EZH2抑制剂的量可以足以诱导神经元分化、细胞周期抑制和/或肿瘤遏制。举例来说，所述基因可以是CD133、DOCK4、PTPRK、CKDN1A、CKDN2A或BIN1。
本发明还提供一种通过使细胞与EZH2抑制剂接触来抑制基因表达的方法。EZH2抑制剂的量足以抑制刺猬信号传导。举例来说，所述基因可以是GLI1或PTCH1。
举例来说，细胞可能具有SNF5、ARID1A、ATRX和/或SWI/SNF复合物的组分的功能缺失。
举例来说，所述功能缺失是由SNF5的缺失引起的。
举例来说，所述细胞是癌细胞。所述癌症可以是成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
举例来说，EZH2抑制剂是具有下式的化合物A：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
举例来说，EZH2抑制剂是具有下式的化合物B：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
举例来说，EZH2抑制剂是具有下式的化合物C：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
举例来说，EZH2抑制剂是具有下式的化合物D：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
举例来说，EZH2抑制剂是具有下式的化合物E：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文中所述的那些方法和材料的方法和材料，但合适的方法和材料描述如下。本文中提到的所有公开、专利申请、专利以及其它参考文献全以引用的方式并入本文中。不承认本文中所引用的参考文献是所要求的发明的现有技术。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且并不打算是限制性的。
本发明的其它特征和优点从以下详细说明和权利要求书将是清楚的。
附图说明
图1A和1B是含野生型(RD和SJCRH30)和突变型SNF5的细胞系的一系列蛋白质印迹分析。
图2A-2E是确定了相比于野生型细胞系RD(A)和SJCRH30(B)，SNF5突变型细胞系A204(C)、G401(D)和G402(E)选择性地对EZH2化合物(化合物E)起反应的一系列图。
图3A-3D是示出了相比于野生型细胞RD，G401SNF突变型细胞系在软琼脂中7天之后对化合物E起反应的一系列条形图。A示出了细胞系RD(5,000个细胞/孔)。B示出了G401细胞(5,000个细胞/孔)。C示出了在2D生长中的G401细胞。D示出了G401细胞(10,000个细胞/孔)。
图4A-4D是示出了G401SNF5突变型细胞系在体外对化合物A敏感的四个图。野生型细胞系SJCRH30(A)和RD(C)以及SNF5突变型细胞系G401(B)和A204(D)用指定浓度的化合物A预处理7天并且在第0天再接种。通过发光细胞活力分析测定细胞活力。
图5A-5D是示出了在化合物A处理的情况下G401异种移植物(恶性横纹肌样肿瘤模型)持久消退的一系列图。(A)通过指定剂量的化合物A诱导的肿瘤消退。(B)通过每天两次投与指定剂量的化合物A诱导的肿瘤消退。数据表示平均值±SEM(n＝8)。在第28天停止化合物投与。(C)在第21天从平行的一组小鼠收集的G401异种移植肿瘤组织中的EZH2目标抑制。每个点示出了H3K27Me3比总H3的比率。水平线表示组平均值。BLLQ＝低于定量下限。(D，E)来自媒剂处理(D)和化合物A处理(E)(以125mg/kg)的小鼠的肿瘤样品的肿瘤组蛋白甲基化的免疫组织化学染色。
图6是示出了SCLC细胞系中经鉴别的ATRX突变位置的图。
图7A是示出了LNCAP前列腺癌细胞展示在体外化合物E处理的情况下剂量依赖性细胞生长抑制的图。
图7B是示出了针对WSU-DLCL2和LNCAP细胞，在第11天和第14天的化合物E的IC50值的图。
图8A-8C是确定了ATRX突变型SCLC系NCI-H446(A)、SW1271(B)和NCI-H841(C)对化合物E起反应的三个图。
图9A-9C是三张显微镜图像，示出了在用媒剂(A)或化合物E以4.1E-02μM(B)或3.3μM(C)的浓度处理之后，SCLC系NCI-H841形态改变。
图10A-10C是示出了化合物A对细胞全基因组的组蛋白甲基化和细胞活力的影响的一系列图。(A)化合物A的化学结构。(B)G401和RD细胞中的细胞H3K27Me3水平的浓度依赖性抑制。(C)通过化合物A体外选择性抑制缺失SMARCB1的G401细胞的增殖(通过ATP含量测量)。在第7天以初始接种密度再接种G401(图a和b)和RD细胞(图c和d)。每个点表示每种浓度的平均值(n＝3)。
图11A和11B是示出了生物化学作用机制研究的一系列图。化合物A的IC50值随着SAM浓度增加而增加(A)并且随着寡核小体浓度增加，最低限度地受到影响(B)，说明SAM竞争性和核小体非竞争性作用机制。
图12A和12B是展现了细胞系中的SMARCB1和EZH2表达以及化合物A对于细胞组蛋白甲基化的抑制的特异性的验证的一系列图。(A)通过免疫印迹用对SMARCB1、EZH2和肌动蛋白(内参照)具有特异性的抗体分析细胞溶解产物。(B)G401和RD细胞中细胞H3K27甲基化的选择性抑制。使细胞与化合物A一起孵育4天，并且通过免疫印迹分析酸提取的组蛋白。
图13A和13B是展现了化合物A在缺失SMARCB1的MRT细胞中诱导G1阻滞和细胞凋亡的一系列条形图。在与媒剂或1μM化合物A一起孵育长达14天期间在RD(图A)或G401细胞(图B)中的细胞周期分析(通过流式细胞术)和细胞凋亡的测定(通过TUNEL分析)。从第7天起观察到G1阻滞并且从第11天起诱导细胞凋亡。数据表示为平均值±SEM(n＝2)。所示出的DMSO对照值是每个时间点的平均值±SEM。使细胞分裂并且在第4天、第7天和第11天以初始接种密度再接种。
图14A-14B是示出了化合物A诱导SMARCB1调控基因的表达和细胞形态的改变的一系列图。(A)相对于RD对照细胞，在缺失SMARCB1的G401细胞中SMARCB1调控基因的基础表达(通过qPCR测量，n＝2)。(B)使G401和RD细胞与DMSO或1μM化合物A一起孵育2、4和7天。通过qPCR(n＝2)测定基因表达并且所述基因表达相对于每个时间点的DMSO对照表达。图a-j分别对应于基因GLI1、PTCh1、DOCK4、CD133、PTPRK、BIN1、CDKN1A、CDKN2A、EZH2和MYC。(C)使G402细胞与DMSO(左图)或1μM化合物A(右图)一起孵育14天。使细胞分裂并且在第7天以初始接种密度再接种。
图15A-15D是展现了用化合物A处理的携有G401异种移植物的小鼠的体重、肿瘤消退和血浆水平的一系列图。(A)关于用化合物A以BID时程处理28天的动物，一周测定体重两次。数据呈现为平均值±SEM(直到第21天为止，n＝16；从第22天到第60天，n＝8)。(B)通过以指定剂量每天两次(BID)投与化合物A持续21天诱导的肿瘤消退(平均值±SEM，n＝16)。*p<0.05，**p<0.01，重复测量方差分析(ANOVA)、邓尼特事后检验(Dunnett'spost-test)对比媒剂。(C)在第21天安乐死的8只小鼠的肿瘤重量。****p<0.0001，费雪精确检验(Fisher'sexacttest)。(D)在第21天给予化合物A之前5分钟和之后3小时收集血浆，通过LC-MS/MS测量化合物水平。使动物安乐死，并且在第21天给药之后3小时收集肿瘤。产生肿瘤匀浆并且使其经历LC-MS/MS分析以测定化合物A浓度。应注意，不可以从所有动物、尤其是较高剂量组中测定肿瘤化合物水平，因为异种移植物在第21天还太小。点表示单个动物的值；水平线表示组平均值。
图16A-16C是示出了化合物A根除了SCID小鼠中缺失SMARCB1的MRT异种移植物的一系列图。(A)通过以指定剂量每天两次(BID)投与化合物A持续28天诱导的肿瘤消退。在第28天停止化合物投与并且使肿瘤再生长直到它们达到2000mm3为止(数据显示为平均值±SEM，n＝8)。(B)从在第21天安乐死的小鼠收集的G401异种移植肿瘤组织中的EZH2目标抑制。每个点示出了H3K27Me3比总H3的比率，通过ELISA所测量。水平线表示组平均值；灰色符号是超出ELISA标准曲线的范围的值。(C)从用化合物A处理21天的小鼠收集的G401异种移植肿瘤组织中基因表达的变化。图a-d分别对应于基因CD133、PTPRK、DOCK4和GLI1。数据呈现为相比于媒剂的倍数变化±SEM(n＝6；对于500mg/kg组，n＝4)。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，对比媒剂，费雪精确检验。
具体实施方式
本发明部分地基于以下发现：EZH2抑制剂可以有效地治疗SWI/SNF相关癌症，所述癌症的特征在于某些生物标记或基因的表达改变和/或功能缺失。具体来说，所选择的生物标记或基因的表达改变和/或功能缺失的肿瘤或肿瘤细胞对本发明的EZH2抑制剂敏感。因此，本发明提供通过向受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂来治疗或缓解受试者的癌症的症状，尤其是治疗与某些生物标记或基因的表达改变和/或功能缺失相关的癌症的方法。举例来说，所述生物标记是SWI/SNF复合物的一个组分。举例来说，所述基因选自由以下组成的群组：神经元分化基因、细胞周期基因抑制基因、肿瘤遏制基因、刺猬路径基因、myc路径基因以及组蛋白甲基转移酶基因。
在人类中，SWI/SNF复合物至少包括进化上保守的核亚基和变异体亚基。进化上保守的核亚基包括SNF5(也称为SMARCB1、INI1或BAF47)、SMARCA4(也称为BRM/SWI2相关基因1、BRG1)、BAF155和BAF170。变异体亚基包括BAF53(A或B)、BAF60(A、B或C)、BAF57、BAF45(A、B、C或D)。其它亚基包括ARIDI1A(也称为SMARCF1)、ARID1B、SMARCA2(也称为brahma同源物、BRM)、ATRX、BAF200、BAF180(也称为PBRM1)以及含溴结构域7(BRD7)。SWI/SNF复合物的至少一种组分可以是复合物的任一组分，例如本文中所述或本领域中已知的组分/亚基。
在本文中提出的任何方法中，神经元分化基因可以是(但不限于)CD133(也称为PROM1)、DOCK4、PTPRK、PROM2、LHX1、LHX6、LHX9、PAX6、PAX7、VEFGA、FZD3B、FYN、HIF1A、HTRA2、EVX1、CCDC64或GFAP。
在本文中提出的任何方法中，细胞周期抑制基因可以是(但不限于)CKDN1A、CDKN2A、MEN1、CHEK1、IRF6、ALOX15B、CYP27B1、DBC1、NME6、GMNN、HEXIM1、LATS1、MYC、HRAS、TGFB1、IFNG、WNT1、TP53、THBS1、INHBA、IL8、IRF1、TPR、BMP2、BMP4、ETS1、HPGD、BMP7、GATA3、NR2F2、APC、PTPN3、CALR、IL12A、IL12B、PML、CDKN2B、CDKN2C、CDKN1B、SOX2、TAF6、DNA2、PLK1、TERF1、GAS1、CDKN2D、MLF1、PTEN、TGFB2、SMAD3、FOXO4、CDK6、TFAP4、MAP2K1、NOTCH2、FOXC1、DLG1、MAD2L1、ATM、NAE1、DGKZ、FHL1、SCRIB、BTG3、PTPRK、RPS6KA2、STK11、CDKN3、TBRG1、CDC73、THAP5、CRLF3、DCUN1D3、MYOCD、PAF1、LILRB1、UHMK1、PNPT1、USP47、HEXIM2、CDK5RAP1、NKX3-1、TIPIN、PCBP4、USP44、RBM38、CDT1、RGCC、RNF167、CLSPN、CHMP1A、WDR6、TCF7L2、LATS2、RASSF1、MLTK、MAD2L2、FBXO5、ING4或TRIM35。
在本文中提出的任何方法中，肿瘤遏制基因可以是(但不限于)BIN1。如本文中所用，术语“肿瘤遏制基因”具有其在本领域中通常所了解的含义，即其表达和正常功能起作用遏制肿瘤表现型或诱导细胞凋亡或两者的基因。在一些实施例中，肿瘤遏制基因包括细胞周期抑制基因。肿瘤抑制因子基于其功能的示例性分类包括(但不限于)：
(1)抑制细胞周期的基因；
(2)使细胞周期与DNA损伤结合的基因.当在细胞中存在损伤的DNA时，所述细胞不能分裂。如果所述损伤可以被修复，那么细胞周期可以继续。如果所述损伤不能被修复，那么细胞将会引发细胞凋亡(程序性细胞死亡)；
(3)防止肿瘤细胞分散、阻断接触抑制缺失并且抑制转移的基因.这些基因和其编码的蛋白质也称为转移抑制因子；以及
(4)DNA修复蛋白.这些基因的突变增加了癌症风险。
在本文中提出的任何方法中，刺猬信号传导路径基因可以是(但不限于)GLI1、PTCH1、SUFU、KIF7、GLI2、BMP4、MAP3K10、SHH、TCTN3、DYRK2、PTCHD1或SMO。
在本文中提出的任何方法中，myc路径基因可以是(但不限于)MYCNMI、NFYC、NFYB、周期素T1、RuvB样蛋白1、GTF2I、BRCA1、T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1、ACTL6A、PCAF、MYCBP2、MAPK8、Bcl-2、转录起始蛋白SPT3同源物、SAP130、DNMT3A、母亲DPP同源物3、MAX、母亲DPP同源物2、MYCBP、HTATIP、ZBTB17、转化/转录结构域相关蛋白、TADA2L、PFDN5、MAPK1、TFAP2A、P73、TAF9、YY1、SMARCB1、SMARCA4、MLH1、EP400或let-7。
在本文中提出的任何方法中，组蛋白甲基转移酶基因可以是(但不限于)EZH2。
本发明化合物抑制EZH2或其突变体的组蛋白甲基转移酶活性并且因此，在本发明的一个方面，本文中所公开的化合物是用于治疗或预防某些病况和疾病的候选物。本发明提供用于治疗、预防或缓解癌症或癌前病况的症状的方法。所述方法包括向有需要的受试者投与治疗有效量的本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂合物或立体异构体。可以治疗的示例性癌症包括成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤(ewingsarcoma)、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出的(nototherwisespecified；NOS)肉瘤。或者，有待通过本发明化合物治疗的癌症是非NHL癌症。
本发明进一步提供本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物在治疗癌症或初癌或用于制备适用于治疗所述癌症或初癌的药剂中的用途。可以治疗的示例性癌症包括成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出(NOS)的肉瘤。或者，本发明化合物可以用于治疗非NHL癌症或用于制备适用于治疗非NHL癌症的药剂。
本发明化合物可以用于调节蛋白质(例如，组蛋白)甲基化，例如用于调节组蛋白甲基转移酶或组蛋白去甲基化酶活性。本发明化合物可以用于体内或体外调节蛋白质甲基化。基于EZH2的甲基化调控参与肿瘤、尤其是携有选定生物标记/基因的表达改变和/或功能缺失的肿瘤形成这一惊人发现，本文中所述的化合物是用于治疗这些疾病的合适候选物，即用于减少甲基化或使甲基化大致恢复到其在对应正常细胞中的水平。
在一些实施例中，本发明化合物可以选择性地抑制SWI/SNF复合物相关的肿瘤或肿瘤细胞的增殖(如图1-9中所示)。因此，本发明提供用于通过本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物来治疗、预防或缓解SWI/SNF复合物相关的癌症或癌前病况的症状的方法。本发明进一步提供本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物在治疗SWI/SNF复合物相关的癌症或初癌病况或用于制备适用于治疗所述癌症或初癌的药剂中的用途。
在本发明中还提供了用于测定患有癌症的受试者对EZH2抑制剂的反应性的方法。所述方法包括以下步骤：从受试者获得样品(核酸样品或蛋白质样品)并且检测SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，检测这种组分的表达和/或功能，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。术语“样品”意指来源于受试者的任何生物样品，包括(但不限于)细胞、组织样品、体液(包括(但不限于)粘液、血液、血浆、血清、尿液、唾液和精液)、肿瘤细胞以及肿瘤组织。样品可以由在治疗或测试中的受试者提供。或者，样品可以由医师根据本领域中的例行实践获得。
本发明还提供用于测定受试者患癌症或癌前病况的倾向性的方法，所述方法通过从受试者获得样品并且检测SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明相比于不存在SWI/SNF复合物的至少一种组分的所述功能缺失的受试者，所述受试者倾向于(即，具有较高风险)患上癌症或癌前病况。
如本文中关于癌症或癌前病况所用的术语“倾向于”应了解意指在其中受试者之间患癌症或癌前病况的其它风险因素(例如，化学制品/环境、食物和吸烟史等)相同的情况下，具有SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的受试者将遭受癌症或癌前病况的概率相比于不具有SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的另一个受试者将遭受癌症或癌前病况的概率有所增加(例如，概率增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多)。
在本发明的上下文中，“风险”是指在一段特定时间内将发生某一事件的概率并且可以意指受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以参照针对相关时间队列测量后的实际观察结果或参照从已经随访了一段相关时间的统计学上有效的历史性队列发展得到的指数值来测量。相对风险是指受试者的绝对风险相比于低风险队列的绝对风险或平均群体风险的比率，其可以因临床风险因素的评定方式而变化。优势比是针对指定测试结果，正性事件比负性事件的比例，还常用于无转化(优势是根据公式p/(1-p)，其中p是事件概率并且(1-p)是无事件概率)。
因此，本发明通过在受试者中遗传筛选SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失为受试者提供个体化用药、治疗和/或癌症管理。举例来说，本发明提供用于治疗、预防或缓解癌症或癌前病况的症状的方法，所述方法通过测定受试者对EZH2抑制剂的反应性并且当受试者对EZH2抑制剂起反应时，向受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂或其医药学上可接受的盐、溶剂合物或立体异构体。反应性通过以下来测定：从受试者获得样品并且检测SWI/SNF复合物的至少一种组分(例如SNF5、ARID1A或ATRX)的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。
在另一个实例中，本发明通过定期测定受试者患癌症或癌前病况的倾向性提供管理受试者的癌症的方法。所述方法包括以下步骤：从受试者获得样品并且检测SWI/SNF复合物的至少一种组分的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明相比于不存在SWI/SNF复合物的至少一种组分的所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的受试者，所述受试者倾向于患上癌症或癌前病况。
在仅说明性实施例中，本文中提出的治疗方法包括以下步骤：(a)从自受试者获得的生物样品收集核酸样品或蛋白质样品；(b)测量所述样品中的SWI/SNF复合物的组分的表达水平或功能水平；(c)测量对照样品中的SWI/SNF的组分的表达水平或功能水平；(d)比较测试样品中在步骤(b)中测量的组分的表达水平或功能水平与对照样品中在步骤(c)中测量的组分的表达水平或功能水平(或参考值)；(e)当在步骤(b)中测量的组分的表达水平或功能水平相比于在步骤(c)中测量的组分的表达水平或功能水平有所降低或缺失(例如，单倍剂量不足或功能缺失)时，鉴别所述受试者为治疗候选者；以及(f)向在步骤(e)中鉴别的受试者投与治疗有效量EZH2抑制剂或为在步骤(e)中鉴别的受试者选择治疗方案。受试者样品中组分的表达水平或功能水平相比于对照样品中组分的表达水平或功能水平降低例如10％、25％、50％或1倍、2倍、5倍或更多倍。可以采用本领域中已知的任何合适方法来测量SWI/SNF复合物的组分的表达水平或功能水平。在一些实施例中，受试者患有恶性横纹肌样肿瘤、成神经管细胞瘤或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。在一些实施例中，所述组分是SNF5、ARID1A或ATRX。
举例来说，经鉴别的受试者可以用如在最新的美国国家综合癌症网络(NCCN)指南中所述的标准护理治疗来治疗。
举例来说，从健康的正常受试者获得对照样品。或者，从当前未患与SWI/SNF复合物相关的癌症、尚未被诊断患有所述癌症或无患所述癌症的风险的受试者获得对照样品。
在一个优选方面，本发明提供一种用于治疗或缓解受试者的癌症的症状的方法，所述方法通过测定受试者对EZH2抑制剂的反应性并且如果受试者对EZH2抑制剂起反应并且受试者患有选自由脑和CNS癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和/或肉瘤组成的群组的癌症，那么向所述受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂。所述反应性通过以下来测定：从受试者获得样品并且检测SNF5、ARID1A和/或ATRX的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。
在另一个优选方面，本发明提供一种用于治疗或缓解受试者的恶性横纹肌样肿瘤的症状的方法，所述方法通过测定受试者对EZH2抑制剂的反应性，并且如果受试者对EZH2抑制剂起反应，那么向受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂。所述反应性通过以下来测定：从受试者获得样品并且检测SNF5、ARID1A和/或ATRX的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。
在另一个优选方面，本发明提供一种用于治疗或缓解受试者的成神经管细胞瘤的症状的方法，所述方法通过测定受试者对EZH2抑制剂的反应性，并且如果受试者对EZH2抑制剂起反应，那么向受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂。所述反应性通过以下来测定：从受试者获得样品并且检测SNF5、ARID1A和/或ATRX的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。
在另一个优选方面，本发明提供一种用于治疗或缓解受试者的非典型畸胎样横纹肌样肿瘤的症状的方法，所述方法通过测定受试者对EZH2抑制剂的反应性，并且如果受试者对EZH2抑制剂起反应，那么向受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂。所述反应性通过以下来测定：从受试者获得样品并且检测SNF5、ARID1A和/或ATRX的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失，并且所述降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失的存在表明受试者对EZH2抑制剂起反应。
恶性横纹肌样肿瘤(MRT)和非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(ATRT)是脑部、肾脏和软组织的侵袭性极大的儿科癌症，所述癌症是高度恶性、局部侵袭性、经常转移并且尤其是致死的。它们通常是二倍体并且缺乏基因组畸变；然而，它们的特征在于SWI/SNF染色质重塑复合物的核心组分SMARCB1(也称为SNF5、INI1或BAF47)的缺失的几乎完全外显率。SMARCB1的双等位基因失活本质上是MRT和ATRT中表明关于此遗传畸变的驱动者角色的唯一遗传事件。
不受任何理论限制，本发明化合物特异性地抑制细胞H3K27甲基化，引起SMARCB1突变型MRT细胞的选择性细胞凋亡性杀伤。举例来说，用化合物A体外处理缺失SMARCB1的MRT细胞系诱导出IC50值在nM范围内的强抗增殖作用；同时对照(野生型)细胞系最低限度地受到影响(图10C和表6)。此外，本发明化合物诱导神经元分化、细胞周期抑制和肿瘤遏制同时遏制刺猬路径基因、MYC和EZH2的表达的基因。举例来说，化合物A处理缺失SMARCB1的G401细胞长达7天强烈地诱导CD133、DOCK4和PTPRK的表达并且上调细胞周期抑制因子CDKN1A和CDKN2A和肿瘤遏制因子BIN1，全部以时间依赖性方式(图14B)。同时，刺猬路径基因、MYC和EZH2的表达降低。值得注意的是，暴露于化合物A中14天的缺失SMARCB1的G402细胞假定为神经元样形态(图14C)。
因此，本发明进一步提供治疗或缓解有需要的受试者的癌症症状的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；(b)选择在步骤(a)中的至少一种基因的表达水平降低的受试者；以及(c)向在步骤(b)中选择的受试者投与有效量的本发明化合物，由此治疗或缓解受试者的癌症症状。
本发明还提供了治疗或缓解有需要的受试者的癌症症状的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；(b)选择在步骤(a)中的至少一种基因的表达水平增加的受试者；以及(c)向在步骤(b)中选择的受试者投与有效量的本发明化合物，由此治疗或缓解受试者的癌症症状。
本文中还提供了为有需要的受试者选择癌症疗法的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；和(b)当在步骤(a)中受试者的至少一种基因的表达水平降低时，选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包括向受试者投与有效量的本发明化合物。
本发明进一步提供为有需要的受试者选择癌症疗法的方法，所述方法通过(a)测定从受试者获得的样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；和(b)当在步骤(a)中受试者的至少一种基因的表达水平增加时，选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包括向受试者投与有效量的本发明化合物。
在仅说明性实施例中，本文中提出的方法可以包括以下步骤：(a)从自受试者获得的生物样品收集核酸或蛋白质样品；(b)测量所述样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；(c)测量对照样品中的相同基因的表达水平；(d)比较测试样品中在步骤(b)中测量的基因的表达水平与对照样品中在步骤(c)中测量的基因的表达水平(或参考值)；(e)当在步骤(b)中测量的组分的表达水平相比于在步骤(c)中测量的基因的表达水平有所降低时，鉴别所述受试者为治疗候选者；以及(f)向在步骤(e)中鉴别的受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂或为在步骤(e)中鉴别的受试者选择治疗方案。所测试的受试者中的基因的表达水平相比于对照样品中的基因的表达水平降低了例如10％、25％、50％或1倍、2倍、5倍或更多倍。
在仅说明性实施例中，本文中提出的方法可以包括以下步骤：(a)从自受试者获得的生物样品收集核酸或蛋白质样品；(b)测量所述样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；(c)测量对照样品中的相同基因的表达水平；(d)比较测试样品中在步骤(b)中测量的基因的表达水平与对照样品中在步骤(c)中测量的基因的表达水平(或参考值)；(e)当在步骤(b)中测量的组分的表达水平相比于在步骤(c)中测量的基因的表达水平有所增加时，鉴别所述受试者为治疗候选者；以及(f)向在步骤(e)中鉴别的受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂或为在步骤(e)中鉴别的受试者选择治疗方案。所测试的受试者中的基因的表达水平相比于对照样品中的基因的表达水平增加了例如10％、25％、50％或1倍、2倍、5倍或更多倍。
术语“表达水平”是指特定相关基因的蛋白质、RNA或mRNA水平。可以采用本领域中已知的任何方法来测定特定相关基因的表达水平。实例包括(但不限于)逆转录和扩增分析(例如PCR、连接RT-PCR或定量RT-PCT)、杂交分析、RNA印迹法(Northernblotting)、斑点印迹法、原位杂交、胶凝电泳、毛细管电泳、柱色谱、蛋白质印迹法、免疫组织化学、免疫染色或质谱。可以直接对生物样品或对从样品中分离出来的蛋白质/核酸执行分析。这在实施这些分析的相关技术中是例行实践。举例来说，本文中所述的任何方法中的测量步骤包括使来自从受试者获得的生物样品的核酸样品与一或多种特异性地杂交到本文中提出的相关基因的引物接触。或者，本文中所述的任何方法的测量步骤包括使来自从受试者获得的生物样品的蛋白质样品与一或多种结合到本文中提出的相关生物标记的抗体接触。
特定基因的降低的表达水平意指其表达水平相比于参考值或在从相同受试者获得的不同(或先前)样品中所测量的这种基因的表达水平降低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多。
特定基因的增加的表达水平意指其表达水平相比于参考值或从相同受试者获得的不同(或先前)样品中所测量的这种基因的表达水平增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多。
如本文中所用的“参考或基线水平/值”可以互换使用并且意指相对于从群体研究得到的数字或值，包括(但不限于)具有类似的年龄范围、疾病状态(例如，阶段)的那类受试者、在相同或类似的族群中的受试者，或相对于正在经历癌症治疗的受试者的起始样品。所述参考值可以从自数学算法和所计算的癌症指数获得的群体的统计分析和/或风险预测数据得到。还可以使用算法和其它统计与结构分类方法来构造和使用参考指数。
在本发明的一些实施例中，参考或基线值是从一或多个健康的受试者或尚未被诊断患有任何癌症的受试者得到的对照样品中的特定相关基因的表达水平。
在本发明的一些实施例中，参考或基线值是从相同受试者在任何癌症治疗之前获得的样品中的特定相关基因的表达水平。在本发明的其它实施例中，参考或基线值是从相同受试者在癌症治疗期间获得的样品中的特定相关基因的表达水平。或者，参考或基线值是预先从与所测试的受试者相同的受试者或从具有类似的年龄范围、疾病状态(例如，阶段)的受试者获得的样品中的特定相关基因的表达水平的预先测量结果。
在一些实施例中，有效量意指足以增加受试者中的在治疗之前降低的至少一种基因的表达水平的量或足以缓解癌症的一或多种症状的量。举例来说，有效量是足以使至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平相比于参考值或未用任何化合物处理的表达水平增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多的量。
在一些实施例中，有效量意指足以降低受试者中的在治疗之前增加的至少一种基因的表达水平的量或足以缓解癌症的一或多种症状的量。举例来说，有效量是足以使至少一个选自由刺猬路径基因、MYC和EZH2组成的群组的基因的表达水平相比于参考值或未用任何化合物处理的表达水平降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多的量。
受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、身材和健康状况；病况的性质和程度；以及所选择投与的治疗剂。针对指定情况的有效量可以通过在临床医师的技能和判断内的常规实验来测定。
本发明进一步提供一种测定癌症治疗在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法通过(a)测量从受试者获得的样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；(b)比较在步骤(a)中的至少一种基因的表达水平与参考值或预先测量结果；以及(c)基于比较步骤测定癌症治疗的功效。例示性癌症治疗是向所测试的受试者投与本发明化合物。
当所测试的受试者的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达1)相比于参考值或预先测量结果；或2)在所监控的时间段内，例如1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久的时间内有所增加时，所述治疗是有效的。当现有治疗无效时，应该为所测试的受试者寻求新的治疗或增加现有治疗的剂量(例如，增加向受试者投与的化合物的剂量)。
本发明还提供一种测定癌症治疗在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法通过(a)测量从受试者获得的样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；(b)比较在步骤(a)中的至少一种基因的表达水平与参考值或预先测量结果；以及(c)基于比较步骤测定癌症治疗的功效。例示性癌症治疗是向所测试的受试者投与本发明的EZH2抑制剂。
举例来说，当所测试的受试者的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达1)相比于参考值或预先测量结果；或2)在所监控的时间段内，例如1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久的时间内有所降低时，所述治疗是有效的。当现有治疗无效时，应该为所测试的受试者寻求新的治疗或增加现有治疗的剂量(例如，增加向受试者投与的化合物的剂量)。
在本文中提出的任何方法中，癌症选自由以下组成的群组：脑和中枢神经系统(CNS)癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、乳癌和前列腺癌。优选地，癌症选自由以下组成的群组：成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出(NOS)的肉瘤。更优选地，癌症是成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
如本文中所用，术语“反应性”与术语“反应”、“敏感”和“敏感性”是可互换的，并且它意指受试者在被投与EZH抑制剂时显示出治疗性反应，例如受试者的肿瘤细胞或肿瘤组织经历细胞凋亡和/或坏死，和/或展示出减少的生长、分裂或增殖。这个术语还意指相对于群体中的大多数而言，受试者在被投与EZH抑制剂时将具有或具有更高的概率显示出治疗性反应，例如受试者的肿瘤细胞或肿瘤组织经历细胞凋亡和/或坏死，和/或展示减少的生长、分裂或增殖。
如本文中所用，“受试者”与“有需要的受试者”是可互换的，两者均是指患有其中EZH2介导的蛋白质甲基化起作用的病症的受试者，或相对于群体中的大多数，患这类病症的风险增加的受试者。有需要的受试者可以是患有与SWI/SNF复合物相关的病症的受试者。有需要的受试者可以具有癌前病况。优选地，有需要的受试者患有癌症。有需要的受试者可以患有与SWI/SNF复合物相关的癌症。有需要的受试者可以患有与SWI/SNF复合物的至少一种组分的功能缺失相关的癌症。在一个优选方面中、有需要的受试者患有一或多种选自由以下组成的群组的癌症：脑和中枢神经系统(CNS)癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、乳癌和前列腺癌。优选地，有需要的受试者患有成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出(NOS)的肉瘤。或者，有需要的受试者患有非NHL癌症。
如本文中所用，“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如人类或恰当的非人类哺乳动物，例如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。受试者还可以是鸟或家禽。在一个实施例中，所述哺乳动物是人类。受试者可以是雄性或雌性。
有需要的受试者可以是先前尚未被诊断或鉴别为患有癌症或癌前病况的受试者。有需要的受试者可以是先前已被诊断或鉴别为患有癌症或癌前病况的受试者。有需要的受试者还可以是正患有(例如，正在遭受)癌症或癌前病况的受试者。或者，有需要的受试者可以是相对于群体中的大多数，具有患这类病症的风险的受试者(即，相对于群体中的大多数，倾向于患这类病症的受试者)。
任选地，有需要的受试者已经经历、正在经历或即将经历癌症或癌前病况的至少一种治疗性干预。
有需要的受试者可以用最新疗法来治疗难治愈的癌症。“难治愈的癌症”意指对治疗不起反应的癌症。所述癌症可能在治疗开始时有抗性或者它可能在治疗期间变得有抗性。难治愈的癌症也称为抗性癌症。在一些实施例中，有需要的受试者在基于最新疗法缓解之后具有癌症复发。在一些实施例中，有需要的受试者接受了所有已知可用于癌症治疗的有效疗法并且失败了。在一些实施例中，有需要的受试者接受了至少一种先前疗法。
有需要的受试者可以是患过、正患着或倾向于患上与SWI/SNF复合物相关的癌症或癌前病况的受试者。有需要的受试者可以是患过、正患着或倾向于患上与SWI/SNF复合物的至少一种组分的功能缺失相关的癌症或癌前病况的受试者。在一个优选方面中，有需要的受试者是患过、正患着或倾向于患上一或多种选自由以下组成的群组的癌症的受试者：脑和中枢神经系统(CNS)癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、乳癌和前列腺癌。优选地，有需要的受试者是患过、正患着或倾向于患上脑和CNS癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和/或肉瘤的受试者。例示性脑和中枢CNS癌包括成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和成松果体细胞瘤。例示性卵巢癌包括卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌和卵巢浆液性腺癌。例示性胰脏癌包括胰腺导管腺癌和胰腺内分泌肿瘤。例示性肉瘤包括软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和未另列出(NOS)的肉瘤。或者，有待通过本发明化合物治疗的癌症是非NHL癌症。
或者，有需要的受试者是患过、正患着或倾向于患上一或多种选自由以下组成的群组的癌症的受试者：成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及未另列出(NOS)的肉瘤。优选地，受试者是患过、正患着或倾向于患上以下各者的受试者：成神经管细胞瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、胰腺导管腺癌、恶性横纹肌样肿瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和/或NOS肉瘤。更优选地，有需要的受试者是患过、正患着或倾向于患上恶性横纹肌样肿瘤、成神经管细胞瘤和/或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤的受试者。
在本发明的一些实施例中，有需要的受试者的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平降低。
在一些实施例中，有需要的受试者的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平增加。
在本发明的一些实施例中，有需要的受试者具有SWI/SNF复合物的至少一种组分/亚基的功能缺失。或者，有需要的受试者具有SWI/SNF复合物的至少一种组分/亚基的降低表达或单倍剂量不足。在某些实施例中，有需要的受试者具有SNF5亚基的功能缺失。
在本发明的任何方法中，有需要的受试者可以具有SWI/SNF复合物下游的至少一种信号传导组分的降低表达、单倍剂量不足或功能缺失。所述下游组分包括(但不限于)多梳蛋白复合物(PcG)和其目标。
如本文中所用，术语“功能缺失”是指相比于野生型，基因产物/蛋白质的功能减小或无功能。SWI/SNF复合物组分的功能缺失意指组分/亚基或完整SWI/SNF复合物分别相比于野生型组分/亚基或完整SWI/SNF复合物，生物功能减小或无生物功能。功能缺失可能是由转录、转录后或翻译后机制引起的。在本发明的一个方面中，功能缺失是由SWI/SNF复合物组分的多肽或编码SWI/SNF复合物组分的多肽的核酸序列中的点突变(例如，取代、错义突变或无义突变)、插入和/或缺失产生的功能缺失突变引起的。本文中提到的突变是体细胞突变。术语“体细胞突变”是指不是在每一个体细胞中发现而是仅在分离细胞中发现的至少一个基因等位基因的有害改变。如本文中所用的体细胞突变的特征是它们受限于特定组织或甚至组织的一部分或组织内的细胞中并且不存在于具有所述组织或细胞的整个生物体中。术语“野生型”是指基因或基因产物具有从天然存在的来源分离的所述基因或基因产物的特征。野生型基因是最常在群体中观察到的基因并且因此是所述基因的任意设计的“正常”或“野生型”形式。
因此，可以使用在本领域中可获得的任何合适的方法检测功能缺失突变或降低表达。举例来说，可以通过测量基因产物的生物功能，例如SWI/SNF复合物的ATP依赖性染色质重塑活性来检测功能缺失突变。或者，可以通过检测编码SWI/SNF复合物的组分的核酸序列中的任何交替来测定功能缺失突变。举例来说，可以根据在本领域中众所周知的方法，使用适当选择的DNA和聚合酶链式反应(PCR)引物的来源，通过全基因组重测序或目标区域重测序(后者也称为靶向重测序)来检测编码具有功能缺失突变的SWI/SNF复合物的组分的核酸序列。所述方法典型地并且通常需要以下步骤：基因组DNA纯化、PCR扩增以扩增相关区域、循环测序、测序反应净化、毛细管电泳和/或数据分析。或者或另外，所述方法可以包括使用基于微阵列的靶向区域基因组DNA捕获和/或测序。用于选择恰当PCR引物并且执行重测序的试剂盒、试剂和的方法可购自例如应用生物系统(AppliedBiosystems)、安捷伦(Agilent)和尼姆布雷根(NimbleGen)(罗氏诊断公司(RocheDiagnosticsGmbH))。或者或另外，可以使用DNA印迹法(Southernblot)，根据在本领域中众所周知的方法来检测编码具有功能缺失突变的SWI/SNF多肽的核酸序列。任选地，可以通过测量不存在组成性多肽的表达或通过测量突变型组成性多肽的表达来检测功能缺失突变。(突变型)多肽表达的检测可以用本领域中的任何合适的免疫分析(例如蛋白质印迹分析)来执行。
SWI/SNF复合物的组分的人类核酸和氨基酸序列先前已经有过描述。例如关于SNF5，参看基因库登记号NP_003064.2、NM_003073.3、NP_001007469.1和NM_001007468.1；关于ATRX，参看基因库登记号NM_000489.3、NP_000480.2、NM_138270.2和NP_612114.1；关于ARID1A，参看基因库登记号NP_006006.3、NM_006015.4、NP_624361.1和NM_139135.2，其各自以全文引用的方式并入本文中。
人类中的hSNF5体细胞突变谱也已在塞弗内(Sevenet)等人,《人类分子遗传学》(HumanMolecularGenetics),8:2359-2368,1999中有所描述，其以全文引用的方式并入本文中。
有需要的受试者可能具有SNF5的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失。举例来说，受试者可以包含在SNF5多肽或编码SNF5多肽的核酸序列中的SNF5缺失。
有需要的受试者可能具有ATRX的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失。举例来说，受试者可以包含选自由以下组成的群组的突变：天冬酰胺(N)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置688处的野生型残基赖氨酸(K)(K688N)和异亮氨酸(I)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置366处的野生型残基蛋氨酸(M)(M366I)。
有需要的受试者可能具有ARID1A的降低表达、单倍剂量不足和/或功能缺失。举例来说，受试者可以包括选自由以下组成的群组的突变：在SEQIDNO:11的氨基酸位置884处的野生型残基半胱氨酸(C)的无义突变(C884*)；赖氨酸(K)取代在氨基酸位置966处的野生型残基谷氨酸(E)(E966K)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1411处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1411*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1720处在野生型残基苯丙氨酸(F)处的移码突变(F1720fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)之后的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1874处在野生型残基半胱氨酸(C)处的移码突变(C1874fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1957处的野生型残基天冬氨酸(D)(D1957E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1430处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1430*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1721处在野生型残基精氨酸(R)处的移码突变(R1721fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1255处的野生型残基甘氨酸(G)(G1255E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置284处的野生型残基甘氨酸(G)的移码突变(G284fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1722处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1722*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置274处在野生型残基蛋氨酸(M)处的移码突变(M274fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)处的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置559处在野生型残基P处的移码突变(P559fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1276处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1276*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2176处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q2176fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置203处在野生型残基组氨酸(H)处的移码突变(H203fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置591处在野生型残基丙氨酸(A)处的移码突变(A591fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1322处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1322*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2264处的野生型残基丝氨酸(S)的无义突变(S2264*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置586处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q586*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置548处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q548fs)；以及在SEQIDNO:11的氨基酸位置756处在野生型残基天冬酰胺(N)处的移码突变(N756fs)。本文中所用的“*”是指终止密码子。本文中所用的“fs”是指移码。
本发明还提供通过使细胞与本发明化合物(即，EZH2抑制剂)接触来诱导神经元分化的方法。优选地，所述化合物的量足以增加至少一个选自由以下组成的群组的基因的表达：CD133(也称为PROM1)、DOCK4、PTPRK、PROM2、LHX1、LHX6、LHX9、PAX6、PAX7、VEFGA、FZD3B、FYN、HIF1A、HTRA2、EVX1、CCDC64和GFAP。
本文中所用的术语“诱导神经元分化”是指由于对所述细胞的直接或故意的作用，引起细胞发展成神经元谱系的细胞。
本发明还提供通过使细胞与本发明化合物接触来诱导细胞周期抑制的方法。优选地，所述化合物的量足以增加至少一个选自由以下组成的群组的基因的表达：CKDN1A、CDKN2A、MEN1、CHEK1、IRF6、ALOX15B、CYP27B1、DBC1、NME6、GMNN、HEXIM1、LATS1、MYC、HRAS、TGFB1、IFNG、WNT1、TP53、THBS1、INHBA、IL8、IRF1、TPR、BMP2、BMP4、ETS1、HPGD、BMP7、GATA3、NR2F2、APC、PTPN3、CALR、IL12A、IL12B、PML、CDKN2B、CDKN2C、CDKN1B、SOX2、TAF6、DNA2、PLK1、TERF1、GAS1、CDKN2D、MLF1、PTEN、TGFB2、SMAD3、FOXO4、CDK6、TFAP4、MAP2K1、NOTCH2、FOXC1、DLG1、MAD2L1、ATM、NAE1、DGKZ、FHL1、SCRIB、BTG3、PTPRK、RPS6KA2、STK11、CDKN3、TBRG1、CDC73、THAP5、CRLF3、DCUN1D3、MYOCD、PAF1、LILRB1、UHMK1、PNPT1、USP47、HEXIM2、CDK5RAP1、NKX3-1、TIPIN、PCBP4、USP44、RBM38、CDT1、RGCC、RNF167、CLSPN、CHMP1A、WDR6、TCF7L2、LATS2、RASSF1、MLTK、MAD2L2、FBXO5、ING4以及TRIM35。
本文中所用的术语“诱导细胞周期抑制”是指在细胞分裂和/或复制期间的任何阶段引起累积或阻滞。
本发明还提供通过使细胞与本发明化合物接触来诱导肿瘤遏制的方法。优选地，化合物的量足以增加BIN1或任何肿瘤抑制因子的表达。
术语“诱导肿瘤遏制”可以包括(但不限于)减小肿瘤大小；减小肿瘤体积；减少肿瘤数量；减少远离原发性肿瘤位点的其它组织或器官中的转移性病变的数量；相比于只接受载剂的群体，经治疗的受试者群体的平均存活时间增加；相比于未经治疗的受试者群体，经治疗的受试者群体的平均存活时间增加；相比于接受不是本发明化合物的药物单一疗法的群体，经治疗的受试者群体的平均存活时间增加；相比于只接受载剂的群体，经治疗的受试者群体的死亡率降低；肿瘤生长速率降低；或肿瘤再生速率降低。
本发明还提供通过使细胞与本发明化合物接触来抑制刺猬信号传导的方法。优选地，所述化合物的量足以降低至少一个选自由以下组成的群组的基因的表达：GLI1、PTCH1、SUFU、KIF7、GLI2、BMP4、MAP3K10、SHH、TCTN3、DYRK2、PTCHD1和SMO。
短语“抑制刺猬信号传导”意指相比于在无任何化合物处理的情况下的刺猬信号传导强度(strength/intensity)，在化合物处理的情况下，刺猬信号传导强度(strength/intensity)降低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多。
本发明还提供通过使细胞与本发明化合物接触来诱导基因表达的方法。优选地，所述化合物的量足以诱导神经元分化、细胞周期抑制和/或肿瘤遏制。所述基因选自由以下组成的群组：CD133(也称为PROM1)、DOCK4、PTPRK、PROM2、LHX1、LHX6、LHX9、PAX6、PAX7、VEFGA、FZD3B、FYN、HIF1A、HTRA2、EVX1、CCDC64、GFAP、CKDN1A、CDKN2A、MEN1、CHEK1、IRF6、ALOX15B、CYP27B1、DBC1、NME6、GMNN、HEXIM1、LATS1、MYC、HRAS、TGFB1、IFNG、WNT1、TP53、THBS1、INHBA、IL8、IRF1、TPR、BMP2、BMP4、ETS1、HPGD、BMP7、GATA3、NR2F2、APC、PTPN3、CALR、IL12A、IL12B、PML、CDKN2B、CDKN2C、CDKN1B、SOX2、TAF6、DNA2、PLK1、TERF1、GAS1、CDKN2D、MLF1、PTEN、TGFB2、SMAD3、FOXO4、CDK6、TFAP4、MAP2K1、NOTCH2、FOXC1、DLG1、MAD2L1、ATM、NAE1、DGKZ、FHL1、SCRIB、BTG3、PTPRK、RPS6KA2、STK11、CDKN3、TBRG1、CDC73、THAP5、CRLF3、DCUN1D3、MYOCD、PAF1、LILRB1、UHMK1、PNPT1、USP47、HEXIM2、CDK5RAP1、NKX3-1、TIPIN、PCBP4、USP44、RBM38、CDT1、RGCC、RNF167、CLSPN、CHMP1A、WDR6、TCF7L2、LATS2、RASSF1、MLTK、MAD2L2、FBXO5、ING4、TRIM35、BIN1以及任何肿瘤抑制因子。
短语“诱导基因表达”意指特定相关基因的表达水平相比于这个基因在无任何化合物处理的情况下的表达水平增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多。
本发明还提供抑制基因表达的方法，包含使细胞与本发明化合物接触。优选地，所述化合物的量足以抑制刺猬信号传导。所述基因是GLI1、PTCH1、SUFU、KIF7、GLI2、BMP4、MAP3K10、SHH、TCTN3、DYRK2、PTCHD1或SMO。
短语“抑制基因表达”意指特定相关基因的表达水平相比于这个基因在无任何化合物处理的情况下的表达水平降低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％或更多。
神经元分化、细胞周期抑制、肿瘤遏制和刺猬信号传导抑制可以通过本领域中已知的任何方法测定。
如本文中所用，细胞是指可以通过本文中所述的方法获得和使用的任何细胞。举例来说，细胞可以从细胞培养获得。或者，细胞可以从受试者分离。细胞还可以是指受试者的细胞。
细胞可以包含SNF5、ARID1A、ATRX和/或SWI/SNF复合物的组分的功能缺失。优选地，细胞可以包含SNF5的缺失。
细胞可以是癌细胞，其中所述癌症选自由以下组成的群组：成神经管细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出(NOS)的肉瘤。更优选地，细胞是成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤或非典型畸胎样横纹肌样肿瘤的癌细胞。
有待治疗的癌症可以根据美国癌症联合委员会(AJCC)TNM分类系统进行分期，其中肿瘤(T)已经分配了以下各期：TX、T1、T1mic、T1a、T1b、T1c、T2、T3、T4、T4a、T4b、T4c或T4d；并且其中局部淋巴结(N)已经分配了以下各期：NX、N0、N1、N2、N2a、N2b、N3、N3a、N3b或N3c；并且其中远端转移(M)可以分配以下各期：MX、M0或M1。有待治疗的癌症可以根据美国癌症联合会(AJCC)分类分期为I期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期、IIIC期或IV期。有待治疗的癌症可以根据AJCC分类分配级别，分配为GX级(例如，不能被评定的级别)、1级、2级、3级或4级。有待治疗的癌症可以根据以下AJCC病理分类(pN)分期：pNX、pN0、PN0(I-)、PN0(I+)、PN0(mol-)、PN0(mol+)、PN1、PN1(mi)、PN1a、PN1b、PN1c、pN2、pN2a、pN2b、pN3、pN3a、pN3b或pN3c。
有待治疗的癌症可以通过DNA血细胞计数、流式细胞术或图像血细胞计数来评估。有待治疗的癌症可以输入为有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞处于细胞分裂的合成期(例如，细胞分裂的S期)。有待治疗的癌症可以输入为具有低S期分数或高S期分数。
如本文中所用，“正常细胞”是不能归类为“细胞增殖性病症”的一部分的细胞。正常细胞不具有会导致发展出不希望的病况或疾病的不受调控或异常的生长或两者。优选地，正常细胞拥有正常起作用的细胞周期检查点控制机制。
如本文中所用，“接触细胞”是指其中化合物或其它物质组合物与细胞直接接触或足够接近以在细胞中诱导所希望的生物作用的情况。
如本文中所用，“单一疗法”是指向有需要的受试者投与单一活性或治疗性化合物。优选地，单一疗法将涉及投与治疗有效量的活性化合物。举例来说，向需要治疗癌症的受试者投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂合物、类似物或衍生物中的一种的癌症单一疗法。单一疗法可以与组合疗法形成对照，在组合疗法中，投与多种活性化合物的组合，优选地，组合中的每种组分以治疗有效量存在。一方面，采用本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物的单一疗法在诱导所希望的生物作用时比组合疗法有效。
如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treat)”描述为了对抗疾病、病况或病症而对患者采取的管理和护理并且包括投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物以缓解疾病、病况或病症的一或多种症状或并发症，或用于消除所述疾病、病况或病症。术语“治疗”还可以包括体外细胞或动物模型的治疗。
本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物还可以用于预防疾病、病况或病症，或用于鉴别用于这类目的的合适候选物。如本文中所用，“预防(preventing)”或“预防(prevent)”描述减少或消除疾病、病况或病症的症状或并发症的发作。
如本文中所用，术语“缓解”打算用于描述降低病症的体征或症状的严重程度的过程。重要的是，体征或症状可以得到缓解，但未被消除。在优选实施例中，本发明医药组合物的投与促成了体征或症状的消除，然而，消除不是所需要的。预计有效剂量是降低体征或症状的严重程度。举例来说，如果在多个位置中的至少一个内的癌症的严重程度降低，那么可以出现在多个位置中的例如癌症的病症的体征或症状得到缓解。
如本文中所用，术语“严重程度”打算用于描述癌症从癌变前或良性状态转换成恶性状态的可能性。或者或另外，严重程度打算用于描述例如根据TNM系统(受到国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)的认可)或通过其它领域公认的方法的癌症期。癌症期是指基于例如原发性肿瘤的位置、肿瘤大小、肿瘤数量和淋巴结参与情况(癌症扩散到淋巴结中)的因素，癌症的程度或严重程度。或者或另外，严重程度打算用于描述通过领域公认的方法(参看国家癌症研究所www.cancer.gov)的肿瘤分级。肿瘤分级是用于就癌细胞在显微镜下看起来有多异常并且肿瘤可能有多快速地生长和扩散来说对其进行分类的系统。当确定肿瘤级别时，考虑许多因素，包括细胞的结构和生长模式。用于确定肿瘤级别的具体因素随着癌症的每种类型而变化。严重程度还描述了组织学分级，也称为分化，其是指肿瘤细胞有多类似相同组织类型的正常细胞(参看国家癌症研究所www.cancer.gov)。此外，严重程度描述细胞核分级，其是指肿瘤细胞中的细胞核的大小和形状以及正在分裂的肿瘤细胞的百分比(参看国家癌症研究所www.cancer.gov)。
在本发明的另一个方面，严重程度描述肿瘤已经分泌生长因子、降解细胞外基质、变成血管化、丢失对并列组织的粘附或被转移的程度。此外，严重程度描述已经转移有原发性肿瘤的位置的数量。最后，严重程度包括不同类型和位置的肿瘤的治疗困难。举例来说，不可操作的肿瘤、有更多机会进入多个身体系统(血液和免疫肿瘤)的那些癌症以及对传统治疗最具有抗性的那些被认为是最严重的。在这些情况下，考虑延长受试者的预期寿命和/或减少疼痛、降低癌细胞的比例或将细胞限制在一个系统以及改善癌症分期/肿瘤分级/组织学分级/细胞核分级来缓解癌症的体征或症状。
如本文中所用，术语“症状”定义为疾病、病痛、损伤或身体不舒服的指示。正在经历所述症状的个体能感觉到或注意到症状，但是其他人不能容易地注意到。其他人定义为非医疗保健专业人员。
如本文中所用，术语“体征”也定义为身体不舒服的指示。但是体症定义为可以被医生、护士或其他医疗保健专业人员看到的东西。
癌症是一组可以引起几乎任何体征或症状的疾病。所述体症和症状将取决于癌症所处的位置、癌症的大小以及它对附近器官或结构的影响。如果癌症扩散(转移)，那么症状会出现在身体的不同部分。
治疗癌症可以引起肿瘤大小减小。肿瘤大小减小也可以被称作“肿瘤消退”。优选地，在治疗之后，肿瘤大小相对于其在治疗之前的大小减小了5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小了10％或更多；更优选地，减小了20％或更多；更优选地，减小了30％或更多；更优选地，减小了40％或更多；甚至更优选地，减小了50％或更多；并且最优选地，减小了超过75％或更多。肿瘤大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤大小可以按肿瘤的直径来测量。
治疗癌症可以引起肿瘤体积减小。优选地，在治疗之后，肿瘤体积相对于其在治疗之前的大小减小了5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小了10％或更多；更优选地，减小了20％或更多；更优选地，减小了30％或更多；更优选地，减小了40％或更多；甚至更优选地，减小了50％或更多；并且最优选地，减小了超过75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。
治疗癌症引起肿瘤数量减少。优选地，在治疗之后，肿瘤数量相对于在治疗之前的数量减少了5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少了10％或更多；更优选地，减少了20％或更多；更优选地，减少了30％或更多；更优选地，减少了40％或更多；甚至更优选地，减少了50％或更多；并且最优选地，减少了超过75％。肿瘤数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤数量可以通过计数肉眼或在指定放大倍数下可见的肿瘤来测量。优选地，指定放大倍数是2×、3×、4×、5×、10×或50×。
治疗癌症可以引起在远离原发性肿瘤位点的其它组织或器官中的转移性病变的数量减少。优选地，在治疗之后，转移性病变的数量相对于在治疗之前的数量减少了5％或更多；更优选地，转移性病变的数量减少了10％或更多；更优选地，减少了20％或更多；更优选地，减少了30％或更多；更优选地，减少了40％或更多；甚至更优选地，减少了50％或更多；并且最优选地，减少了超过75％。转移性病变的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。转移性病变的数量可以通过计数肉眼或在指定放大倍数下可见的转移性病变来测量。优选地，指定放大倍数是2×、3×、4×、5×、10×或50×。
治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于只接受载剂的群体，平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；并且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加量可以通过任何可再现手段测量。群体的平均存活时间的增加量可以例如通过计算在开始用活性化合物治疗之后群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加量还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于未经治疗的受试者群体，平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；并且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加量可以通过任何可再现手段测量。群体的平均存活时间的增加量可以例如通过计算在开始用活性化合物治疗之后群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加量还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于接受药物单一疗法的群体，平均存活时间增加，所述药物不是本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂合物、类似物或衍生物。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；并且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加量可以通过任何可再现手段测量。群体的平均存活时间的增加量可以例如通过计算在开始用活性化合物治疗之后群体的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加量还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后群体的平均存活长度来测量。
治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于只接受载剂的群体，死亡率降低。治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于未经治疗的群体，死亡率降低。治疗癌症可以引起经治疗的受试者群体相比于接受药物单一疗法的群体，死亡率降低，所述药物不是本发明化合物、或其医药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂合物、类似物或衍生物。优选地，死亡率降低了超过2％；更优选地，降低了超过5％；更优选地，降低了超过10％；并且最优选地，降低了超过25％。经治疗的受试者群体的死亡率降低量可以通过任何可再现手段测量。群体的死亡率降低量可以例如通过计算在开始用活性化合物治疗之后，群体的每单位时间疾病相关死亡的平均数来测量。群体的死亡率降低量还可以例如通过计算在用活性化合物完成第一轮治疗之后，群体的每单位时间疾病相关死亡的平均数来测量。
治疗癌症可以引起肿瘤生长速率减小。优选地，在治疗之后，肿瘤生长速率相对于在治疗之前的值减小了至少5％；更优选地，肿瘤生长速率减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤生长速率可以根据每单位时间的肿瘤直径变化来测量。
治疗癌症可以引起肿瘤再生长减少。优选地，在治疗之后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；并且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤再生长例如通过在遵循治疗的预先肿瘤收缩之后，测量肿瘤直径的增加量来测量。在治疗已经停止之后，肿瘤复发失败表示肿瘤再生长减少。
治疗癌症可以引起细胞增殖速率减小。优选地，在治疗之后，细胞增殖速率减小了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖速率例如通过测量每单位时间组织样品中正在分裂的细胞的数量来测量。
治疗癌症可以引起增殖细胞的比例减少。优选地，在治疗之后，增殖细胞的比例减少了至少5％；更优选地，减少了至少10％；更优选地，减少了至少20％；更优选地，减少了至少30％；更优选地，减少了至少40％；更优选地，减少了至少50％；甚至更优选地，减少了至少50％；并且最优选地，减少了至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可再现的测量手段来测量。优选地，增殖细胞的比例例如通过对组织样品中的分裂细胞的数量相对于非分裂细胞的数量进行定量来测量。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。
治疗癌症可以引起细胞增殖区域或区段的大小减小。优选地，在治疗之后，细胞增殖区域或区段的大小相对于其在治疗之前的大小减小了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。细胞增殖区域或区段的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖区域或区段的大小可以按细胞增殖区域或区段的直径或宽度来测量。
治疗癌症可以引起具有异常外观或形态的细胞的数量或比例减小。优选地，在治疗之后，具有异常形态的细胞的数量相对于其在治疗之前的大小减小了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。异常的细胞外观或形态可以通过任何可再现的测量手段来测量。异常的细胞形态可以通过显微镜来测量，例如使用倒置组织培养显微镜。异常的细胞形态可以呈细胞核多型性形式。
治疗癌症可以引起细胞死亡，并且优选地，细胞死亡引起群体中的细胞数量减少至少10％。更优选地，细胞死亡意指减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；最优选地，减少至少75％。群体中的细胞数量可以通过任何可再现手段测量。群体中的细胞的数量可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)、免疫荧光显微镜和光学显微镜来测量。测量细胞死亡的方法如李(Li)等人,《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA.)100(5):2674-8,2003中所示。在一个方面，细胞死亡通过细胞凋亡发生。
如本文中所用，术语“选择性地”意指倾向于在一个群体中比在另一个群体中高的频率下发生。所比较的群体可以是细胞群体。优选地，本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物选择性地对癌症或癌变前细胞起作用，但不对正常细胞起作用。优选地，本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物选择性地起作用以调节一个分子目标(例如，目标蛋白甲基转移酶)，但是不显著调节另一个分子目标(例如，非目标蛋白质甲基转移酶)。本发明还提供一种用于选择性地抑制酶活性的方法，所述酶例如蛋白质甲基转移酶。优选地，如果一个事件在群体A中发生的频率是群体B中的两倍，那么相对于群体B，所述事件选择性地发生在群体A中。如果一个事件在群体A中发生的频率是五倍，那么所述事件选择性地发生。如果相比于群体B，一个事件在群体A中发生的频率超过十倍；更优选地，超过五十倍；甚至更优选地，超过100倍；并且最优选地，在群体A中超过1000倍，那么所述事件选择性地发生。举例来说，如果细胞死亡在癌细胞中发生的频率是正常细胞中的两倍，那么可以说在癌细胞中选择性地发生细胞死亡。
本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物可以调节分子目标(例如，目标蛋白甲基转移酶)的活性。调节是指刺激或抑制分子目标的活性。优选地，如果本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物对分子目标的活性的刺激或抑制是在只缺乏所述化合物的存在的相同条件下分子目标的活性的至少2倍，那么它调节分子目标的活性。更优选地，如果本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物对分子目标的活性的刺激或抑制是在只缺乏所述化合物的存在的相同条件下分子目标的活性的至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，那么它调节分子目标的活性。分子目标的活性可以通过任何可再现手段测量。分子目标的活性可以体外或体内测量。举例来说，分子目标的活性可以通过酶活性分析或DNA结合分析体外测量，或分子目标的活性可以通过对报告基因的表达的分析体内测量。
如果本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物的添加不刺激或抑制分子目标的活性相对于在只缺乏所述化合物的存在的相同条件下分子目标的活性的超过10％，那么所述化合物不显著调节分子目标的活性。
如本文中所用，术语“同工酶选择性”意指相比于第二同工型酶，优先抑制或刺激第一同工型酶(例如，相比于蛋白质甲基转移酶同工酶β，优先抑制或刺激蛋白质甲基转移酶同工酶α)。优选地，本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物展现出在实现生物作用所需要的剂量方面，最少相差四倍；优选地，相差十倍；更优选地，相差五十倍。优选地，本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物展现出在抑制范围内的这种差异，并且所述差异例示为IC50，即针对相关分子目标50％抑制。
向有需要的细胞或受试者投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物可以引起对相关蛋白质甲基转移酶的活性的调节(即，刺激或抑制)。
H3-K27的甲基化、三甲基化H3-K27的形成、单甲基化H3-K27到二甲基化H3-K27的转化或二甲基化H3-K27到三甲基化H3-K27的转化的检测可以使用任何合适的方法实现。例示性方法可见于US20120071418中，其内容以引用的方式并入本文中。
向有需要的细胞或受试者投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物引起对细胞内目标(例如，底物)的活性的调节(即，刺激或抑制)。若干细胞内目标可以用本发明化合物调节，包括(但不限于)蛋白质甲基转移酶。
优选地，有效量的本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物对正常细胞无显著细胞毒性。如果以治疗有效量投与化合物在超过10％的正常细胞中未诱导细胞死亡，那么治疗有效量的化合物对正常细胞无显著细胞毒性。如果以治疗有效量投与化合物在超过10％的正常细胞中未诱导细胞死亡，那么治疗有效量的化合物不显著影响正常细胞的活力。在一个方面，细胞死亡通过细胞凋亡发生。
使细胞与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物接触可以在癌细胞中选择性地诱导或活化细胞死亡。向有需要的受试者投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物可以在癌细胞中选择性地诱导或活化细胞死亡。使细胞与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物接触可以在一或多个受细胞增殖病症影响的细胞中选择性地诱导细胞死亡。优选地，向有需要的受试者投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物在一或多个受细胞增殖病症影响的细胞中选择性地诱导细胞死亡。
关于本文中所讨论的已知技术或等效技术的详细说明，本领域技术人员可以参考通用参考文本。这些文本包括奥斯贝(Ausubel)等人,《分子生物学实验室指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),约翰·威利父子公司(JohnWileyandSons,Inc.)(2005)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人,《分子克隆实验指南》(MolecularCloning,ALaboratoryManual)(第3版),冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress),冷泉港,纽约(2000)；科利根(Coligan)等人,《免疫学实验室指南》(CurrentProtocolsinImmunology),约翰·威利父子公司,纽约；恩纳(Enna)等人,《药理学实验室指南》(CurrentProtocolsinPharmacology),约翰·威利父子公司,纽约；芬格尔(Fingl)等人,《治疗学的药理学基础》(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)(1975),《雷明顿的药物科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences),马克出版公司(MackPublishingCo.),伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州(PA),第18版(1990)。当然还可以在制造或使用本发明的一个方面的过程中提到这些文本。
可以用于本文中所述的任何方法中的化合物(即，EZH2抑制剂)可以具有下式I：
或其医药学上可接受的盐；其中
R701是H、F、OR707、NHR707、-(C≡C)-(CH2)n7-R708、苯基、5或6元杂芳基、C3-8环烷基或含有1-3个杂原子的4-7元杂环烷基，其中所述苯基、5或6元杂芳基、C3-8环烷基或4-7元杂环烷基各自独立地任选地经一或多个选自以下各者的基团取代：卤基、C1-3烷基、OH、O-C1-6烷基、NH-C1-6烷基和经C3-8环烷基或含有1-3个杂原子的4-7元杂环烷基取代的C1-3烷基，其中所述O-C1-6烷基和NH-C1-6烷基中的每一个任选地经羟基、O-C1-3烷基或NH-C1-3烷基取代，所述O-C1-3烷基和NH-C1-3烷基中的每一个任选地进一步经O-C1-3烷基或NH-C1-3烷基取代；
R702和R703中的每一个独立地是H、卤基、C1-4烷基、C1-6烷氧基或C6-C10芳氧基，各自任选地经一或多个卤基取代；
R704和R705中的每一个独立地是C1-4烷基；
R706是经N(C1-4烷基)2取代的环己基，其中所述C1-4烷基中的一个或两个经C1-6烷氧基取代；或R706是四氢吡喃基；
R707是任选地经一或多个选自以下各者的基团取代的C1-4烷基：羟基、C1-4烷氧基、氨基、单-或二-C1-4烷基氨基、C3-8环烷基和含有1-3个杂原子的4-7元杂环烷基，其中所述C3-8环烷基或4-7元杂环烷基各自独立地进一步任选地经C1-3烷基取代；
R708是任选地经一或多个选自以下各者的基团取代的C1-4烷基：OH、卤基和C1-4烷氧基、含有1-3个杂原子的4-7元杂环烷基或O-C1-6烷基，其中所述4-7元杂环烷基可以任选地进一步经OH或C1-6烷基取代；并且
n7是0、1或2。
举例来说，R706是经N(C1-4烷基)2取代的环己基，其中C1-4烷基中的一个未经取代并且另一个经甲氧基取代。
举例来说，R706是
举例来说，所述化合物具有式II：
举例来说，R702是甲基或异丙基并且R703是甲基或甲氧基。
举例来说，R704是甲基。
举例来说，R701是OR707并且R707是任选地经OCH3或吗啉取代的C1-3烷基。
举例来说，R701是H或F。
举例来说，R701是四氢吡喃基、苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基或吡唑基，其中每一个任选地经甲基、甲氧基、经吗啉取代的乙基或-OCH2CH2OCH3取代。
举例来说，R708是吗啉、哌啶、哌嗪、吡咯烷、二氮杂环庚烷或氮杂环丁烷，其中每一个任选地经OH或C1-6烷基取代。
举例来说，R708是吗啉。
举例来说，R708是经C1-6烷基取代的哌嗪。
举例来说，R708是甲基、叔丁基或C(CH3)2OH。
可以用于本文中所述的任何方法中的化合物(即，EZH2抑制剂)可以具有下式III：
或其医药学上可接受的盐。
在这个式中：
R801是C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、含有1-3个杂原子的4-7元杂环烷基、苯基或5或6元杂芳基，其中每一个经O-C1-6烷基-Rx或NH-C1-6烷基-Rx取代，其中Rx是羟基、O-C1-3烷基或NH-C1-3烷基，并且除了当Rx是羟基时，Rx任选地进一步经O-C1-3烷基或NH-C1-3烷基取代；或R801是经-Q2-T2取代的苯基，其中Q2是一键或任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代的C1-C3烷基连接基团；并且T2是任选地经取代的4到12元杂环烷基；并且R801任选地进一步经取代；
R802和R803中的每一个独立地是H、卤基、C1-4烷基、C1-6烷氧基或C6-C10芳氧基，每一个任选地经一或多个卤基取代；
R804和R805中的每一个独立地是C1-4烷基；并且
R806是-Qx-Tx，其中Qx是一键或C1-4烷基连接基团，Tx是H、任选经取代的C1-4烷基、任选经取代的C3-C8环烷基或任选经取代的4到14元杂环烷基。
举例来说，Qx和Q2中的每一个独立地是一键或甲基连接基团，并且Tx和T2中的每一个独立地是四氢吡喃基、经1、2或3个C1-4烷基取代的哌啶基或经N(C1-4烷基)2取代的环己基，其中C1-4烷基中的一个或两个任选地经C1-6烷氧基取代；
举例来说，R806是经N(C1-4烷基)2取代的环己基并且R806是四氢吡喃基。
举例来说，R806是
举例来说，R801是经O-C1-6烷基-Rx取代的苯基或5或6元杂芳基，或R801是经CH2-四氢吡喃基取代的苯基。
举例来说，本发明化合物具有式IVa或IVb：
或其中Z'是CH或N，并且R807是C2-3烷基-Rx。
举例来说，R807是-CH2CH2OH、-CH2CH2OCH3或-CH2CH2OCH2CH2OCH3。
举例来说，R802是甲基或异丙基并且R803是甲基或甲氧基。
举例来说，R804是甲基。
本发明化合物可以具有下式(V)：
或其医药学上可接受的盐或酯。
在这个式中：
R2、R4和R12各自独立地是C1-6烷基；
R6是C6-C10芳基或5或6元杂芳基，其中每一个任选地经一或多个-Q2-T2取代，其中Q2是一键或任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代的C1-C3烷基连接基团，并且T2是H、卤基、氰基、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-NRbC(O)Ra、-NRbC(O)ORa、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb或RS2，其中Ra、Rb和Rc中的每一个独立地是H或RS3，A-是医药学上可接受的阴离子，RS2和RS3中的每一个独立地是C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基或5或6元杂芳基，或Ra和Rb连同其所连接的N原子一起形成具有0或1个另外杂原子的4到12元杂环烷基环，并且RS2、RS3和通过Ra和Rb形成的4到12元杂环烷基环中的每一个任选地经一或多个-Q3-T3取代，其中Q3是一键或C1-C3烷基连接基团，各自任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代，并且T3选自由卤基、氰基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基、5或6元杂芳基、ORd、COORd、-S(O)2Rd、-NRdRe和-C(O)NRdRe组成的群组，Rd和Re中的每一个独立地是H或C1-C6烷基，或-Q3-T3是氧代；或任何两个相邻的-Q2-T2连同其所连接的原子一起形成5或6元环，其任选地含有1-4个选自N、O和S的杂原子并且任选地经一或多个选自由以下组成的群组的取代基取代：卤基、羟基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基以及5或6元杂芳基；
R7是-Q4-T4，其中Q4是一键、C1-C4烷基连接基团或C2-C4烯基连接基团，每个连接基团任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代，并且T4是H、卤基、氰基、NRfRg、-ORf、-C(O)Rf、-C(O)ORf、-C(O)NRfRg、-C(O)NRfORg、-NRfC(O)Rg、-S(O)2Rf或RS4，其中Rf和Rg中的每一个独立地是H或RS5，RS4和RS5中的每一个独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且RS4和RS5中的每一个任选地经一或多个-Q5-T5取代，其中Q5是一键、C(O)、C(O)NRk、NRkC(O)、S(O)2或C1-C3烷基连接基团，Rk是H或C1-C6烷基，并且T5是H、卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基、5或6元杂芳基或S(O)qRq，其中q是0、1或2并且Rq是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且除了当T5是H、卤基、羟基或氰基时，T5任选地经一或多个选自由卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基和5或6元杂芳基组成的群组的取代基取代；或-Q5-T5是氧代；以及
R8是H、卤基、羟基、COOH、氰基、RS6、ORS6或COORS6，其中RS6是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、4到12元杂环烷基、氨基、单-C1-C6烷基氨基或二-C1-C6烷基氨基，并且RS6任选地经一或多个选自由卤基、羟基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基和二-C1-C6烷基氨基组成的群组的取代基取代；或R7和R8连同其所连接的N原子一起形成具有0到2个另外杂原子的4到11元杂环烷基环，并且通过R7和R8形成的4到11元杂环烷基环任选地经一或多个-Q6-T6取代，其中Q6是一键、C(O)、C(O)NRm、NRmC(O)、S(O)2或C1-C3烷基连接基团，Rm是H或C1-C6烷基，并且T6是H、卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基、5或6元杂芳基或S(O)pRp，其中p是0、1或2并且Rp是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且除了当T6是H、卤基、羟基或氰基时，T6任选地经一或多个选自由卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基和5或6元杂芳基组成的群组的取代基取代；或-Q6-T6是氧代。
举例来说，R6是C6-C10芳基或5或6元杂芳基，其中每一个任选地独立地经一或多个-Q2-T2取代，其中Q2是一键或C1-C3烷基连接基团，并且T2是H、卤基、氰基、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-、-C(O)NRaRb、-NRbC(O)Ra、-S(O)2Ra或RS2，其中Ra和Rb中的每一个独立地是H或RS3，RS2和RS3中的每一个独立地是C1-C6烷基，或Ra和Rb连同其所连接的N原子一起形成具有0或1个另外杂原子的4到7元杂环烷基环，并且RS2、RS3和通过Ra和Rb形成的4到7元杂环烷基环中的每一个任选地独立地经一或多个-Q3-T3取代，其中Q3是一键或C1-C3烷基连接基团，并且T3选自由卤基、C1-C6烷基、4到7元杂环烷基、ORd、-S(O)2Rd和-NRdRe组成的群组，Rd和Re中的每一个独立地是H或C1-C6烷基，或-Q3-T3是氧代；或任何两个相邻的-Q2-T2连同其所连接的原子一起形成任选地含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5或6元环。
举例来说，本发明化合物具有式(VI)：
或其医药学上可接受的盐，其中Q2是一键或甲基连接基团，T2是H、卤基、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-或-S(O)2NRaRb，R7是哌啶基、四氢吡喃、环戊基或环己基，各自任选地经一个-Q5-T5取代并且R8是乙基。
本发明化合物可以具有下式(VIa)：
其中
Ra和Rb中的每一个独立地是H或RS3，RS3是C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基或5或6元杂芳基，或Ra和Rb连同其所连接的N原子一起形成具有0或1个另外杂原子的4到12元杂环烷基环，并且RS3和通过Ra和Rb形成的4到12元杂环烷基环中的每一个任选地经一或多个-Q3-T3取代，其中Q3是一键或C1-C3烷基连接基团，各自任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代，并且T3选自由卤基、氰基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到12元杂环烷基、5或6元杂芳基、ORd、COORd、-S(O)2Rd、-NRdRe和-C(O)NRdRe组成的群组，Rd和Re中的每一个独立地是H或C1-C6烷基，或-Q3-T3是氧代；
R7是-Q4-T4，其中Q4是一键、C1-C4烷基连接基团或C2-C4烯基连接基团，每个连接基团任选地经卤基、氰基、羟基或C1-C6烷氧基取代，并且T4是H、卤基、氰基、NRfRg、-ORf、-C(O)Rf、-C(O)ORf、-C(O)NRfRg、-C(O)NRfORg、-NRfC(O)Rg、-S(O)2Rf或RS4，其中Rf和Rg中的每一个独立地是H或RS5，RS4和RS5中的每一个独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且RS4和RS5中的每一个任选地经一或多个-Q5-T5取代，其中Q5是一键、C(O)、C(O)NRk、NRkC(O)、S(O)2或C1-C3烷基连接基团，Rk是H或C1-C6烷基，并且T5是H、卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基、5或6元杂芳基或S(O)qRq，其中q是0、1或2并且Rq是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且除了当T5是H、卤基、羟基或氰基时，T5任选地经一或多个选自由卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基和5或6元杂芳基组成的群组的取代基取代；或-Q5-T5是氧代；其条件是R7不是H；以及
R8是H、卤基、羟基、COOH、氰基、RS6、ORS6或COORS6，其中RS6是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氨基、单-C1-C6烷基氨基或二-C1-C6烷基氨基，并且RS6任选地经一或多个选自由卤基、羟基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基和二-C1-C6烷基氨基组成的群组的取代基取代；或R7和R8连同其所连接的N原子一起形成具有0到2个另外杂原子并且任选地经一或多个-Q6-T6取代的4到11元杂环烷基环，其中Q6是一键、C(O)、C(O)NRm、NRmC(O)、S(O)2或C1-C3烷基连接基团，Rm是H或C1-C6烷基，并且T6是H、卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基、5或6元杂芳基或S(O)pRp，其中p是0、1或2并且Rp是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基或5或6元杂芳基，并且除了当T6是H、卤基、羟基或氰基时，T6任选地经一或多个选自由卤基、C1-C6烷基、羟基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4到7元杂环烷基和5或6元杂芳基组成的群组的取代基取代；或-Q6-T6是氧代。
举例来说，Ra和Rb连同其所连接的N原子一起形成具有0或1个除了N原子以外的杂原子的4到7元杂环烷基环并且所述环任选地经一或多个-Q3-T3取代，其中杂环烷基是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、异恶唑烷基、三唑烷基、哌啶基、1,2,3,6-四氢吡啶基、哌嗪基或吗啉基。
举例来说，R7是C3-C8环烷基或4到7元杂环烷基，各自任选地经一或多个-Q5-T5取代。
举例来说，R7是哌啶基、四氢吡喃、四氢-2H-硫代吡喃基、环戊基、环己基、吡咯烷基或环庚基，各自任选地经一或多个-Q5-T5取代。
举例来说，R8是H或任选地经一或多个选自由以下各者组成的群组的取代基取代的C1-C6烷基：卤基、羟基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基和二-C1-C6烷基氨基。
在一些实施例中，可以用于本文中提出的任何方法中的化合物是：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施例中，可以用于本文中提出的任何方法中的化合物是：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐和溶剂合物。
在一些实施例中，可以用于本文中提出的任何方法中的化合物是：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐和溶剂合物。
在一些实施例中，适用于本发明方法中的化合物包括式(VII)化合物：
其中，
V1是N或CR7，
V2是N或CR2，其条件是当V1是N时，V2是N，
X和Z独立地选自由以下各者组成的群组：氢、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、(C6-C10)双环烷基、未经取代的或经取代的杂环烷基、未经取代的或经取代的杂环烷基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的芳基、未经取代的或经取代的芳基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的杂芳基、未经取代的或经取代的杂芳基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、卤基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、-NRaNRaC(O)ORa、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；
Y是H或卤基；
R1是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的(C6-C10)双环烷基、未经取代的或经取代的杂环烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的杂环烷基-(C1-C8)烷基、未经取代的或经取代的芳基、未经取代的或经取代的芳基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、未经取代的或经取代的杂芳基、未经取代的或经取代的杂芳基-(C1-C8)烷基或-(C2-C8)烯基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb；
R2是氢、(C1-C8)烷基、三氟甲基、烷氧基或卤基，其中所述(C1-C8)烷基任选地经一个到两个选自氨基和(C1-C3)烷基氨基的基团取代；
R7是氢、(C1-C3)烷基或烷氧基；
R3是氢、(C1-C8)烷基、氰基、三氟甲基、-NRaRb或卤基；
R6选自由以下组成的群组：氢、卤基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基、未经取代的或经取代的(C3-C8)环烷基-(C1-C8)烷基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基、未经取代的或经取代的(C5-C8)环烯基-(C1-C8)烷基、(C6-C10)双环烷基、未经取代的或经取代的杂环烷基、未经取代的或经取代的杂环烷基-(C1-C8)烷基、未经取代的或经取代的芳基、未经取代的或经取代的芳基-(C1-C8)烷基、未经取代的或经取代的杂芳基、未经取代的或经取代的杂芳基-(C1-C8)烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、-NRaNRaC(O)ORa、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb；
其中任何(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、环烷基、环烯基、双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基任选地经1、2或3个独立地选自由以下组成的群组的基团取代：-O(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-S(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-(C1-C8)烷基-杂环烷基、(C3-C8)环烷基-杂环烷基、卤基、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、OC(O)NRaRb、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基(C1-C4)烷基和杂芳基(C1-C4)烷基；
其中所述芳基、杂芳基、芳基(C1-C4)烷基或杂芳基(C1-C4)烷基的任何芳基或杂芳基部分任选地经1、2或3个独立地选自由以下组成的群组的基团取代：卤基、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；
Ra和Rb各自独立地是氢、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C6-C10)双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中所述(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、环烷基、环烯基、双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：卤基、羟基、(C1-C4)烷氧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、-CO2H、-CO2(C1-C4)烷基、-CONH2、-CONH(C1-C4)烷基、-CON((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)、-SO2(C1-C4)烷基、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C4)烷基和SO2N((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地含有选自氧、氮和硫的另外杂原子的5-8元饱和或不饱和环，其中所述环任选地经1、2或3个独立地选自(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤烷基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、羟基、氧代、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基的基团取代，其中所述环任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环的6到10元桥联双环式环系统；
每个Rc独立地是(C1-C4)烷基氨基、-NRaSO2Rb、-SORa、-SO2Ra、-NRaC(O)ORa、-NRaRb或-CO2Ra；
或其盐。
由式(I)通用结构所涵盖的化合物的子组如下表示：
式(VII)子组A
X和Z选自由以下组成的群组：(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-NRaRb和-ORa；
Y是H或F；
R1选自由以下组成的群组：(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2是氢、(C1-C8)烷基、三氟甲基、烷氧基或卤基，其中所述(C1-C8)烷基任选地经一个到两个选自氨基和(C1-C3)烷基氨基的基团取代；
R7是氢、(C1-C3)烷基或烷氧基；
R3选自由以下组成的群组：氢、(C1-C8)烷基、氰基、三氟甲基、-NRaRb和卤基；
R6选自由以下组成的群组：氢、卤基、氰基、三氟甲基、氨基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、芳基、杂芳基、酰氨基、(C2-C8)炔基、芳基炔基、杂芳基炔基、-SO2Ra、-SO2NRaRb和-NRaSO2Rb；
其中任何(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)炔基、芳基炔基、杂芳基炔基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：-O(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-S(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-(C1-C6)烷基(Rc)1-2、-(C1-C8)烷基-杂环烷基、(C3-C8)环烷基-杂环烷基、卤基、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基(C1-C4)烷基和杂芳基(C1-C4)烷基；
Ra和Rb各自独立地是氢、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C6-C10)双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中所述(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、环烷基、环烯基、双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：卤基、羟基、(C1-C4)烷氧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、-CO2H、-CO2(C1-C4)烷基、-CONH2、-CONH(C1-C4)烷基、-CON((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)、-SO2(C1-C4)烷基、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C4)烷基和-SO2N((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地含有选自氧、氮和硫的另外杂原子的5-8元饱和或不饱和环，其中所述环任选地经1、2或3个独立地选自(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤烷基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、羟基、氧代、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基的基团取代，其中所述环任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环的6到10元桥联双环式环系统。这个特定子组A中的芳基或杂芳基独立地选自由以下各者组成的群组：呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、噻唑、咪唑、吡唑、噁二唑、噻二唑、三唑、四唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、苯基、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、四嗪、喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉和萘啶或如下另一个芳基或杂芳基：
其中在(1)中，
A是O、NH或S；B是CH或N，并且C是氢或C1-C8烷基；或
其中在(2)中，
D是任选地经氢或C1-C8烷基取代的N或C；或
其中在(3)中，
E是NH或CH2；F是O或CO；并且G是NH或CH2；或
其中在(4)中，
J是O、S或CO；或
其中在(5)中，
Q是CH或N；
M是CH或N；并且
L/(5)是氢、卤基、氨基、氰基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb或-ORa，
其中任何(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；其中Ra和Rb如上文所定义；或
其中在(6)中，
L/(6)是NH或CH2；或
其中在7中，
M/(7)是氢、卤基、氨基、氰基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb或-ORa，
其中任何(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基或杂环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；其中Ra和Rb如上文所定义；或
其中在(8)中，
P是CH2、NH、O或S；Q/(8)是CH或N；并且n是0-2；或
其中在(9)中，
S/(9)和T/(9)是C，或S/(9)是C并且T/(9)是N，或S/(9)是N并且T/(9)是C；
R是氢、氨基、甲基、三氟甲基或卤基；
U是氢、卤基、氨基、氰基、硝基、三氟甲基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-ORa或4-(1H-吡唑-4-基)，
其中任何(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；其中Ra和Rb如上文所定义。
式(VII)子组B
X和Z独立地选自由以下各者组成的群组：(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-NRaRb和-ORa；
Y是H；
R1是(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基或杂环烷基；
R2是氢、(C1-C3)烷基或卤基，其中所述(C1-C3)烷基任选地经一个到两个选自氨基和(C1-C3)烷基氨基的基团取代；
R7是氢、(C1-C3)烷基或烷氧基；
R3是氢、(C1-C8)烷基或卤基；
R6是氢、卤基、氰基、三氟甲基、氨基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、芳基、杂芳基、酰氨基、(C2-C8)炔基、芳基炔基、杂芳基炔基、-SO2Ra、-SO2NRaRb或-NRaSO2Rb；
其中任何(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)炔基、芳基炔基或杂芳基炔基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：卤基、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基(C1-C4)烷基和杂芳基(C1-C4)烷基；
Ra和Rb各自独立地是氢、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C6-C10)双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中所述(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、环烷基、环烯基、双环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：卤基、羟基、(C1-C4)烷氧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、-CO2H、-CO2(C1-C4)烷基、-CONH2、-CONH(C1-C4)烷基、-CON((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)、-SO2(C1-C4)烷基、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C4)烷基和-SO2N((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地含有选自氧、氮和硫的另外杂原子的5-8元饱和或不饱和环，其中所述环任选地经1、2或3个独立地选自(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤烷基、氨基、(C1-C4)烷基氨基、((C1-C4)烷基)((C1-C4)烷基)氨基、羟基、氧代、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基的基团取代，其中所述环任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环；
或Ra和Rb连同其所连接的氮一起表示任选地稠合到(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环的6到10元桥联双环式环系统。这个定义中的芳基和杂芳基选自由以下组成的群组：呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、噻唑、咪唑、吡唑、噁二唑、噻二唑、三唑、四唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、苯基、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、四嗪、喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉和萘啶或具有如下另一个芳基或杂芳基的化合物：
其中在(1)中，
A是O、NH或S；B是CH或N，并且C是氢或C1-C8烷基；或
其中在(2)中，
D是任选地经氢或C1-C8烷基取代的N或C；或
其中在(3)中，
E是NH或CH2；F是O或CO；并且G是NH或CH2；或
其中在(4)中，
J是O、S或CO；或
其中在(5)中，
Q是CH或N；
M是CH或N；并且
L/(5)是氢、卤基、氨基、氰基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb或-ORa，
其中任何(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb，
其中Ra和Rb如上文所定义；或
其中在(6)中，
L/(6)是NH或CH2；或
其中在(7)中，
M/(7)是氢、卤基、氨基、氰基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb或-ORa，
其中任何(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb；其中Ra和Rb如上文所定义；或
其中在(8)中，
P是CH2、NH、O或S；Q/(8)是CH或N；并且n是0-2；或
其中在(9)中，
S/(9)和T/(9)是C，或S/(9)是C并且T/(9)是N，或S/(9)是N并且T/(9)是C；
R是氢、氨基、甲基、三氟甲基、卤基；
U是氢、卤基、氨基、氰基、硝基、三氟甲基、(C1-C8)烷基、(C3-C8)环烷基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-ORa或4-(1H-吡唑-4-基)，
其中任何(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基任选地经1、2或3个独立地选自以下各者的基团取代：(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(C1-C6)卤烷基、氰基、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、硝基、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra和-OC(O)NRaRb；其中Ra和Rb如上文所定义。
在一些实施例中，EZH2抑制剂是：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施例中，EZH2抑制剂是：
其立体异构体或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
本文中所述的化合物可以根据本领域中已知的任何方法合成。举例来说，具有式(VII)的化合物可以根据在WO2011/140325、WO2011/140324和WO2012/005805中所描述的方法合成，其各自以全文引用的方式并入本文中。
如本文中所用，“烷基”、“C1、C2、C3、C4、C5或C6烷基”或“C1-C6烷基”打算包括C1、C2、C3、C4、C5或C6直链(straightchain/linear)饱和脂肪族烃基团和C3、C4、C5或C6支链饱和脂肪族烃基团。举例来说，C1-C6烷基打算包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基。烷基的实例包括具有一到六个碳原子的部分，例如(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基或正己基。
在某些实施例中，直链或支链烷基具有六个或更少碳原子(例如对于直链是C1-C6，对于支链是C3-C6)，并且在另一实施例中，直链或支链烷基具有四个或更少碳原子。
如本文中所用，术语“环烷基”是指具有3到30个碳原子(例如C3-C10)的饱和或不饱和非芳香族烃单环或多环(例如稠合、桥联或螺环)系统。环烷基的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和金刚烷基。除非另外规定，否则术语“杂环烷基”是指具有一或多个杂原子(例如O、N、S或Se)的饱和或不饱和非芳香族3-8元单环、7-12元双环(稠合、桥联或螺环)、或11-14元三环的环系统(稠合、桥联或螺环)。杂环烷基的实例包括(但不限于)哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、二氧杂环己烷基、四氢呋喃基、异吲哚啉基、吲哚啉基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、三唑啶基、四氢呋喃基、环氧乙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2,3,6-四氢吡啶基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、吡喃基、吗啉基、1,4-二氮杂环庚烷基、1,4-氧氮杂环庚烷基、2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚基、2,6-二氮杂螺[3.3]庚基、1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸基等。
术语“任选经取代的烷基”是指未经取代的烷基或者指定取代基置换烃主链的一或多个碳上的一或多个氢原子的烷基。所述取代基可以包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
“芳基烷基”或“芳烷基”部分是经芳基取代的烷基(例如苯基甲基(苯甲基))。“烷基芳基”部分是经烷基取代的芳基(例如甲基苯基)。
如本文中所用，“烷基连接基团”打算包括C1、C2、C3、C4、C5或C6直链饱和二价脂肪族烃基团和C3、C4、C5或C6支链饱和脂肪族烃基团。举例来说，C1-C6烷基连接基团打算包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基连接基团。烷基连接基团的实例包括具有一到六个碳原子的部分，例如(但不限于)甲基(-CH2-)、乙基(-CH2CH2-)、正丙基(-CH2CH2CH2-)、异丙基(-CHCH3CH2-)、正丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、仲丁基(-CHCH3CH2CH2-)、异丁基(-C(CH3)2CH2-)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、仲戊基(-CHCH3CH2CH2CH2-)或正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)。
“烯基”包括与上文描述的烷基在长度和可能的取代方面类似但含有至少一个双键的不饱和脂肪族基团。举例来说，术语“烯基”包括直链烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基)和支链烯基。在某些实施例中，直链或支链烯基在其主链中具有六个或更少碳原子(例如对于直链是C2-C6，对于支链是C3-C6)。术语“C2-C6”包括含有两到六个碳原子的烯基。术语“C3-C6”包括含有三到六个碳原子的烯基。
术语“任选经取代的烯基”是指未经取代的烯基或指定取代基置换一或多个烃主链碳原子上的一或多个氢原子的烯基。所述取代基可以包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
“炔基”包括与上文描述的烷基在长度和可能的取代方面类似但含有至少一个三键的不饱和脂肪族基团。举例来说，“炔基”包括直链炔基(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基)和支链炔基。在某些实施例中，直链或支链炔基在其主链中具有六个或更少碳原子(例如对于直链是C2-C6，对于支链是C3-C6)。术语“C2-C6”包括含有两到六个碳原子的炔基。术语“C3-C6”包括含有三到六个碳原子的炔基。
术语“任选经取代的炔基”是指未经取代的炔基或指定取代基置换一或多个烃主链碳原子上的一或多个氢原子的炔基。所述取代基可包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
其它任选经取代的部分(例如任选经取代的环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基)包括未经取代的部分和具有一或多个指定取代基的部分两者。举例来说，经取代杂环烷基包括经一或多个烷基取代的杂环烷基，如2,2,6,6-四甲基-哌啶基和2,2,6,6-四甲基-1,2,3,6-四氢吡啶基。
“芳基”包括具有芳香性的基团，包括具有至少一个芳香族环并且在环结构中不含任何杂原子的“共轭”或多环系统。实例包括苯基、苯甲基、1,2,3,4-四氢萘基等。
“杂芳基”是如上定义的芳基，除了在环结构中具有一到四个杂原子，并且也可被称作“芳基杂环”或“杂芳香族基”。如本文中所用，术语“杂芳基”打算包括稳定的5、6或7元单环或7、8、9、10、11或12元双环芳香族杂环，其由碳原子和一或多个独立地选自由氮、氧和硫的群组的杂原子(例如1个或1-2个或1-3个或1-4个或1-5个或1-6个杂原子，或例如1、2、3、4、5或6个杂原子)组成。氮原子可经取代或未经取代(即，N或NR，其中R是H或其它取代基，如所定义)。氮和硫杂原子可任选地为氧化型(即，N→O和S(O)p，其中p＝1或2)。应注意，芳香族杂环中的S和O原子的总数不超过1。
杂芳基的实例包括吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。
此外，术语“芳基”和“杂芳基”包括多环芳基和杂芳基，例如三环、双环，例如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲基二氧基苯基、喹啉、异喹啉、萘啶、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脱氮嘌呤、吲哚嗪。
在多环芳环的情况下，仅需要一个环为芳香族(例如2,3-二氢吲哚)，不过所有环均可为芳香族(例如喹啉)。第二环也可为稠合或桥联的。
环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环可以在一或多个环位置(例如环形成碳或杂原子，例如N)经如上文所述的取代基取代，所述取代基例如为烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷氧基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、烷基氨基羰基、芳烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、烯基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫基羰基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。芳基和杂芳基也可与并非芳香族的脂环族环或杂环稠合或桥联，以便形成多环系统(例如萘满、亚甲基二氧基苯基)。
如本文中所用，“碳环(carbocycle或carbocyclicring)”打算包括具有规定数量的碳的任何稳定的单环、双环或三环，其中的任一者可为饱和、不饱和或芳香族的。碳环包括环烷基和芳基。举例来说，C3-C14碳环打算包括具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的单环、双环或三环。碳环的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基、环庚烯基、环庚基、环庚烯基、金刚烷基、环辛基、环辛烯基、环辛二烯基、芴基、苯基、萘基、茚满基、金刚烷基和四氢萘基。桥联环也包括在碳环的定义中，包括例如[3.3.0]二环辛烷、[4.3.0]二环壬烷、[4.4.0]二环癸烷和[2.2.2]二环辛烷。当一或多个碳原子键联两个非相邻碳原子时产生桥联环。在一个实施例中，桥环是一或两个碳原子。应注意，一个桥总是将单环转变成三环。当环桥联时，为环列举的取代基也可存在于桥上。稠合(例如萘基、四氢萘基)和螺环也包括在内。
如本文中所用，“杂环”或“杂环基”包括含有至少一个环杂原子(例如N、O或S)的任何环结构(饱和、不饱和或芳香族)。杂环包括杂环烷基和杂芳基。杂环的实例包括(但不限于)吗啉、吡咯烷、四氢噻吩、哌啶、哌嗪、氧杂环丁烷、吡喃、四氢吡喃、氮杂环丁烷和四氢呋喃。
杂环的实例包括(但不限于)吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋吖基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑5(4H)-酮、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、啡啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡噁噻基、啡噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑基、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基和呫吨基。
如本文中所用的术语“经取代”意指指定原子上的任何一或多个氢原子经来自指示基团的选择置换，其限制条件是不超出指定原子的正常原子价，且所述取代产生稳定化合物。当取代基是氧代或酮基(即，＝O)时，那么原子上的2个氢原子经置换。酮基取代基不存在于芳香族部分上。如本文所使用，环双键为形成于两个相邻环原子之间的双键(例如C＝C、C＝N或N＝N)。“稳定化合物”或“稳定结构”意欲指示足够稳固以经受住自反应混合物分离得到适用纯度且调配为有效治疗剂的化合物。
当连到取代基的一键显示与连接环中的两个原子的一键交叉时，那么所述取代基可以键结到该环上的任何原子。当所列取代基未指示所述取代基键结到给定式化合物的其余部分的原子时，那么所述取代基可以经由所述式中的任何原子键结。取代基和/或变量的组合是可容许的，只要这样的组合产生稳定化合物即可。
当任何变量(例如R1)在化合物的任何组分或式中出现一次以上时，其在每次出现时的定义与其在所有其它次出现时的定义无关。因此，举例来说，如果基团显示为经0-2个R1部分取代，那么所述基团可任选地经最多两个R1部分取代，并且R1在每次出现时独立地选自R1的定义。此外，取代基和/或变量的组合是可容许的，只要这样的组合产生稳定化合物即可。
术语“羟基(hydroxy或hydroxyl)”包括具有-OH或-O-的基团。
如本文中所用，“卤基”或“卤素”是指氟基、氯基、溴基以及碘基。术语“全卤化”通常是指其中所有氢原子均经卤素原子置换的部分。术语“卤烷基”或“卤烷氧基”是指经一或多个卤素原子取代的烷基或烷氧基。
术语“羰基”包括含有以双键连接到氧原子的碳的化合物和部分。部分的实例含有羰基，包括(但不限于)醛、酮、羧酸、酰胺、酯、酸酐等。
术语“羧基”是指-COOH或其C1-C6烷基酯。
“酰基”包括含有酰基(R-C(O)-)或羰基的部分。“经取代酰基”包括其中一或多个氢原子经例如以下各者置换的酰基：烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
“芳酰基”包括芳基或杂芳香族部分结合于羰基的部分。芳酰基的实例包括苯基羧基、萘基羧基等。
“烷氧基烷基”、“烷基氨基烷基”和“硫基烷氧基烷基”包括如上文所述的烷基，其中氧、氮或硫原子置换一或多个烃主链碳原子。
术语“烷氧基(alkoxy或alkoxyl)”包括与氧原子共价键联的经取代和未经取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。经取代烷氧基的实例包括卤化烷氧基。烷氧基可以经例如以下各者的基团取代：烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基、亚膦酸基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。卤素取代的烷氧基的实例包括(但不限于)氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基和三氯甲氧基。
术语“醚”或“烷氧基”包括含有键结到两个碳原子或杂原子的氧的化合物或部分。举例来说，所述术语包括“烷氧基烷基”，其是指共价键结到已共价键结到烷基的氧原子的烷基、烯基或炔基。
术语“酯”包括含有结合于已键结到羰基的碳的碳或杂原子的化合物或部分。术语“酯”包括烷氧基羧基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基等。
术语“硫代烷基”包括含有与硫原子连接的烷基的化合物或部分。硫代烷基可以经例如以下各者的基团取代：烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、羧酸、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
术语“硫羰基”或“硫羧基”包括含有以双键连接到硫原子的碳的化合物和部分。
术语“硫醚”包括含有键结到两个碳原子或杂原子的硫原子的部分。硫醚的实例包括(但不限于)烷硫基烷基、烷硫基烯基和烷硫基炔基。术语“烷硫基烷基”包括烷基、烯基或炔基键结到已键结到烷基的硫原子的部分。类似地，术语“烷硫基烯基”是指烷基、烯基或炔基键结到已共价键结到烯基的硫原子的部分；且“烷硫基炔基”是指烷基、烯基或炔基键结到已共价键结到炔基的硫原子的部分。
如本文中所用，“胺”或“氨基”是指未经取代或经取代的-NH2。“烷基氨基”包括其中-NH2的氮结合于至少一个烷基的化合物的基团。烷基氨基的实例包括苯甲基氨基、甲基氨基、乙基氨基、苯乙基氨基等。“二烷基氨基”包括-NH2的氮结合于至少两个额外烷基的基团。二烷基氨基的实例包括(但不限于)二甲基氨基和二乙基氨基。“芳基氨基”和“二芳基氨基”包括氮分别结合于至少一个或两个芳基的基团。“氨基芳基”和“氨基芳氧基”是指经氨基取代的芳基和芳氧基。“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”和“芳基氨基烷基”是指结合于至少一个烷基和至少一个芳基的氨基。“烷氨基烷基”是指结合于也已结合于烷基的氮原子的烷基、烯基或炔基。“酰基氨基”包括氮结合于酰基的基团。酰基氨基的实例包括(但不限于)烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
术语“酰胺”或“氨基羧基”包括含有结合于羰基或硫羰基的碳的氮原子的化合物或部分。所述术语包括“烷氨基羧基”，其包括结合于已结合于羰基或硫羰基的碳的氨基的烷基、烯基或炔基。其还包括“芳基氨基羧基”，其包括结合于已结合于羰基或硫羰基的碳的氨基的芳基或杂芳基部分。术语“烷基氨基羧基”、“烯基氨基羧基”、“炔基氨基羧基”和“芳基氨基羧基”包括烷基、烯基、炔基和芳基部分分别结合于又结合于羰基的碳的氮原子的部分。酰胺可经如直链烷基、支链烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环的取代基取代。酰胺基团上的取代基可经进一步取代。
在本说明书中，化合物的结构式在一些情况下为了方便起见表示某种异构体，但是本发明包括所有异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体等，应了解不是所有的异构体都可以具有相同的活性水平。另外，由所述式表示的化合物可能存在晶体的多晶型现象。应注意，在本发明的范围中包括任何晶体形式、晶体形式混合物或其酸酐或水合物。此外，在本发明范围中包括所谓的由本发明化合物体内降解产生的代谢物。
“异构现象”意指化合物具有相同的分子式，但是其原子的键结顺序或其原子在空间的排列不同。其原子在空间的排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不成镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，并且彼此是非可重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”或有时称为光学异构体。含有等量单独的具有相反手性的对映异构形式的混合物称为“外消旋混合物”。
键结到四个不全同的取代基的碳原子称为“手性中心”。
“手性异构体”意指具有至少一个手性中心的化合物。具有一个以上手性中心的化合物可能以个别非对映异构体形式或以称为“非对映异构体混合物”的非对映异构体的混合物形式存在。当存在一个手性中心时，立体异构体的特征可在于手性中心的绝对构型(R或S)。绝对构型是指连接于手性中心的取代基在空间中的安排。连接于考虑中的手性中心的取代基根据卡恩(Cahn)、英格尔(Ingold)和普雷洛格(Prelog)的顺序规则(SequenceRule)排位。(卡恩等人,《应用化学国际版》(Angew.Chem.Inter.Edit.)1966,5,385；勘误表511；卡恩等人,《应用化学》(Angew.Chem.)1966,78,413；卡恩和英戈尔德,《化学协会会刊》(J.Chem.Soc.)1951(伦敦),612；卡恩等人,《实验》(Experientia)1956,12,81；卡恩,《化学教育杂志》(J.Chem.Educ.)1964,41,116)。
“几何异构物”意指其存在归因于围绕双键或环烷基连接基团(例如，1,3-环丁基)的旋转受阻的非对映异构体。这些构型通过前缀顺式和反式或Z和E在其名称中加以区分，所述前缀表示根据卡恩-英格尔-普雷洛格规则(Cahn-Ingold-Prelogrule)，在分子中，基团是在双键的同一侧或相对侧上。
应了解，本发明化合物可以描绘为不同的手性异构体或几何异构体。还应了解，当化合物具有手性异构或几何异构形式时，打算在本发明的范围中包括所有异构形式，并且化合物的命名并不排除任何异构形式，应了解不是所有的立体异构体都可以具有相同的活性水平。
此外，本发明中所讨论的结构和其它化合物包括其所有阻转异构体，应了解不是所有的阻转异构体都可以具有相同的活性水平。“阻转异构体”是其中两个异构体的原子在空间中以不同方式排列的一类立体异构体。阻转异构体将其存在归因于由大基团围绕中心键的旋转位阻引起的旋转限制。这些阻转异构体通常以混合物形式存在，然而作为色谱技术方面的最新进展的结果，已经有可能在精选的情况下分离两种阻转异构体的混合物。
“互变异构体”是平衡地存在并且容易从一种异构形式转化成另一种的两个或更多个结构异构体中的一个。这种转化引起氢原子的缩甲醛式迁移，伴随着相邻共轭双键的转换。互变异构体以一组互变异构体的混合物形式存在于溶液中。在其中可能互变异构化的溶液中，将达到互变异构体的化学平衡。互变异构体的精确比率取决于若干种因素，包括温度、溶剂和pH。可通过互变异构化互相转化的互变异构体的概念称作互变异构现象。
在不同类型的可能的互变异构现象中，一般观察到两个。在酮基-烯醇互变异构现象中，发生电子和氢原子的同时转移。环-链互变异构现象出现的原因是糖链分子中的醛基(-CHO)与同一分子中的一个羟基(-OH)反应，从而赋予它如通过葡萄糖所展现的环状(环形)形式。
常见的互变异构对是：酮-烯醇、酰胺-腈、内酰胺-内酰亚胺、杂环(例如，在核碱基中，例如鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)中的酰胺-亚胺酸互变异构现象、亚胺-烯胺以及烯胺-烯胺。酮基-烯醇平衡的实例是在吡啶-2(1H)-酮与对应的吡啶-2-醇之间，如下所示。
应了解，本发明化合物可以描绘为不同的互变异构体。还应了解，当化合物具有互变异构形式时，打算在本发明的范围中包括所有互变异构形式，并且化合物的命名不排除任何互变异构体形式。应了解，某些互变异构体的活性水平可以高于其它的。
术语“晶体多晶型物”、“多晶型物”或“晶体形式”意指其中化合物(或其盐或溶剂合物)可以按不同的晶体堆积排列结晶的晶体结构，所有这些晶体堆积排列都具有相同的元素组成。不同的晶体形式通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学特性、稳定性以及溶解性。再结晶溶剂、结晶速率、储存温度和其它因素可以使一种晶体形式占主导地位。化合物的结晶多晶型物可以通过在不同条件下结晶来制备。
适当时，具有本文中所公开的式中的任一个的化合物包括化合物本身以及其盐或其溶剂合物。举例来说，可以在阴离子与经芳基或杂芳基取代的苯化合物上的带正电基团(例如，氨基)之间形成盐。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硫酸氢根、氨基磺酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲烷磺酸根、三氟乙酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、戊二酸根、苹果酸根、顺丁烯二酸根、丁二酸根、反丁烯二酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、水杨酸根、乳酸根、萘磺酸根以及乙酸根(例如，三氟乙酸根)。术语“医药学上可接受的阴离子”是指适用于形成医药学上可接受的盐的阴离子。类似地，还可以在阳离子与经芳基或杂芳基取代的苯化合物上的带负电基团(例如，羧酸根)之间形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子以及铵阳离子，例如四甲铵离子。经芳基或杂芳基取代的苯化合物还包括含有季氮原子的那些盐。
另外，本发明化合物(例如，所述化合物的盐)能够以水合或未水合(无水)形式或以与其它溶剂分子的溶剂合物形式存在。水合物的非限制性实例包括一水合物、二水合物等。溶剂合物的非限制性实例包括乙醇溶剂合物、丙酮溶剂合物等。
“溶剂合物”意指含有化学计算量或非化学计算量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物具有截留固定摩尔比的呈结晶固体状态的溶剂分子，由此形成溶剂合物的倾向。如果溶剂是水，那么所形成的溶剂合物是水合物；并且如果溶剂是醇，那么所形成的溶剂合物是醇化物。水合物通过一或多个水分子与一个物质分子的组合形成，其中水保持其分子状态为H2O。
如本文中所用，术语“类似物”是指在结构上类似于另一种化合物但组成略有不同(如一个原子被不同元素的原子置换或存在特定官能团，或一个官能团被另一个官能团置换)的化合物。因此，类似物是在功能和外观上与参比化合物类似或相当，但是在结构或来源上不类似或相当的化合物。
如本文中所定义，术语“衍生物”是指具有共同核心结构，并且经如本文中所述的各种基团取代的化合物。举例来说，由式(I)表示的所有化合物都是经芳基或杂芳基取代的苯化合物，并且具有式(I)作为共同核心。
术语“生物电子等排体”是指由一个原子或一组原子与另一个或另一组大致类似的原子交换产生的化合物。生物电子等排取代的目的是产生与母体化合物具有类似生物特性的新化合物。生物电子等排取代可以基于物理化学或拓扑学。羧酸生物电子等排体的实例包括(但不限于)酰基磺酰亚胺、四唑、磺酸盐以及膦酸盐。参看例如帕塔尼(Patani)和拉沃伊(LaVoie),《化学评论》(Chem.Rev.)96,3147-3176,1996。
本发明打算包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数但不同质量数的那些原子。通过一般实例来举例说明并且不限于这些实例，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括C-13和C-14。
本发明提供用于合成具有本文中所公开的任何式的化合物的方法。本发明还提供了用于根据如实例中所示的以下方案合成本发明的各种公开化合物的详细方法。
在整个说明中，当将组合物描述为具有、包括或包含特定组分时，预期组合物还主要由所述组分组成或由所述组分组成。类似地，当将方法或工艺描述为具有、包括或包含特定工艺步骤时，所述工艺还主要由所述工艺步骤组成或由所述工艺步骤组成。此外应了解，步骤顺序或用于执行某些动作的顺序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。此外，可以同时执行两个或更多个步骤或动作。
本发明的合成工艺可以耐受各种官能团，因此可以使用各种经取代的起始物质。所述工艺通常在整个工艺结束时或接近结束时提供所要的最终化合物，但是在某些情况下可能需要将所述化合物进一步转化成其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物。
本发明化合物可以通过采用本领域的技术人员已知或根据本文中的教示熟练的业内人士将清楚的标准合成方法和程序，使用可商购的起始物质、文献中已知的化合物，或从容易制备的中间物以多种方式制备。用于制备有机分子和官能团转换与操控的标准合成方法和程序可以从相关科学文献或从本领域中的标准教科书获得。虽然不限于任何一个或若干个来源，但是经典文本是本领域的普通技术人员已知的有机合成的有用并且公认的参考教科书，所述经典文本例如史密斯M.B.(Smith,M.B.),马彻J.(March,J.),《马彻的高等有机化学：反应、机制和结构》(March'sAdvancedOrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,andStructure),第5版,约翰·威利父子公司(JohnWiley&Sons)：纽约,2001；格林T.W.(Greene,T.W.),伍兹P.G.M.(Wuts,P.G.M.),《有机合成中的保护基》(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis),第3版,约翰·威利父子公司：纽约,1999；R.拉罗克(R.Larock),《综合有机转化》(ComprehensiveOrganicTransformations),VCH出版社(1989)；L.费舍尔(L.Fieser)和M.费舍尔(M.Fieser),《费舍尔和费舍尔的有机合成试剂》(FieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis),约翰·威利父子公司(1994)；以及L.帕克特(L.Paquette)编,《有机合成试剂丛书》(EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis),约翰·威利父子公司(1995)，以引用的方式并入本文中。合成方法的以下描述被设计成用于说明(但不限制)用于制备本发明化合物的通用程序。
本发明化合物可以便利地通过本领域的技术人员熟悉的各种方法制备。具有本文中所公开的任何式的本发明化合物可以根据以下方案1-10中所展示的程序，从可商购的起始物质或可以使用文献程序制备的起始物质来制备。除非另外说明，否则方案1-10中的Z和R基团(例如R2、R3、R4、R6、R7、R8和R12)如本文中所公开的式中的任一个中所定义。
本领域的普通技术人员应注意，在本文中所述的反应顺序和合成方案期间，某些步骤顺序可以改变，例如保护基的引入和去除。
本领域的普通技术人员将认识到，某些基团可能需要通过使用保护基来保护不受反应条件影响。也可以使用保护基来区分在分子中的类似官能团。保护基清单以及如何引入和去除这些基团可见于格林T.W.,伍兹P.G.M.,《有机合成中的保护基》,第3版,约翰·威利父子公司：纽约,1999中。
优选的保护基包括(但不限于)：
针对羟基部分：TBS、苯甲基、THP、Ac
针对羧酸：苯甲酯、甲酯、乙酯、烯丙酯
针对胺：Cbz、BOC、DMB
针对二醇：Ac(x2)TBS(x2)或当连在一起时，丙酮化合物
针对硫醇：Ac
针对苯并咪唑：SEM、苯甲基、PMB、DMB
针对醛：二-烷基缩醛，例如二甲氧基缩醛或二乙基乙酰基。
在本文中所述的反应方案中，会产生多种立体异构体。当没有指明具体立体异构体时，应了解意指可能从所述反应产生的所有可能的立体异构体。本领域的普通技术人员将认识到，可以优化反应以优先得到一种异构体，或可以设计新方案来产生单一异构体。如果产生混合物，那么可以使用例如制备型薄层色谱、制备型HPLC、制备型手性HPLC或制备型SFC的技术来分离异构体。
以下缩写用于整篇说明书中并且定义如下：
Ac乙酰基
AcOH乙酸
aq.水溶液
BID或b.i.d.一日两次(一天两次)
BOC叔丁氧羰基
Cbz苯甲氧羰基
CDCl3氘化氯仿
CH2Cl2二氯甲烷
DCM二氯甲烷
DMB2,4-二甲氧基苯甲基
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DMSO二甲亚砜
EA或EtOAc乙酸乙酯
EDC或EDCIN-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺
ESI-电喷雾负离子模式
ESI+电喷雾正离子模式
EtOH乙醇
h小时
H2O水
HOBt1-羟基苯并三唑
HCl氯化氢或盐酸
HPLC高效液相色谱
K2CO3碳酸钾
LC/MS或LC-MS液相色谱-质谱
M摩尔
MeCN乙腈
min分钟
Na2CO3碳酸钠
Na2SO4硫酸钠
NaHCO3碳酸氢钠
NaHMD六甲基二硅基氨基钠
NaOH氢氧化钠
NaHCO3碳酸氢钠
Na2SO4硫酸钠
NMR核磁共振
Pd(OH)2二氢氧化钯
PMB对甲氧基苯甲基
p.o.口服(经口投药)
ppm百万分之一
制备型HPLC制备型高效液相色谱
PYBOP(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
Rt或RT室温
TBME叔丁基甲基醚
TFA三氟乙酸
THF四氢呋喃
THP四氢吡喃
本发明还提供医药组合物，其包含具有本文中所公开的任何式的化合物以及至少一种医药学上可接受的赋形剂或载剂。
“医药组合物”是含有本发明化合物的呈适用于向受试者投与的形式的调配物。在一个实施例中，医药组合物呈散装形式或单位剂型。单位剂型是各种形式中的任一种，包括例如胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单个泵或小瓶。单位剂量组合物中的活性成分(例如，所公开的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或异构体的调配物)的数量是有效量并且根据所涉及的具体治疗而改变。本领域技术人员应了解，有时需要取决于患者的年龄和病况对剂量做出例行改变。剂量还将取决于投药途径。涵盖了各种途径，包括经口、经肺、经直肠、肠胃外、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、吸入、经颊、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等等。用于局部或经皮投与本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片以及吸入剂。在一个实施例中，在无菌条件下混合活性化合物与医药学上可接受的载剂和所需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂。
如本文中所用，短语“医药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相匹配的那些化合物、阴离子、阳离子、材料、组合物、载剂和/或剂型。
“医药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备通常安全无毒并且在生物学上和其它方面均合乎需要的医药组合物的赋形剂，并且包括对于兽用以及对于人类药物使用可接受的赋形剂。如说明书和权利要求书中所使用的“医药学上可接受的赋形剂”包括一种和超过一种此类赋形剂。
本发明医药组合物可以被调配为与其预期投与途径相容。投与途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)以及经粘膜投与。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的药剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整，例如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本发明的化合物或医药组合物可以按目前用于化学疗法治疗的许多众所周知的方法向受试者投与。举例来说，对于癌症的治疗，本发明化合物可以直接注射到肿瘤中、注射到血流或体腔中或口服或用贴片经由皮肤施用。所选择的剂量应足以构成有效治疗但尚未高到产生不可接受的副作用。应该优选地在治疗期间和在治疗之后的合理时间段密切监控疾病病况(例如，癌症、初癌等)的状态和患者的健康。
如本文中所用的术语“治疗有效量”是指用于治疗、改善或预防所鉴别的疾病或病况或用于展现可检测的治疗性或抑制性作用的药剂的量。所述作用可以通过本领域中已知的任何分析方法检测。受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、身材和健康；病况的性质和程度；以及所选择用于投与的疗法或疗法组合。针对指定情况的治疗有效量可以通过在临床医师的技能和判断内的常规实验来测定。在一个优选方面，有待治疗的疾病或病况是癌症。在另一方面，有待治疗的疾病或病况是细胞增殖病症。
对于任何化合物，治疗有效量都可以最初在例如赘生性细胞的细胞培养分析中或在动物模型(通常是大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中估算。动物模型还可以用于测定投药的适当浓度范围和途径。这类信息随后可以用于确定在人体中投与的有用剂量和途径。治疗性/预防性功效和毒性可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如ED50(可在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(使50％的群体致死的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的医药组合物是优选的。所述剂量可以取决于所采用的剂型、患者的敏感性以及投药途径而在此范围内变化。
调整剂量和投与以提供充足量的活性剂或维持所要效果。可以考虑的因素包括疾病病况的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、投药时间和频率、药物组合、反应灵敏度以及对疗法的耐受性/反应。取决于具体调配物的半衰期和清除率，长效医药组合物可以每3到4天、每周或每两周一次投与。
含有本发明活性化合物的医药组合物可以按一般已知的例如借助于常规的混合、溶解、粒化、制糖衣药丸、水磨、乳化、封装、包覆或冻干工艺的方式来制造。医药组合物可以按常规方式使用一或多种医药学上可接受的载剂(包含赋形剂和/或助剂)来调配，所述载剂促使将活性化合物加工成可以在医药学上使用的制剂。当然，恰当调配物取决于所选择的投药途径。
适用于可注射使用的医药组合物包括用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和无菌粉末。关于静脉内投药，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(新泽西州派西派尼的巴斯夫(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是达到存在容易可注射性的程度的流体。它在制造和储存条件下必须稳定并且必须抗微生物(例如细菌和真菌)的污染活动地加以保存。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度和/或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物活动的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)以及氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现。
无菌可注射溶液可以通过如下制备：视需要将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种或组合并入适当溶剂中，接着过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生了活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所希望的成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的医药学上可接受的载剂。它们可以被密封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。为了经口治疗性投药，活性化合物可以与赋形剂一起并入并且以片剂、糖衣片或胶囊形式使用。口服组合物还可以使用适用作漱口水的流体载剂制备，其中在流体载剂中的化合物经口施用并且漱口并吐掉或吞咽。可以包括医药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣片等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、普利莫吉尔(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或斯特罗特斯(Sterotes)；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
关于通过吸入投药，所述化合物以气雾剂喷雾形式从含有合适的推进剂(例如气体，例如二氧化碳)或喷雾器的加压容器或分配器传递。
还可以通过经粘膜或经皮手段全身性投药。关于经粘膜或经皮投药，在调配物中使用适于渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域中已知的，并且例如对于经粘膜投药，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜投药可以通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。如一般在本领域中已知的，对于经皮投药，活性化合物被调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏。
活性化合物可以与医药学上可接受的载剂一起制备，所述载剂将保护化合物免于从体内快速消除，例如控制释放调配物，包括植入剂和微封装的传递系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这类调配物的方法将为本领域的技术人员所清楚。所述物质还可以从阿尔扎公司(AlzaCorporation)和诺瓦药物公司(NovaPharmaceuticals,Inc.)商购获得。还可以使用脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)作为医药学上可接受的载剂。这些物质可以根据本领域的技术人员已知的方法制备，例如如美国专利第4,522,811号中所描述。
尤其有利的是以便于投药和剂量均匀性的单位剂型调配经口或肠胃外组合物。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合，经计算以产生所希望的治疗效果的预定数量的活性化合物。关于本发明单位剂型的规格由活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果指定并且直接取决于这些。
在治疗性应用中，根据本发明使用的医药组合物的剂量取决于药剂、接受者患者的年龄、体重和临床病况以及投与疗法的临床医师或从业者的经验和判断以及影响要选择的剂量的其它因素而变化。一般来讲，所述剂量应该足以减缓并且优选地消退肿瘤生长，并且还优选地促成癌症的完全消退。剂量可以在约0.01mg/kg/天到约5000mg/kg/天的范围内变化。在优选方面，剂量可以在约1mg/kg/天到约1000mg/kg/天的范围内变化。在一个方面中，所述剂量将在以下范围内：约0.1mg/天到约50g/天；约0.1mg/天到约25g/天；约0.1mg/天到约10g/天；约0.1mg到约3g/天；或约0.1mg到约1g/天，呈单一、分次或连续剂量形式(所述剂量可以针对患者的体重(以kg计)、体表面积(以m2计)以及年龄(以年计)加以调整)。药剂的有效量是提供如由临床医师或其它具备资格的观察者所指出的客观地可鉴别的改善的量。举例来说，患者中肿瘤的消退可以参照肿瘤的直径来测量。肿瘤直径减小表示消退。在治疗已经停止之后，肿瘤复发失败也表示消退。如本文中所用，术语“剂量有效方式”是指用于在受试者或细胞中产生所希望的生物作用的活性化合物的量。
医药组合物可以连同投药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明化合物能够进一步形成盐。所有这些形式也都被涵盖在所要求的发明的范围内。
如本文中所用，“医药学上可接受的盐”是指本发明化合物的衍生物，其中母体化合物通过制造其酸或碱盐加以改性。医药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属或有机盐等等。医药学上可接受的盐包括从例如无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐或季铵盐。举例来说，这类常规无毒盐包括(但不限于)从无机和有机酸衍生的那些，所述酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙烷磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸(edeticacid)、乙烷二磺酸、1,2-乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、对氨苯基胂酸、己基间苯二酚酸、海巴胺酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基顺丁烯二酸、羟基萘甲酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、顺丁烯二酸、苹果酸、杏仁酸、甲烷磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、丁二酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、鞣酸、酒石酸、甲苯磺酸以及常见氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。
医药学上可接受的盐的其它实例包括己酸、环戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、黏康酸等。本发明还涵盖当母体化合物中所存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等)配位时所形成的盐。在盐形式中，应了解盐的所述化合物比阳离子或阴离子的比率可以是1:1，或除1:1以外的任何比率，例如3:1、2:1、1:2或1:3。
应了解，所有提到的医药学上可接受的盐包括同一种盐的如本文中所定义的溶剂加成形式(溶剂合物)或晶体形式(多晶型物)。
经口、经鼻、经皮、经肺、吸入法、经颊、舌下、腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内、经直肠、胸膜内、鞘内和肠胃外投与所述化合物或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。在一个实施例中，经口投与所述化合物。本领域技术人员将认识到某些投药途径的优势。
经口、经鼻、经皮、经肺、吸入、经颊、舌下、腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内、经直肠、胸膜内、鞘内以及肠胃外投与所述化合物或其医药学上可接受的盐或溶剂。在一个实施例中，经口投与所述化合物。本领域技术人员将认识到某些投药途径的优势。
根据各种因素选择利用所述化合物的给药方案，所述因素包括患者的类型、种属、年龄、体重、性别和医学病况；有待治疗的病况的严重程度；投药途径；患者的肾脏和肝脏功能；以及所采用的具体化合物或其盐。一般熟练的医师或兽医可以容易地确定并规定用于预防、对抗或阻止病况进展所需的药物的有效量。
所公开的本发明化合物的调配和投与技术可见于《雷明顿：药物科学和实践》(Remington:theScienceandPracticeofPharmacy),第19版,马克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)中。在一个实施例中，本文中所述的化合物和其医药学上可接受的盐以与医药学上可接受的载剂或稀释剂组合的药物制剂形式使用。合适的医药学上可接受的载剂包括惰性固体填充剂或稀释剂以及无菌水溶液或有机溶液。所述化合物将以足以提供在本文中所述的范围内的所希望的剂量的量存在于这类医药组合物中。
除非另外指明，否则本文中所用的所有百分比和比率都按重量计。本发明的其它特征和优点从不同实例是显而易见的。所提供的实例说明了适用于实践本发明的不同组分和方法。所述实例不限制所要求的发明。基于本发明，熟练的业内人士可以鉴别并且采用适用于实践本发明的其它组分和方法。
在本文中所述的合成方案中，为简单起见，化合物可用一种特定构型绘制。这类特定构型不应理解为将本发明限制在一种或另一种异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体，它也不排除异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体的混合物；然而应了解，指定异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体的活性水平可以高于另一种异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体。
通过上文所述的方法设计、选择和/或优化的化合物一旦产生，就可以使用本领域的技术人员已知用于测定化合物是否具有生物活性的各种分析来表征。举例来说，可以通过常规分析来表征分子，所述分析包括(但不限于)如下所述用于测定它们是否具有所预测的活性、结合活性和/或结合特异性的那些分析。
此外，可以使用高通量筛选来加速使用这类分析进行的分析。因此，可能可以使用本领域中已知的技术针对活性快速地筛选本文中所述的分子。用于执行高通量筛选的通用方法描述在例如德弗林(Devlin)(1998)《高通量筛选》(HighThroughputScreening),马塞尔·德克(MarcelDekker)；和美国专利第5,763,263号中。高通量分析可以使用一或多种不同的分析技术，包括(但不限于)如下所述的那些。
必要时，本发明EZH2抑制剂可以存在于试剂盒(例如，包装或分配器装置)中，所述试剂盒可以含有一或多种含有EZH2抑制剂的单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有投药说明书。还可以制备包含本发明EZH2抑制剂的在相容的药物载剂中调配的组合物，将其放在恰当容器中，并且经标记用于治疗指定病况。还可以提供使用说明书。
本文中还提供了试剂盒，其包含检测甲基化H3-K27的多种甲基化检测试剂。举例来说，所述试剂盒包括单甲基化H3-K27、二甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27检测试剂。所述检测试剂是例如抗体或其片段、多肽或适体。
试剂盒还可以包括用于检测SWI/SNF复合物的至少一种组分的功能缺失的试剂，例如通过具有同源核酸序列(例如与突变型组分核酸序列的一部分互补的寡核苷酸序列)特异性地鉴别突变型组分核酸序列的核酸，或由以试剂盒形式包装在一起的野生型和/或突变型组分核酸编码的蛋白质的抗体。寡核苷酸可以是组分基因的片段。举例来说，寡核苷酸的长度可以是200、150、100、50、25、10个或更少核苷酸。所述试剂盒可以在分开的容器中尤其含有适体或抗体、对照调配物(阳性和/或阴性)和/或可检测标签，例如荧光素、绿色荧光蛋白、若丹明(rhodamine)、花青染料、阿莱克萨染料(Alexadye)、荧光素酶、放射性标签。另外，可以在试剂盒中包括用于检测SWI/SNF复合物的生物活性(例如其染色质重塑活性)的试剂。
可以在试剂盒中包括用于执行分析的说明书(例如，书面的、磁带、VCR、CD-ROM等)。所述分析可以例如采用如本领域中已知的蛋白质印迹分析、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光法(IF)、测序和质谱(MS)形式。
实例1：通过抑制EZH2，在遗传改变的淋巴瘤和恶性横纹肌样肿瘤中持久的肿瘤消退
化合物A是EZH2的强效并且选择性抑制剂：无细胞生物化学分析包括放射性标记的SAM和对应于H3K27的鸡红细胞寡核小体或肽作为底物，显示出化合物A选择性地抑制含有野生型EZH2的人类PRC2的活性，其中抑制常数(Ki)值是2.5±0.5nmol/L并且IC50值是11±5nM(核小体分析)或16±12nM(肽分析)。人类和大鼠EZH2酶以及携有所有已知淋巴瘤功能变化突变的EZH2蛋白质的IC50值是类似的。化合物A的IC50值随着SAM的浓度增加而增加，但是随着寡核小体的量增加，最低限度地受到影响，这点符合SAM竞争性和核小体非竞争性抑制模式。为了证明HMT选择性，评定化合物A对除EZH2以外的一组HMT的抑制，所述HMT涵盖赖氨酸和精氨酸HMT两者。化合物A展示出针对EZH1的35倍选择性和相对于所测试的14种其它HMT的超过4500倍的选择性。
化合物A特异性地抑制细胞中的细胞H3K27甲基化：当WSU-DLCL2EZH2Y641F突变型淋巴瘤细胞与化合物A一起孵育4天时，观察到全基因组H3K27Me3水平的浓度依赖性降低，其中平均IC50值是0.26μM(H3K27Me3水平通过ELISA测定)。当研究甲基化抑制的动力学时，H3K27Me3的半衰期是约1天，因为仅在孵育3到4天之后获得90％抑制。当OCI-LY19EZH2野生型淋巴瘤细胞与2.7μM化合物A一起孵育4天时，受影响的甲基标志仅仅是H3K27Me1、H3K27Me2和H3K27Me3，PRC2催化剂的三种已知产物。与化合物A一起孵育还引起H3K27乙酰化增加。在若干其它人类淋巴瘤细胞系中进一步测试化合物A降低全基因组H3K27三甲基化水平的能力，所述细胞系包括表达野生型或突变型EZH2的系。化合物A在所有细胞系中以类似效能降低H3K27Me3，与EZH2状态无关(表1)。
化合物A促成携有EZH2点突变的淋巴瘤细胞系的选择性杀伤：在6天增殖分析中，WSU-DLCL2EZH2Y641F突变型细胞与化合物A一起孵育产生抗增殖作用，其中平均IC50值是0.28±0.14μM。在11天的持续时间内进一步测试化合物A对活细胞数量的影响的动力学。在WSU-DLCL2细胞已经暴露于化合物中超过4天之后，化合物A的抗增殖作用显而易见，符合化合物A介导的细胞H3K27甲基化抑制的动力学。当与用6天增殖分析所获得的结果相比时，在11天分析中WSU-DLCL2细胞增殖的化合物A抑制的IC50值(0.0086μM，表1)更低，表明敏感性随着孵育期延长而增加。相比于WSU-DLCL2细胞，OCI-LY19人类淋巴瘤细胞(关于残基Y641，EZH2野生型)在11天内的生长不受显著影响，但针对两个细胞系的H3K27Me3抑制的IC50值相当(表1)。为了鉴别细胞停止增殖时的浓度，考虑11天的完整孵育期，计算特定细胞系的最低细胞毒性浓度(LCC)。当与EZH2野生型OCI-LY19细胞相比时，WSU-DLCL2EZH2Y641F突变型人类淋巴瘤细胞的LCC值显著更低(表1)。这种背景特异性细胞杀伤得到来自一组延伸的淋巴瘤细胞系的11天增殖分析的结果的进一步支持。当与具有野生型EZH2的细胞系相比时，除了RL细胞系(EZH2Y641N)之外的具有EZH2突变的所有细胞系对化合物A的抗增殖作用更敏感(表1)。如分别通过IC50值和LCC所测量，Pfeiffer细胞系(EZH2A677G)显示对化合物A的敏感性比Y641突变型细胞系增加20到300倍。接着通过清除实验来研究持久细胞杀伤所需的化合物暴露的最小时间。与化合物A一起孵育7天(接着是化合物清除7天)或连续14天的WSU-DLCL2细胞在第11天或第14天的LCC值是类似的(表2)。然而，药物暴露仅4天不足以诱导类似于连续孵育的LCC值。
化合物A在EZH2突变型淋巴瘤细胞中诱导G1阻滞和细胞凋亡：接着，评定与化合物A(1μM)一起孵育7天对WSU-DLCL2细胞中的细胞周期进程和细胞凋亡的影响。在化合物A孵育2天之后，G1期细胞的百分比增加和S期与G2/M期细胞的百分比减少是显而易见的。在4天之后实现最大作用。亚G1分数无明显增加，表明化合物A孵育7天未诱导出细胞凋亡。这一点与WSU-DLCL2细胞在存在化合物A的情况下的生长曲线一致，说明只有在孵育7天之后才观察到细胞毒性作用。在与化合物A一起孵育WSU-DLCL2细胞长达14天之后，在第14天，通过TUNEL分析测定的凋亡细胞的分数相比于媒剂显著增加，说明通过诱导细胞凋亡发生了化合物A介导的细胞死亡。
在小鼠EZH2突变型异种移植模型中，经口投与化合物A引起EZH2目标抑制：在携有EZH2突变型淋巴瘤异种移植物的小鼠中研究经口给予化合物A对全身性化合物暴露和体内目标抑制的影响。首先，向皮下植入了WSU-DLCL2异种移植物的SCID小鼠经口给予化合物A，持续4或7天。在最后一次给药之前5分钟或之后3小时测量化合物A血浆水平，揭示暴露量的明显剂量依赖性增加。只有以160mg/kgTID或213mg/kgBID给药的动物在整个给药周期(1652ng/mL，考虑小鼠血浆蛋白结合)中针对WSU-DLCL2细胞维持血浆中的平均化合物水平在LCC以上。在最后一次给药之后3小时收集的肿瘤的匀浆的化合物测定结果揭示，只有最高剂量组在2个区室中的化合物水平是类似的。当分析肿瘤中的H3K27Me3水平时，观察到剂量依赖性EZH2目标抑制。来自以213mg/kgQD给药的小鼠的肿瘤中的H3K27Me3抑制更小，表明为了最佳目标抑制，需要在整个给药周期中维持血浆浓度在LCC以上。以160mg/kgTID给药4天引起的目标抑制比以相同剂量和时程给药7天略低，说明延长给药增加了WSU-DLCL2肿瘤中的目标抑制程度。在皮下植入了KARAPS-422异种移植物的裸小鼠中执行类似的7天研究，评定BID和QD时程。在两个方案下，化合物A均诱导肿瘤H3K27Me3水平的剂量依赖性降低。
化合物A在若干EZH2突变型淋巴瘤异种移植物中诱导显著抗肿瘤作用：当用化合物A处理携有WSU-DLCL2EZH2Y641F突变型异种移植肿瘤的SCID小鼠28天时，观察到剂量依赖性肿瘤生长抑制，在最高剂量150mg/kgTID下抑制58％。只有投与了最高剂量的动物在整个给药周期中针对WSU-DLCL2细胞维持平均化合物A血浆水平在LCC以上。相比于7天给药所观察到的，给予化合物A28天引起在肿瘤组织中相比于血浆中的相对化合物累积。来自在第28天收集的肿瘤的组蛋白的ELISA分析显示剂量依赖性目标抑制。给药28天相比于7天，小鼠中的WSU-DLCL2异种移植物中的H3K27Me3水平更低，说明延长化合物A的投与增加了目标抑制程度。在KARPAS-422EZH2Y461N突变型异种移植物中，以BID时程28天给予化合物A具有更显著的作用。在低到80.5mg/kgBID的剂量下观察到肿瘤生长抑制，但是更高的剂量根除了异种移植物，并且在停止给药之后长达90天没有观察到再生长。当在携有KARPAS-422异种移植物的小鼠中研究间歇给药时程时，化合物A再次以7天给药/7天停药和21天给药/7天停药两个周期时程显示出显著的剂量依赖性抗肿瘤作用。关于所有给药时程，分别在90和361mg/kgBID下观察到肿瘤生长抑制和完全消退。PfeifferEZH2A677G突变型异种移植模型是最敏感的肿瘤模型，如由化合物A对这个细胞系的体外强效抗增殖作用所表明。除了最低剂量组(30mg/kgQD)之外的所有化合物A给药组(QD时程)都在所有动物中显示出完全肿瘤消退。再次，直到研究结束为止(在停止化合物A投与之后36天)才观察到肿瘤再生长。虽然在30mg/kgQD下观察到肿瘤再生长，但是这个极低剂量在投药期内诱导肿瘤停滞。由于耐药性问题，对于投与1140mg/kgQD的小鼠在第12天停止给药；但是，在仅暴露于化合物A12天的这个组中仍然观察到持久的完全消退。
化合物A选择性地杀死体外和体内SMARCB1突变型MRT细胞：测试EZH2抑制对缺失SMARCB1的MRT细胞的生长和存活是否具有任何影响。在14天体外增殖分析中，与化合物A一起孵育缺失SMARCB1的MRT细胞系G401和A204诱导出IC50值在nM范围内的强抗增殖作用，同时表达SMARCB1的对照细胞系RD和SJCRH30最低限度地受到影响(表3)。以266或532mg/kgBID向携有皮下G401异种移植物的SCID小鼠给予化合物A28天消除了那些极其快速生长的肿瘤。类似于KARPAS-422和PfeifferEZH2突变型NHL异种移植模型，在给药停止之后32天研究结束时未观察到再生长。在投药期内以133mg/kg给予化合物A诱导停滞，并且在给药停止之后，相比于媒剂，产生显著的肿瘤生长延迟。在第21天从每个组的小鼠的子组收集的肿瘤在所有剂量下显示出强EZH2目标抑制。
化合物A以剂量依赖性方式抑制非肿瘤组织中的H3K27甲基化：上文所述的数据证明，化合物A代表着SWI/SNF驱动的癌症和MRT的新治疗模式。通常在早期临床试验中执行给药后药效学生物标记调节的测量来评定基于来自临床前模型的数据经预测产生反应的目标抑制程度。因为给药后肿瘤活检的收集通常是不可能的，所以实际上通常收集更容易获得的替代组织，例如外周血单个核细胞(PBMC)、皮肤或骨髓。为了测试替代组织中的EZH2目标抑制，向雄性和雌性史泊格多利大鼠(SpragueDawleyrat)经口投与100、300或1000mg/kg化合物A28天，并且在研究结束时收集PBMC、骨髓和皮肤样品。在雄性和雌性大鼠中化合物A的血浆水平均剂量依赖性地增加，并且相比于雄性动物中的血浆水平，在雌性动物中的血浆水平通常更高。由于耐药性问题，在第23天使1000mg/kg组中的雌性动物安乐死。如通过ELISA所测量，在来自给予了化合物A的大鼠的PBMC和骨髓中观察到剂量依赖性目标抑制。来自给药22天的雌性动物的PBMC的目标抑制程度相比于给药28天(1000mg/kg的相同剂量)的雄性动物较不显著。如通过IHC分析所评定，在给予了化合物A的大鼠的皮肤的表皮中观察到H3K27Me3阳性细胞的剂量依赖性减少。在最高剂量下观察到最大作用，并且所述最大作用在化合物A投与22天之后已经很明显。
化合物A展示出与其它体外EZH2抑制剂类似的特性，例如当相比于其它HMT时，在生物化学分析中针对EZH2的非常高的特异性，并且细胞H3K27甲基化的特异性抑制引起EZH2突变的NHL细胞系的背景特异性杀伤。然而，这种化合物实现了效能增加约10倍，这通过在生物化学和细胞功能分析中所测定的降低的Ki和IC50值所反映。另外，化合物A在投与给啮齿动物时显示出优良的口服生物利用度，在异种移植肿瘤和非肿瘤组织中产生剂量依赖性EZH2目标抑制。重要的是，化合物A的给予在携有EZH2突变型淋巴瘤异种移植物的小鼠中诱导出了显著的抗肿瘤作用。反应范围是从肿瘤根除(在给药停止之后无再生长)到剂量依赖性肿瘤生长抑制。抗肿瘤活动的延迟开始(4到7天后)符合通过体外与化合物A一起孵育细胞诱导的甲基化抑制和抗增殖活动的动力学。在整个给药周期中保持化合物A血浆水平在LCC以上对于WSU-DLCL2异种移植模型诱导最大目标抑制和抗肿瘤反应来说是必需的。然而，另外两个淋巴瘤异种移植模型(KARPAS-422和Pfeiffer)对化合物A投与极其敏感，并且不必将血浆水平保持在LCC以上。PfeifferEZH2A677G突变型异种移植肿瘤在极低剂量或短给药期下永久地消失，表明患有这种类型的遗传限定NHL的患者用化合物A将具有显著治疗作用。
MRT是脑部、肾脏和软组织的侵袭性极大的儿科癌症，所述癌症是高度恶性、局部侵袭性、经常转移并且尤其是致死的，但是它们通常是二倍体并且缺乏基因组畸变。然而，它们的特征在于SWI/SNF染色质重塑复合物的核心组分SMARCB1的表达丢失的几乎完全外显率。例如通过突变诱导的SMARCB1的双等位基因失活本质上是MRT中的唯一遗传事件，这表明关于此遗传畸变的驱动者作用。通过遗传研究，已经提出了，PRC2和SWI/SNF围绕RB、周期素D1和MYC路径对抗性地调控基因表达。本文中，已经证实了在小鼠中，药理学EZH2抑制在缺失SMARCB1的MRT细胞系中诱导抗增殖作用并且永久地根除MRT异种移植物。这证实了EZH2本身没有被遗传改变的这类癌症对PRC2活性的依赖性。
化合物A代表着用于遗传限定的NHL子组和用于MRT的新治疗模式。测量皮肤、PBMC和骨髓中的H3K27Me3水平的剂量依赖性变化的能力预示着使用来自这些替代组织的信号作为人类临床试验中的非侵入性药效学生物标记。
表1：关于化合物A在人类淋巴瘤细胞系中的甲基化和增殖的IC50值以及LCC值
a：在孵育4天之后通过免疫印迹法得到。值表示来自一个实验的结果。
b：在孵育11天之后得到。每个实验的化合物孵育一式三份地执行，并且值表示除了OCI-LY19、Pfeiffer和WSU-DLCL2之外的所有细胞系的一个实验。至于剩下的三个细胞系，值表示来自以下数量的实验的平均值：OCI-LY19n＝9；Pfeiffern＝2和WSU-DLCL2n＝15。
表2：化合物A对于连续地或在化合物清除之后给药的WSU-DLCL2人类淋巴瘤细胞的LCC值
值表示一式两份实验的平均值，其中在所述实验内，每孵育浓度三个复制。
表3：化合物A针对SMARCB1阴性MRT细胞系和SMARCB1阳性对照细胞系的IC50值
细胞系 SMARCB1状态 增殖IC50(μM)，第7天 增殖IC50(μM)，第14天
RD 野生型 9.2 5.2
SJCRH30 野生型 6.1 8.8
G401 突变型 0.087 0.042
A204 突变型 3.2 0.14
值表示一式两份实验的平均值，其中在所述实验内，每孵育浓度三个复制。
实例2：通过抑制EZH2，在遗传改变的恶性横纹肌样肿瘤中持久的肿瘤消退
化合物A是EZH2的强效并且选择性抑制剂：通过迭代药物化学性质研发化合物A(图10A)。化合物A以2.5±0.5nM的抑制常数(Ki)值抑制含有野生型EZH2的人类PRC2的活性，并且针对携有所有已知淋巴瘤功能变化突变的EZH2蛋白质，观察到类似效能(表5)。通过稳定状态动力学研究，发现所述化合物是SAM竞争性和核小体非竞争性的(图11)。还评定了化合物A针对除了EZH2以外的一组HMT的抑制，所述HMT涵盖赖氨酸和精氨酸HMT两者。化合物A展示出针对EZH1的35倍选择性和相对于所测试的14种其它HMT的>4500倍的选择性(表5)。
表4：通过化合物A抑制组蛋白甲基转移酶
酶分析 IC50(nM) 在1μM化合物A下的抑制％a
CARM1 >50,000b 5±3
DOT1L >50,000c 2±8
EHMT1 >50,000c 6±6
EHMT2 >50,000c 7±3
EZH1d,e 392±72f 98±1
EZH2肽分析d,e 11±5f ND
EZH2核小体分析d 16±12f 100±1
A677G EZH2d,e 2b ND
A687V EZH2d,e 2b ND
Y641F EZH2d,e 14±5f ND
Y641C EZH2d,e 16c ND
Y641H EZH2d,e 6c ND
Y641N EZH2d,e 38b ND
Y641S EZH2d,e 6c ND
大鼠EZH2d,e 4c ND
PRMT1 >50,000c 5±4
PRMT3 ND 2±2
PRMT5/MEP50 >50,000c 2±6
PRMT6 ND 3±3
PRMT8 >50,000c 7±3
SETD7 ND 4±3
SMYD2 >50,000c 1±2
SMYD3 ND 0±5
WHSC1 >100,000c 8±3
WHSC1L1 >100,000c 9±8
a：值表示在10μmol/L化合物A下测定的一式两份实验的平均值和标准偏差。
b：值表示每实验两个复制的一式两份实验的平均值。
c：值表示每实验两个复制的一个实验。
d：在4种PRC2组分(EZH1/2、SUZ12、RBAP48、EED)的情况下分析所有EZH1和EZH2蛋白质。
e：用H3K27肽作为底物进行分析。
f：值表示复制的平均值和标准偏差(EZH1n＝4；EZH2肽分析n＝4；EZH2核小体分析n＝6；Y461FEZH2n＝3)。
化合物A特异性地抑制细胞H3K27甲基化引起SMARCB1突变型MRT细胞的选择性细胞凋亡杀伤：用化合物A处理一组缺乏SMARCB1的MRT细胞和SMARCB1野生型对照细胞(通过免疫印迹法证实，图12A)4天，引起全基因组H3K27Me3水平浓度依赖性降低(图10B和表6)。野生型或突变型细胞的处理引起仅H3K27上的甲基标志的减少，其它组蛋白甲基标志不受影响(图12B)。用化合物A体外处理缺失SMARCB1的MRT细胞系诱导出IC50值在nM范围内的强抗增殖作用；同时对照(野生型)细胞系最低限度地受到影响(图10C和表6)。在化合物暴露7天之后，在缺失SMARCB1的MRT细胞中，抗增殖作用显而易见，但是最大活性则需要暴露14天。还评定了与化合物A(1μM)一起孵育14天对G401和RD细胞中的细胞周期进程和细胞凋亡的影响。RDSMARCB1野生型细胞的化合物A孵育显示，细胞周期或细胞凋亡相比于DMSO对照无变化(图13A)。相比之下，7天后，缺失SMARCB1的G401细胞显示G1期细胞的百分比增加，并且伴随着S期与G2/M期细胞的百分比减少(图13B)。一直到第7天亚G1分数都无明显增加，表明到那个时间为止尚未诱导出细胞凋亡。这一点与G401细胞在存在化合物A的情况下的生长曲线一致，仅在孵育7天之后才展示细胞毒性(图10C)。在化合物A处理G401细胞长达14天之后，通过TUNEL分析测定的处于亚G1的细胞以及凋亡细胞的分数在第11天和第14天以时间依赖性方式增加，说明通过诱导细胞凋亡发生了化合物A介导的细胞死亡(图13B)。
表6
细胞系 SMARCB1状态 甲基化IC50(nM)a 在第14天的增殖IC50(nM)b
G401 突变型 2.7 135
A204 突变型 1.4 590
G402 突变型 1.7 144
KYM-1 突变型 4.3 32
RD 野生型 5.6 6100,>10000c
293 野生型 2.4 >10000
SJCRH30 野生型 4.9 5100,>10000c
a：在孵育4天、组蛋白萃取、免疫印迹和密度测定之后得到。值表示两个实验的平均值。
b：每个实验的化合物孵育一式三份地执行，并且针对所有细胞系，值表示2个实验的平均值。
c：一式两份实验的平均值计算不可能。
化合物A诱导神经元分化和细胞周期抑制同时遏制刺猬路径基因、MYC和EZH2的表达的基因：已经提出，SMARCB1丢失通过关键癌症路径的同时表观遗传扰动来驱使癌症形成。本发明的数据证实了相比于对照细胞，缺失SMARCB1的G401细胞中先前所描述的对于神经元分化(CD133、DOCK4、PTPRK)、细胞周期抑制(CDKN2A)和肿瘤遏制(BIN1)来说重要的基因的降低表达以及刺猬路径基因GLI1的增加表达(图14A)。化合物A处理G401细胞长达7天强烈诱导CD133、DOCK4和PTPRK的表达并且上调细胞周期抑制因子CDKN1A和CDKN2A和肿瘤遏制因子BIN1，全部以时间依赖性方式(图14B)。同时，刺猬路径基因、MYC和EZH2的表达降低。值得注意的是，暴露于化合物A中14天的缺失SMARCB1的G402细胞假定为神经元样形态(图14C)。相比之下，RD对照细胞的化合物A孵育对以上提到的基因的表达的影响最小。
化合物A根除SMARCB1突变型MRT异种移植物：经口给予化合物A在携有缺失SMARCB1的MRT异种移植物的小鼠中引起全身性化合物暴露、体内目标抑制和抗肿瘤活动。在携有皮下G401异种移植物的SCID小鼠中执行研究，其中向动物给予化合物A21天。在第21天使每组一半的小鼠安乐死用于收集血液和组织，而剩余的动物再处理7天并且然后不给药再持续32天。化合物A在所有剂量下都是充分耐受的，对体重的影响极小(图15A)。以250或500mg/kg每天两次(BID)给药21到28天实际上消除了快速生长的G401肿瘤(图15B、14C和16A)。在给药停止之后32天未观察到再生长。在投药期内以125mg/kg给予化合物A诱导肿瘤停滞，并且在给药期之后，相比于媒剂，产生显著的肿瘤生长延迟。在第21天给药之前5分钟或之后3小时测量化合物A血浆水平，揭示全身暴露明显剂量依赖性增加(图15D)。在第21天从每个组的小鼠子组收集的肿瘤显示出与抗肿瘤活动相关的强烈的H3K27me3抑制(在250mg/kg下达到最大作用，图16B)。另外，在G401异种移植肿瘤中检测到CD133、PTPRK、DOCK4和GLI1的表达的剂量依赖性变化(图16C)。
本发明数据证明了EZH2的药理学抑制在缺失SMARCB1的MRT细胞系中特异性地诱导抗增殖作用并且永久地根除小鼠中的MRT异种移植物。不管EZH2本身在此情况下未遗传改变的事实，这证实了所述癌症对PRC2活性的依赖性。本文中呈现的数据显示，在缺失SMARCB1的MRT的情况下，EZH2的抑制充当SMARCB1替代物并且去抑制神经元分化基因、细胞周期抑制因子和肿瘤抑制因子同时减少GLI1、PTCH1、MYC和EZH2。化合物A介导的EZH2抑制对若干癌症路径的影响的总和是MRT模型中所见的显著并且永久性抗肿瘤活动的原因。因此，化合物A代表着这些致死性儿童肿瘤的新治疗模式。
此外，因为在除MRT之外的其它癌症类型中，SWI/SNF复合物的若干成员遗传改变，所以可以想到EZH2还在一系列癌症类型中在肿瘤维持和存活中起一定作用。与展现EZH2抑制剂在选择性杀伤携有EZH2突变体的非霍奇金淋巴瘤中的有效性的最新报告组合，本发明数据证明基于小分子的EZH2抑制在各种遗传更改(目标定向或间接)赋予对EZH2酶活性的增殖依赖性的血液肿瘤和实体肿瘤中是有效的治疗干预机制。
实例3：材料和方法
细胞培养：细胞系293T、RD、SJCRH30、A204、G401、G402和KYM-1。293T(CRL-11268)、RD(CRL-136)、SJCRH30(CRL-2061)、A204(HTB-82)、G401(CRL-1441)和G402(CRL-1440)从ATCC获得。KYM-1(JCRB0627)从JCRB获得。293T和RD细胞在DMEM+10％FBS中培养。SJCRH30细胞在RPMI+10％FBS中培养。A204、G401和G402细胞在McCoys5a+10％FBS中培养。KYM-1细胞在DMEM/Ham'sF12+10％FBS中培养。
蛋白质印迹分析：如先前所述酸萃取组蛋白(戴格尔(Daigle)等人,《血液》(Blood).2013年8月8日；122(6):1017-25)。如先前所述对酸萃取的组蛋白执行蛋白质印迹(克努森(Knutson)等人,《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA).2013年5月7日；110(19):7922-7)。使用改良式RIPA缓冲液(10×RIPA裂解缓冲液(密理博(Millipore)#20-188))、0.1％SDS(英杰(Invitrogen)AM9823)、蛋白酶微型片剂(罗氏(Roche)#1836153)制备全细胞溶解产物(WCL)。使细胞粒化，用冰冷的PBS洗涤，再悬浮于冰冷的RIPA缓冲液中，并且在冰上孵育5分钟。在50％功率下对溶解产物声处理3次，持续10秒，然后在冰上孵育10分钟。然后在台式离心机中在最大速度下以4度离心溶解产物15分钟。将澄清的溶解产物等分到新的管中，并且通过BCA分析(皮尔斯(Pierce))测定WCL的蛋白质浓度。在10-20％Tris-甘氨酸凝胶(伯乐(Biorad))上分离十微克每种溶解产物，使用iBlot(在程序3上7分钟，使用硝化纤维转移堆栈)转移，并且用以下抗体在奥德赛(Odyssey)阻断缓冲液中探测：SNF5(CST#8745)、EZH2(CST#5246)和β-肌动蛋白(CST#3700)。
体外细胞分析：关于粘附细胞系增殖分析(除了KYM-1之外的所有细胞系，KYM-1如先前针对悬浮细胞系所述来分析(戴格尔等人,《血液》.2013年8月8日；122(6):1017-25))，基于7天时间过程内的生长曲线(通过ATP活力测量)和密度测定每个细胞系的接种密度。在化合物治疗前一天，将细胞一式三份地接种到96孔板(关于第0-7天时间过程)或6孔板(关于所述时间过程的其余部分在第7天重新接种)中。在第0天，细胞未经处理、经DMSO处理或用化合物A处理，所述化合物A以10μM开始并且以3或4倍稀释递减。在第0天、第4天和第7天使用(普洛麦格(Promega))读取板，其中在第4天补充化合物/培养基。在第7天，使6孔板胰蛋白酶化、离心并且再悬浮于新制培养基中用于通过Vi-Cell计数。将来自每种处理的细胞以初始密度一式三份地重新接种在96孔板中。使细胞粘附到所述板过夜，并且处理细胞直到第0天。在第7天、第11天和第14天，使用读取板，其中在第11天补充化合物/培养基。使用一式三份的平均值来绘制在所述时间过程中的增殖的曲线，并且计算IC50值。关于细胞周期和细胞凋亡，将G401和RD细胞以1×106个细胞/板的密度一式两份地接种在15cm培养皿中。使细胞与1μM化合物A(总共25mL)一起孵育14天时间，其中在第4天、第7天和第11天细胞分裂回到初始接种密度。使用流式细胞仪，根据制造商的方案执行细胞周期分析和TUNEL分析。
基因表达分析：将G401和RD细胞分别以175,000个细胞/烧瓶和117,000个细胞/烧瓶接种在T-75烧瓶中并且使其粘附过夜。在第0天，用DMSO或1μM化合物A一式两份地处理细胞。收集细胞并且在第2天、第4天和第7天粒化，其中在第4天补充培养基和化合物。来自给药21天(媒剂、125mg/kg和250mg/kg(各自6只动物)和500mg/kg(4只动物)化合物A给药组)的G401异种移植动物的肿瘤组织用于基因表达分析。使用RNeasy微型试剂盒(凯杰(Qiagen)#74106)从细胞球粒和肿瘤组织萃取总mRNA并且通过高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(AppliedBiosystems；AB)#4368813)逆转录。通过ViiATM7实时PCR系统(AB)，使用下表中的塔克曼(TaqMan)快速高级主混合物(AB#4444964)和塔克曼引物/探针组执行RT-PCR。使基因表达针对18S(AB#Hs99999901_s1)归一化并且使用ΔΔCt方法计算倍数变化。关于体内样品，测定每个给药组的平均Ct值+/-SD，并且使用ΔΔCt方法计算相比于媒剂给予组的倍数变化。
基因 AB#
MYC Hs00153408_m1
EZH2 Hs00172783_m1
PTCH1 Hs00181117_m1
PROM1(CD133) Hs01009250_m1
GLI1 Hs01110766_m1
DOCK4 Hs00206807_m1
PTPRK Hs00267788_m1
BIN1 Hs00184913_m1
ELISA：如先前所述(戴格尔等人)从肿瘤中分离组蛋白并且在涂布缓冲液(含0.05％BSA的PBS)中按当量浓度制备(0.5ng/μlH3和4ng/μlH3K27Me3)。向两个96孔ELISA板(赛默雷勃公司(ThermoLabsystems)，Immulon4HBX#3885)中一式两份地添加样品或标准品(100μL)。将用DMSO或10μmol/L化合物A处理了4天的从G401细胞中分离的组蛋白以与肿瘤组蛋白样品相同的组蛋白浓度添加到对照孔中。将板密封并且在4℃下孵育过夜。第二天，用300微升/孔PBST(含0.05％Tween20的PBS；10×PBST，KPL#51-14-02)在伯腾(BioTek)培养板洗涤器上洗涤板3次。用300微升/孔稀释剂(PBS+2％BSA+0.05％Tween20)阻断培养板，在室温下孵育2小时，并且用PBST洗涤3次。在稀释剂中稀释所有抗体。将100微升/孔抗H3K27Me3(CST#9733，50％甘油储备液1:1,000)或抗总H3(艾碧康(Abcam)#ab1791，50％甘油储备液1:10,000)添加到每个培养板中。在室温下孵育培养板90分钟并且用PBST洗涤3次。将100微升/孔抗Rb-IgG-HRP(细胞信号传导技术公司(CellSignalingTechnology)，7074)以1:2000添加到H3K27Me3培养板中并且以1:6000添加到H3培养板中，并且在室温下孵育90分钟。培养板用PBST洗涤4次。关于检测，添加100微升/孔TMB底物(拜福克斯实验室(BioFxLaboratories)，#TMBS)并且在室温下在暗处孵育培养板5分钟。用100微升/孔1NH2SO4停止反应。在SpectraMaxM5微量板读取器上在450nm下读取吸光度。
异种移植研究：在这项研究中，根据上海睿智化学研究有限公司(ShanghaiChemparner)的机构动物照顾和使用委员会(IACUC)所批准的指南，遵循实验室动物护理的评估和认可协会(AAALAC)的指导，执行与动物处置、护理和处理相关的所有程序。关于体内研究，在小鼠右侧皮下接种含G-401肿瘤细胞(5×106个/小鼠)的用于肿瘤发展的基础培养基和基质胶(McCoy's5A:基质胶＝1:1)的0.2ml混合物。关于肿瘤功效研究(每组n＝16只小鼠)，当肿瘤大小达到约157mm3时开始处理。以10μL/g的剂量体积BID经口投与化合物A或媒剂(0.5％NaCMC+0.1％Tween-80，在水中)，持续21或28天。在第一周期间每天测量动物体重，然后关于研究的其余部分每周两次。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤大小，并且体积用mm3表示。关于PK/PD分析，在给药21天之后，使具有最大肿瘤负荷的8只小鼠安乐死以便肿瘤和血液收集。其余的小鼠再继续给药一周，并且从第29天起，停止处理并且在肿瘤生长延迟研究中登记小鼠。作为个体观察小鼠直到它们达到肿瘤重量终点(2000mm3)为止或直到第60天为止(无论哪个先到)。
药物动力学分析：使用地塞米松(Dexamethasone)作为内标。向30μL血浆样品的等分试样中添加30μLIS(地塞米松，1000ng/mL)和150μLACN。使混合物涡旋5min，并且在14000rpm下离心5min。注射2μL上清液的等分试样用于LC-MS/MS分析(Q-trap3200)。关于经10倍稀释的血浆样品，向3μL血浆样品等分试样中添加27μL空白血浆，稀释因子是10，并且然后添加30μLIS(地塞米松，1000ng/mL)和150μLACN。使混合物涡旋5min，并且在14000rpm下离心5min。注射2μL上清液等分试样用于LC-MS/MS分析。在上使肿瘤样品与3×PBS(w/v)一起均质化30秒，获得肿瘤匀浆。向30μL肿瘤匀浆样品等分试样中添加30μLIS(地塞米松，1000ng/mL)和150μLACN。使混合物涡旋5min，并且在14000rpm下离心5min。注射2μL上清液等分试样用于LC-MS/MS分析。
实例4：通用实验程序
NMR
除非另外说明，否则使用CDCl3获得1H-NMR光谱并且使用瓦里安(Varian)或牛津(Oxford)仪器磁体(500MHz)仪器在400或500MHz下记录所述光谱。所指出的多峰性是s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，sxt＝六重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，br表示宽峰信号。
LCMS和HPLC
岛津(Shimadzu)LC-Q、岛津LCMS-2010EV或沃特斯阿奎蒂超高效LC(WatersAcquityUltraPerformanceLC).HPLC：通过岛津SPD-20A，用150×4.5mmYMCODS-M80柱或150×4.6mmYMC-PackProC18柱以1.0ml/min分析产物。
流动相是MeCN:H2O＝3:2(含有0.3％SDS和0.05％H3PO4)，
0.05％TFA/水、0.05％TFA/乙腈(梯度：在3min内，初始20％、然后0.05％TFA/浓度95％MeCN；保持0.5min；在3.51到4.50min，然后是0.05％TFA/浓度20％MeCN)。
或者关于LCMS，使用2种不同方法：使用得最多的一种是高pH(METCR1600)并且另一种用于更标准的化合物(METCR1416)。
0.1％甲酸/水-流动相“A”；0.1％甲酸/乙腈-流动相“B”，采用沃特斯亚特兰蒂斯(WatersAtlantis)dC182.1mm×100mm3μm柱，其中流速＝0.6ml/min；柱温＝40℃；时间(min)％B：0.00min5％B、5.0min100％B、5.4min100％B和42min5％B
3.5分钟方法是指亚特兰蒂斯dC182.1mm×50mm3μm柱，流速是1ml/min，在40℃下。流动相A甲酸(水溶液)0.1％；流动相B甲酸(MeCN)0.1％；注射3μL；梯度：0min(5％有机物)、2.5min(100％有机物)、2.7min(100％有机物)、2.71min(5％有机物)、3.5min(5％有机物)
7.0分钟方法是指亚特兰蒂斯dC182.1mm×100mm3μm柱，流速是0.6ml/min，在40℃下。流动相A甲酸(水溶液)0.1％；流动相B甲酸(MeCN)0.1％；注射3μL；梯度：0min(5％有机物)、5min(100％有机物)、5.4min(100％有机物)、5.42min(5％有机物)、7min(5％有机物)
3.5和7分钟方法均在MS18岛津LCMS-2010EV或MS19岛津LCMS-2010EV系统上利用LC-20AB泵和SPD-M20APDA检测器来执行。
通过HPLC/MS，使用沃特斯自动纯化系统，用3100质量检测器来纯化产物。
HPLC分析还可以在岛津LC-2010CHT上使用YMCODS-AC18(150×4.6×5μm)柱在环境温度下以1.4ml/min的流速执行。采用10μl注射体积并且通过UV/PDA发生检测。流动相A是0.05％TFA/水并且流动相B是0.05％TFA/乙腈，梯度程序是在8min内初始5％B到95％B；保持1.5min；在9.51到12min，B浓度是0.5％。稀释剂是流动相
其它
在拜泰齐伊索莱尔(BiotageIsolera)4版上执行自动化快速柱色谱。10g卡扣式筒柱以12ml/min运行或25g卡扣式筒柱以25ml/min运行并且在254nm和280nm下检测。
可以在台利斯纳诺(ThalesNano)上根据实验程序中所描述的条件执行所选腈还原。
其它相关的通用程序还可以见于PCT公开第WO12/118812号、PCT申请第PCT/US2012/033648号和PCT申请第PCT/US2012/033662号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
实例5：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
步骤1：合成5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸
在室温下以逐份方式向2-甲基-3-硝基苯甲酸(100g，552mmol)于浓H2SO4(400mL)中的搅拌溶液中添加1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮(88g，308mmol)，并且然后在室温下搅拌反应混合物5小时。将反应混合物倒入冰冷水上，过滤出沉淀固体，用水洗涤并且在真空中干燥，从而获得呈固体状的所要化合物(140g，98％)。经分离化合物直接带到下一步骤中。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.31(s,1H),8.17(s,1H),2.43(s,3H)。
步骤2：合成5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯
在室温下，向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(285g，1105mmol)于DMF(2.8L)中的搅拌溶液中添加碳酸钠(468g，4415mmol)，接着添加碘甲烷(626.6g，4415mmol)。在60℃下加热所得反应混合物8小时。在完成之后(通过TLC监控)，过滤反应混合物(用于去除碳酸钠)并且用乙酸乙酯(1L×3)洗涤。用水(3L×5)洗涤经合并的滤液并且用乙酸乙酯(1L×3)反萃取水相。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈固体状的标题化合物(290g，97％产率)。经分离化合物直接带到下一步骤中。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.17(s,1H),7.91(s,1H),3.96(s,3H),2.59(s,3H)。
步骤3：合成3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(290g，1058mmol)于乙醇(1.5L)中的搅拌溶液中添加氯化铵水溶液(283g，5290mmol，溶解于1.5L水中)。在80℃下搅拌所得混合物，以逐份方式向其中添加铁粉(472g，8451mmol)。在80℃下加热所得反应混合物12小时。在完成之后，如通过TLC所测定，经趁热过滤反应混合物并且用甲醇(5L)洗涤硅藻土床，接着用30％MeOH/DCM(5L)洗涤。在真空中浓缩经合并的滤液，用碳酸氢钠水溶液(2L)稀释所获得的残余物，并且用乙酸乙酯(5L×3)萃取。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈固体状的标题化合物(220g，85％)。所述化合物直接带到下一步骤中。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.37(s,1H),6.92(s,1H),3.94(s,3H),3.80(bs,2H),2.31(s,3H)。
步骤4：合成5-溴-2-甲基-3-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酸甲酯
向3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(15g，61.5mmol)和二氢-2H-吡喃-4(3)-酮(9.2g，92mmol)于二氯乙烷(300mL)中的搅拌溶液中添加乙酸(22g，369mmol)并且在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后将反应混合物冷却到0℃并且添加三乙酰氧基硼氢化钠(39g，184mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。在反应完成之后，如通过TLC测定，向反应混合物中添加碳酸氢钠水溶液直到获得pH7-8为止。分离有机相并且用乙酸乙酯萃取水相。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过柱色谱(100-200目硅胶)，用乙酸乙酯:己烷洗脱来纯化粗化合物，从而获得呈固体状的所要化合物(14g，69％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.01(s,1H),6.98(s,1H),5.00(d,1H,J＝7.6Hz),3.84-3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.54-3.56(m,1H),3.43(t,2H,J＝12Hz),2.14(s,3H),1.81-1.84(m,2H),1.47-1.55(m,2H)。
步骤5：合成5-溴-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酸甲酯(14g，42.7mmol)于二氯乙烷(150mL)中的搅拌溶液中添加乙醛(3.75g，85.2mmol)和乙酸(15.3g，256mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物15分钟。将混合物冷却到0℃并且添加三乙酰氧基硼氢化钠(27g，128mmol)。在室温下搅拌反应混合物3小时。在反应完成之后，如通过TLC测定，向反应混合物中添加碳酸氢钠水溶液直到获得pH7-8为止，分离有机相并且用乙酸乙酯萃取水相。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过柱色谱(100-200目硅胶)，用乙酸乙酯:己烷洗脱来纯化粗化合物，从而获得呈粘性液体状的所要化合物(14g，93％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.62(s,1H),7.52(s,1H),3.80(bs,5H),3.31(t,2H),2.97-3.05(m,2H),2.87-2.96(m,1H),2.38(s,3H),1.52-1.61(m,2H),1.37-1.50(m,2H),0.87(t,3H,J＝6.8Hz)。
步骤6：合成5-溴-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酰胺
向5-溴-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酸酯(14g，39.4mmol)于乙醇(100mL)中的搅拌溶液中添加NaOH水溶液(2.36g，59.2mmol，于25mL水中)并且在60℃下搅拌所得混合物1小时。在反应完成之后，如通过TLC测定，在减压下去除溶剂并且用1NHCl酸化所获得的残余物直到获得pH7为止并且然后添加柠檬酸水溶液直到获得pH5-6为止。用10％MeOH/DCM(200mL×3)萃取水层，经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而得到对应的酸(14g，100％)。
然后将以上的酸(14g，40.9mmol)溶解于DMSO(70mL)中并且向其中添加3-(氨甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(12.4g，81.9mmol)。在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后添加PYBOP(31.9g，61.4mmol)并且在室温下继续搅拌过夜。在反应完成之后，如通过TLC测定，将反应混合物倒入冰冷水(700mL)中，搅拌30分钟并且通过过滤收集沉淀固体，用水(500mL)洗涤并且风干。与乙腈(75mL×2)一起搅拌所获得的固体，过滤并且风干。再次与5％MeOH/DCM(100mL)一起搅拌所获得的固体，过滤并且在真空中完全干燥，从而获得呈固体状的标题化合物(14g，74％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.47(s,1H),8.23(t,1H),7.30(s,1H),7.08(s,1H),5.85(s,1H),4.23(d,2H,J＝4.4Hz),3.81(d,2H,J＝10.4Hz),3.20-3.26(m,2H),3.00-3.07(m,1H),2.91-2.96(m,2H),2.18(s,3H),2.14(s,3H),2.10(s,3H),1.58-1.60(m,2H),1.45-1.50(m,2H),0.78(t,3H,J＝6.8Hz)。
步骤7：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
向5-溴-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酰胺(14g，29.5mmol)于二噁烷/水混合物(70mL/14mL)中的搅拌溶液中添加4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)苯甲基)吗啉(13.4g，44.2mmol)，接着添加Na2CO3(11.2g，106.1mmol)。用氩气净化溶液15分钟并且然后添加Pd(PPh3)4(3.40g，2.94mmol)并且再次用氩气再净化溶液10分钟。在100℃下加热反应混合物4小时。在完成之后(通过TLC监控)，反应混合物用水稀释并且用10％MeOH/DCM萃取。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过柱色谱(100-200目硅胶)，用甲醇:DCM洗脱来纯化粗化合物，从而得到呈固体状的标题化合物(12g，71％)。分析数据：LCMS：573.35(M+1)+；HPLC：99.5％(在254nm下)(Rt；3.999；方法：柱：YMCODS-A150mm×4.6mm×5μ；流动相：A(0.05％TFA/水)/B(0.05％TFA/乙腈)；注射体积：10μL；柱温：30℃；流速：1.4mL/min；梯度：8min内，5％B到95％B，保持1.5分钟，9.51-12min5％B)；1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.46(s,1H),8.19(t,1H),7.57(d,2H,J＝7.2Hz),7.36-7.39(m,3H),7.21(s,1H),5.85(s,1H),4.28(d,2H,J＝2.8Hz),3.82(d,2H,J＝9.6Hz),3.57(bs,4H),3.48(s,2H),3.24(t,2H,J＝10.8Hz),3.07-3.09(m,2H),3.01(m,1H),2.36(m,4H),2.24(s,3H),2.20(s,3H),2.10(s,3H),1.64-1.67(m,2H),1.51-1.53(m,2H),0.83(t,3H,J＝6.4Hz)。
步骤8：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺三盐酸盐
将N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(12g，21.0mmol)溶解于甲醇HCl(200mL)中并且在室温下搅拌3小时。在搅拌三小时之后，在减压下浓缩反应混合物。与乙醚(100mL×2)一起搅拌所获得的固体，从而获得呈固体状的所要的盐(11g，77％)。三盐酸盐的分析数据：LCMS：573.40(M+1)+；HPLC：99.1％(在254nm下)(Rt；3.961；方法：柱：YMCODS-A150mm×4.6mm×5μ；流动相：A(0.05％TFA/水)/B(0.05％TFA/乙腈)；注射体积：10μL；柱温：30℃；流速：1.4mL/min；梯度：8min内，5％B到95％B，保持1.5分钟，9.51-12min5％B)；1HNMR(D2O400MHz)δ7.92(bs,1H,)7.80(s,1H),7.77(d,2H,J＝8Hz),7.63(s,1H),7.61(s,1H),6.30(s,1H),4.48(s,2H),4.42(s,2H),4.09-4.11(m,4H),3.95-3.97(m,2H),3.77(t,3H,J＝10.4Hz),3.44-3.47(m,3H),3.24-3.32(m,3H),2.42(s,3H),2.35(s,3H),2.26(s,3H),2.01(m,2H),1.76(m,2H),1.04(t,3H,J＝6.8Hz)。
实例6：N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(((1r,4r)-4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
步骤1：5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸
在室温下，以逐份方式向2-甲基-3-硝基苯甲酸(100g，552.48mmol)于浓H2SO4(400mL)中的搅拌溶液中添加1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮(87.98g，307.70mmol)。然后在室温下搅拌反应混合物5小时。将反应混合物倒入冰冷水中，通过过滤收集沉淀固体，用水洗涤并且在真空中干燥，从而获得呈灰白色固体状的所要5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(140g，97.90％产率)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.31(s,1H),8.17(s,1H),2.43(s,3H)。
步骤2：5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯
在室温下，向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(285g，1104.65mmol)于DMF(2.8L)中的搅拌溶液中添加碳酸钠(468g，4415.09mmol)，接着添加碘甲烷(626.63g，4415mmol)。在60℃下搅拌所得反应混合物8小时。然后过滤反应混合物，移出悬浮的固体，用乙酸乙酯(3×1L)充分洗涤所述固体。用水(5×3L)充分洗涤合并的滤液并且用乙酸乙酯(3×1L)反萃取水相。经合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈灰白色固体状的5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(290g，97％产率)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.17(s,1H),7.91(s,1H),3.96(s,3H),2.59(s,3H)。
步骤3：3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(290g，1058.39mmol)于乙醇(1.5L)中的搅拌溶液中添加氯化铵水溶液(283g，5290mmol，溶解于1.5L水中)。搅拌所得混合物并且在80℃下加热，接着在80℃下逐份添加铁粉(472g，8451mmol)。在80℃下加热所得反应混合物12小时。然后通过趁热过滤反应混合物并且相继用甲醇(5L)和30％MeOH/DCM(5L)充分洗涤床。在真空中浓缩经合并的滤液并且用碳酸氢盐水溶液(2L)稀释所获得的残余物并且用乙酸乙酯(3×5L)萃取。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈褐色固体状的3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(220g，89.41％产率)。
将一部分产物(5g)溶解于热乙醇(20mL)中，过滤掉不溶性残余物并且浓缩母液，从而获得呈浅褐色固体状的HPLC纯度为93.81％的3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(3.5g，70％产率)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.37(s,1H),6.92(s,1H),3.94(s,3H),3.80(bs,2H),2.31(s,3H)。
步骤4：5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯
向3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(5g，20.5mmol)和(4-氧代环己基)氨基甲酸叔丁酯(5.69g，26.7mmol)于二氯乙烷(50mL)中的搅拌溶液中添加乙酸(7.4g，123mmol)，并且在室温下搅拌反应物10分钟。然后在0℃下添加三乙酰氧基硼氢化钠(13.1g，61.7mmol)并且在室温下搅拌反应物16小时。用碳酸氢钠水溶液淬灭反应物，分离有机相并且用二氯甲烷萃取水相。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(100-200目大小)，用10％乙酸乙酯/己烷洗脱来纯化粗产物，从而获得3.5g极性更大的呈固体状的(反式)异构体5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(38.46％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.21(s,1H),6.80(s,1H),4.41(bs,1H),3.85(s,3H),3.60(m,1H),3.45(m,1H),3.20(m,1H),2.22(s,3H),2.15(bs,2H),2.05(bs,2H),1.45(s,9H),1.30(m,4H)。
步骤5：5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)-(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(55g，0.124mol)和乙醛(11g，0.25mol)于二氯乙烷(550mL)中的搅拌溶液中添加乙酸(44.64g，0.744mol)，并且在室温下搅拌反应混合物10分钟。然后在0℃下添加三乙酰氧基硼氢化钠(79g，0.372mol)并且在室温下搅拌反应混合物16小时。用碳酸氢钠水溶液淬灭反应物，分离有机相并且用二氯甲烷萃取水相。经合并的萃取物用无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱(100-200目大小)，用10％乙酸乙酯/己烷洗脱来纯化粗化合物，从而获得44g呈固体状的5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)-(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(75.2％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.55(s,1H),7.45(s,1H),6.65(d,1H),3.80(s,3H),3.15(bs,1H),3.05(q,2H),2.60(m,1H),2.30(s,3H),1.75(m,4H),1.40(m,2H),1.35(s,9H),1.10(m,2H),0.80(t,3H)。
步骤6：((1r,4r)-4-((5-溴-3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯
向5-溴-3-(((1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)-(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(25g，0.053mol)于EtOH(100mL)中的溶液中添加NaOH水溶液(3.5g，0.08mol，于10mLH2O中)并且在60℃下搅拌1小时。然后在减压下去除乙醇并且用稀HCl酸化到pH8并且用柠檬酸酸化到pH6。用10％甲醇/DCM(3×200mL)萃取混合物。干燥并且浓缩经合并的有机层，得到对应的酸(24.2g，99.0％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ13.13(s,1H),7.54(s,1H),7.43(s,1H),6.68(d,1H),3.14(bs,1H),3.03(q,2H),2.56(m,1H),2.33(s,3H),1.80-1.65(m,4H),1.40(m,2H),1.35(s,9H),1.10(m,2H),0.77(t,3H)。
将所述酸(24g，0.053mol)溶解于DMSO(100mL)中并且添加3-(氨甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(16g，0.106mol)和三乙胺(5.3g，0.053mol)。在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后添加PyBop(41g，0.079mmol)并且然后在室温下继续搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水(1L)中。通过过滤收集所得沉淀，用水(2×1L)充分洗涤并且干燥。通过用乙腈(3×200mL)和DCM(100mL)洗涤，进一步纯化所获得的产物，从而获得((1r,4r)-4-((5-溴-3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)环己基)-氨基甲酸叔丁酯(24g，77％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.47(s,1H),8.24(t,1H),7.25(s,1H),7.04(s,1H),6.67(d,1H),5.85(s,1H),4.24(d,2H),3.13(bs,1H),3.01(q,2H),2.53(m,1H),2.18(s,3H),2.10(s,6H),1.80-1.65(m,4H),1.40(m,2H),1.35(s,9H),1.10(m,2H),0.77(t,3H)。
步骤7：((1r,4r)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-基)(乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯
向((1r,4r)-4-((5-溴-3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)环己基)-氨基甲酸叔丁酯(24g，0.041mol)和4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)苯甲基)吗啉(18g，0.061mol)于二噁烷/水混合物(160mL+40mL)中的搅拌溶液中添加Na2CO3(15g，0.15mol)，并且用氩气净化溶液15分钟。然后添加Pd(PPh3)4(4.7g，0.041mol)并且再次用氩气净化反应混合物10分钟。在100℃下加热反应混合物4小时。然后用10％MeOH/DCM(500mL)稀释反应混合物并且过滤。浓缩滤液，用水(500mL)稀释并且用10％MeOH/DCM(3×500mL)萃取。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂。通过硅胶柱色谱(100-200目)，用7％MeOH/DCM洗脱来纯化粗产物，从而获得((1r,4r)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-基)(乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(20g，71.43％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.46(s,1H),8.20(t,1H),7.56(d,2H),7.36(m,3H),7.17(s,1H),6.66(d,1H),5.85(s,1H),4.28(d,2H),3.57(bs,4H),3.48(s,2H),3.20-3.05(m,3H),2.62(m,1H),2.36(bs,4H),2.20(s,6H),2.10(s,3H),1.75(m,4H),1.42(m,2H),1.35(s,9H),1.10(m,2H),0.82(t,3H)。
步骤8：5-(((1r,4r)-4-氨基环己基)(乙基)氨基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
在0℃下，向((1r,4r)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-基)(乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(20g，0.03mol)于DCM(200mL)中的搅拌溶液中添加TFA(75mL)并且在室温下搅拌反应物2小时。然后将反应混合物浓缩至干燥并且用饱和碳酸氢盐水溶液(300mL)将残余物碱化到pH8。用20％甲醇/DCM(4×200m)萃取混合物。用Na2SO4干燥经合并的萃取物并且在减压下去除溶剂，从而获得5-(((1r,4r)-4-氨基环己基)(乙基)氨基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(15.5g，91％)，将它用于下一反应中。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.18(bs,1H),7.57(d,2H),7.38(m,3H),7.20(s,1H),5.85(s,1H),4.29(d,2H),3.57(bs,4H),3.48(s,2H),3.31(bs,2H),3.10(m,2H),2.91(m,1H),2.67(m,1H),2.36(bs,4H),2.21(s,3H),2.20(s,3H),2.10(s,3H),1.90(m,2H),1.83(m,2H),1.45(m,2H),1.23(m,2H),0.83(t,3H)。
步骤9：N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(((1r,4r)-4-(二甲基氨基)环己基)(乙基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
在0℃下，向5-(((1r,4r)-4-氨基环己基)(乙基)氨基)-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(14g，0.023mol)于二氯甲烷(150mL)中的搅拌溶液中添加35％甲醛水溶液(2.4g，0.080mol)。在搅拌20分钟之后，添加Na(OAc)3BH(12.2g，0.057mol)并且在0℃下继续搅拌2小时。然后向反应混合物中添加水(100mL)并且用20％甲醇/DCM(3×200mL)萃取混合物。用Na2SO4干燥经合并的萃取物并且在减压下去除溶剂。通过碱性氧化铝柱色谱，用6-7％MeOH/DCM洗脱来纯化粗产物，从而获得标题化合物(10g，63.6％)。LCMS：614.65(M+1)+；HPLC：98.88％(在210-370nm下)(Rt；3.724；方法：柱：YMCODS-A150mm×4.6mm×5μ；流动相：A(0.05％TFA/水)/B(0.05％TFA/乙腈)；注射体积：10μL；柱温：30℃；流速：1.4mL/min；梯度：8min内，5％B到95％B，保持1.5分钟，9.51-12min5％B)；1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.45(s,1H),8.17(t,1H),7.56(d,2H,J＝8Hz),7.36(m,3H),7.17(s,1H),5.85(s,1H),4.29(d,2H,J＝4.4Hz),3.57(bs,4H),3.48(s,2H),3.09(q,2H),2.66(m,1H),2.36(bs,4H),2.21(s,3H),2.20(s,3H),2.11(s,9H),1.79(m,4H),1.36(m,2H),1.11(m,2H),0.82(t,3H,J＝6.4&6.8Hz)。
实例7：生物分析方案和通用方法
野生型和突变型PRC2酶分析的方案
通用材料.S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH)、二甘氨酸、KCl、Tween20、二甲亚砜(DMSO)和牛皮明胶(BSG)以可能的最高纯度水平购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。二硫苏糖醇(DTT)购自EMD。3H-SAM以80Ci/mmol的比活性购自美国放射性标记化学品(AmericanRadiolabeledChemicals)。384孔链霉亲和素闪光培养板(streptavidinFlashplate)购自珀金埃尔默(PerkinElmer)。
底物.代表含有未经修饰的赖氨酸27(H3K27me0)或二甲基化赖氨酸27(H3K27me2)的人类组蛋白H3残基21-44的肽由21世纪生物化学品(21stCenturyBiochemicals)用C端G(K-生物素)连接子-亲和性标记基元和C端酰胺帽合成。所述肽经高效液相色谱(HPLC)纯化到大于95％纯度并且通过液相色谱-质谱(LC-MS)证实。下文列出序列。
H3K27me0：ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-酰胺(SEQIDNO:7)
H3K27me2：ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-酰胺(SEQIDNO:8)
根据已确立的程序从鸡血中纯化鸡红细胞寡核小体。
重组PRC2复合物.人类PRC2复合物使用杆状病毒表达系统以在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda，sf9)细胞中共表达的4组分酶复合物的形式纯化。所表达的亚基是野生型EZH2(NM_004456)或由野生型EZH2构筑体产生的EZH2Y641F、N、H、S或C突变体、EED(NM_003797)、Suz12(NM_015355)和RbAp48(NM_005610)。EED亚基含有N端FLAG标记，其用于从sf9细胞溶解物中纯化全部4组分复合物。复合物的纯度满足或超出95％，如通过SDS-PAGE和安捷伦生物分析仪(AgilentBioanalyzer)分析所测定。酶储备浓缩物的浓度(通常是0.3-1.0mg/mL)使用布莱德福分析(Bradfordassay)对照牛血清白蛋白(BSA)标准物测定。
对肽底物的PRC2酶分析的通用程序.分析均在使用当天制备的由20mM二甘氨酸(pH＝7.6)、0.5mMDTT、0.005％BSG和0.002％Tween20组成的缓冲液中进行。使用配备有384通道移液管头的Platemate2×3(赛默(Thermo))将含化合物的100％DMSO(1μL)点样到聚丙烯384孔V形底培养板(葛莱娜(Greiner))中。将DMSO(1μL)添加到第11、12、23、24列、第A-H行以用于最大信号对照，并且将PRC2的已知产物和抑制剂SAH(1μL)添加到第11、12、23、24列、第I-P行以用于最小信号对照。通过MultidropCombi(赛默)添加含有野生型PRC2酶和H3K27me0肽或Y641突变型酶与H3K27me2肽中的任一者的混合液(40μL)。允许化合物与PRC2一起在25℃下孵育30分钟，接着添加含有非放射性和3H-SAM的混合物的混合液(10μL)以引发反应(最终体积＝51μL)。在所有情况下，最终浓度如下：野生型或突变型PRC2酶是4nM，最小信号对照孔中的SAH是1mM，并且DMSO浓度是1％。其余组分的最终浓度指示在以下表7中。通过添加非放射性SAM(10μL)到600μM的最终浓度停止分析，其将3H-SAM稀释到其在肽底物中的并入不再可检测的程度。接着，将384孔聚丙烯培养板中的50μL反应物转移到384孔闪光培养板中，并且允许生物素化肽结合于链霉亲和素表面至少1小时，随后用0.1％Tween20在伯腾(Biotek)ELx405培养板洗涤器中洗涤三次。接着，在珀金埃尔默TopCount读板仪中读取培养板，以测量结合于闪光培养板表面的3H标记的肽的数量，按每分钟衰变数(dpm)或可替代地称为每分钟计数(cpm)测量。
表7：基于EZH2特性(野生型或Y641突变型EZH2)的每一分析变化形式的组分的最终浓度
对寡核小体底物的野生型PRC2酶分析的通用程序.分析在使用当天制备的由20mM二甘氨酸(pH＝7.6)、0.5mMDTT、0.005％BSG、100mMKCl和0.002％Tween20组成的缓冲液中进行。使用配备有384通道移液管头的Platemate2×3(赛默)将含化合物的100％DMSO(1μL)点样到聚丙烯384孔V形底培养板(葛莱娜)中。将DMSO(1μL)添加到第11、12、23、24列、第A-H行以用于最大信号对照，并且将PRC2的已知产物和抑制剂SAH(1μL)添加到第11、12、23、24列、第I-P行以用于最小信号对照。通过MultidropCombi(赛默)添加含有野生型PRC2酶和鸡红细胞寡核小体的混合液(40μL)。允许化合物与PRC2一起在25℃下孵育30分钟，接着添加含有非放射性和3H-SAM的混合物的混合液(10μL)以引发反应(最终体积＝51μL)。最终浓度如下：野生型PRC2酶是4nM，非放射性SAM是430nM，3H-SAM是120nM，鸡红细胞寡核小体是120nM，最小信号对照孔中的SAH是1mM，并且DMSO浓度是1％。分析通过添加非放射性SAM(10μL)到600μM的最终浓度来停止，其将3H-SAM稀释到其在鸡红细胞寡核小体底物中的并入不再可检测的程度。接着，将384孔聚丙烯培养板中的50μL反应物转移到384孔闪光培养板中，并且使鸡红细胞核小体固定于培养板表面，接着用0.1％Tween20在伯腾ELx405培养板洗涤器中洗涤所述培养板三次。接着，在珀金埃尔默TopCount读板仪中读取培养板，以测量结合于闪光培养板表面的3H标记的鸡红细胞寡核小体的数量，按每分钟衰变数(dpm)或可替代地称为每分钟计数(cpm)测量。
抑制％计算
其中dpm＝每分钟衰变数，cmpd＝分析孔中的信号，并且min和max是对应的最小和最大信号对照。
四参数IC50拟合
其中顶部和底部通常允许浮动，但在3参数拟合中可分别固定在100或0处。希尔系数(HillCoefficient)通常允许浮动，但在3参数拟合中也可固定在1处。Y是抑制％，并且X所述化合物浓度。
对肽底物的PRC2酶分析(例如EZH2野生型和Y641F)的IC50值呈现在以下表8中。
WSU-DLCL2甲基化分析
WSU-DLCL2悬浮细胞购自DSMZ(德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,Braunschweig,Germany))。RPMI/Glutamax培养基、青霉素-链霉素、热灭活胎牛血清和D-PBS购自美国纽约州格兰德岛的生命技术公司(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)。提取缓冲液和中和缓冲液(5×)购自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的活性基元公司(ActiveMotif,Carlsbad,CA,USA)。兔抗组蛋白H3抗体购自美国马萨诸塞州剑桥的艾碧康公司(Abcam,Cambridge,MA,USA)。兔抗H3K27me3和HRP结合的抗兔IgG购自美国马萨诸塞州丹佛斯的细胞信号传导技术公司(CellSignalingTechnology,Danvers,MA,USA)。TMB“超灵敏(SuperSensitive)”底物来源于美国马里兰州奥因斯米尔斯的BioFX实验室(BioFXLaboratories,OwingsMills,MD,USA)。无IgG牛血清白蛋白购自美国宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)。具有Tween的PBS(10×PBST)购自美国马里兰州盖瑟斯堡的KPL公司(KPL,Gaithersburg,MD,USA)。硫酸购自美国德克萨斯州阿林顿的瑞卡化学公司(RiccaChemical,Arlington,TX,USA)。ImmulonELISA培养板购自美国纽约州罗契斯特的赛默公司(Thermo,Rochester,NY,USA)。V型底细胞培养板购自美国纽约州康宁的康宁公司(CorningInc.,Corning,NY,USA)。V型底聚丙烯培养板购自美国北卡罗来纳州门罗的葛莱娜第一生化公司(GreinerBio-One,Monroe,NC,USA)。
将WSU-DLCL2悬浮细胞维持在生长培养基(补充有10％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI1640)中并且在37℃下在5％CO2下培养。在分析条件下，在37℃下在5％CO2下在培养板振荡器上在分析培养基(补充有20％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI1640)中孵育细胞。
将WSU-DLCL2细胞以50,000个细胞/毫升的浓度接种于分析培养基中，以每孔200μL接种于96孔V型底细胞培养板中。将来自96孔来源培养板的化合物(1μL)直接添加到V型底细胞培养板中。将培养板在滴定培养板振荡器上在37℃、5％CO2下孵育96小时。孵育四天后，培养板以241×g旋转五分钟，并且在不扰乱细胞球粒的情况下从细胞培养板的每一孔中轻轻地抽吸培养基。将球粒再悬浮于200μLDPBS中，并且培养板以241×g再旋转五分钟。抽吸上清液，并且每孔添加冷(4℃)提取缓冲液(100μL)。将培养板在4℃下在定轨振荡器上孵育两小时。培养板以3427×g旋转10分钟。将上清液(80μL/孔)转移到96孔V型底聚丙烯培养板中的其对应孔中。将中和缓冲液5×(20μL/孔)添加含有上清液的V型底聚丙烯培养板中。在定轨振荡器上孵育含有粗组蛋白制备物(CHP)的V型底聚丙烯培养板五分钟。将粗组蛋白制备物(2μL/孔)添加到含有100μL涂布缓冲液(1×PBS+BSA0.05％w/v)的一式两份96孔ELISA培养板中的每一对应孔中。将培养板密封并且在4℃下孵育过夜。第二天，用每孔300μL1×PBST洗涤培养板三次。各孔用每孔300μLELISA稀释剂((PBS(1×)BSA(2％w/v)和Tween20(0.05％v/v))封闭两小时。培养板用1×PBST洗涤三次。对于组蛋白H3检测培养板，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:10,000稀释的抗组蛋白H3抗体(艾碧康，ab1791)。对于H3K27三甲基化检测培养板，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:2000稀释的抗H3K27me3。培养板在室温下孵育90分钟。用每孔300μL1×PBST洗涤培养板三次。对于组蛋白H3检测，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:6000稀释的HRP结合的抗兔IgG抗体。对于H3K27me3检测，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:4000稀释的HRP结合的抗兔IgG抗体。培养板在室温下孵育90分钟。用每孔300μL1×PBST洗涤培养板四次。每孔添加100μLTMB底物。组蛋白H3培养板在室温下孵育五分钟。H3K27me3培养板在室温下孵育10分钟。反应用硫酸1N(每孔100μL)停止。每一培养板的吸光度在450nm下读取。
首先，通过下式测定每一孔的比率：
每一培养板包括八个仅DMSO处理的对照孔(最小抑制)以及八个用于最大抑制的对照孔(背景孔)。
计算每一对照类型的比率值的平均值，并且将其用于测定培养板中每一测试孔的抑制百分比。测试化合物在DMSO中连续稀释三倍，总共十个测试浓度，以25μM开始。测定抑制百分比，并且根据化合物浓度使用一式两份孔产生IC50曲线。以下表8中呈现此分析的IC50值。
细胞增殖分析
WSU-DLCL2悬浮细胞购自DSMZ(德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心)。RPMI/Glutamax培养基、青霉素-链霉素、热灭活胎牛血清购自美国纽约州格兰德岛的生命技术公司。V型底聚丙烯384孔培养板购自美国北卡罗来纳州门罗的葛莱娜第一生化公司。细胞培养384孔白色不透明培养板购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。Cell-Titer购自美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)。SpectraMaxM5读板仪购自美国加利福尼亚州森尼韦尔的分子装置有限责任公司(MolecularDevicesLLC,Sunnyvale,CA,USA)。
将WSU-DLCL2悬浮细胞维持在生长培养基(补充有10％v/v热灭活胎牛血清的RPMI1640)中并且在37℃下在5％CO2下培养。在分析条件下，在37℃下在5％CO2下在分析培养基(补充有20％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI1640)中孵育细胞。
为了评定化合物对WSU-DLCL2细胞系的增殖的作用，将呈指数生长的细胞以1250个细胞/毫升的密度在最终体积50μl的分析培养基中接种于384孔白色不透明培养板中。化合物来源培养板通过在DMSO中执行一式三份九点3倍连续稀释来制备，以10mM开始(分析中化合物的最终最高浓度是20μM，并且DMSO是0.2％)。将来自化合物储备液培养板的100nL等分试样添加到细胞培养板中的其对应孔中。100％抑制对照由用200nM最终浓度的星形孢菌素处理的细胞组成，并且0％抑制对照由DMSO处理的细胞组成。添加化合物后，在37℃、5％CO2、相对湿度>90％下孵育分析培养板6天。通过量化细胞培养物中存在的ATP，将35μl试剂添加到细胞培养板中来测量细胞存活率。在SpectraMaxM5中读取发光。抑制细胞存活率50％的浓度使用归一化剂量反应曲线的4参数拟合来测定。
以引用的方式并入
本文中提到的专利文件和科学文章中的每一个的全部公开内容以引用的方式并入用于所有目的。
本文中引用的所有出版物和专利文件全以引用的方式并入本文中，如同每个所述出版物或文件特定地并且单独地指出以引用的方式并入本文中。出版物和专利文件的引用不打算承认任一个是相关现有技术，它也不构成对相关现有技术的内容或日期的任何承认。现在正借助于书面说明描述本发明，本领域的技术人员将认识到，本发明可以按各种实施例实践并且以上描述和以上实例是出于说明的目的并且不是以下权利要求书的限制。
等效物
可以在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，以其它特定形式实施本发明。因此，前述实施例被视为在所有方面都是说明性的，而不是对本文中所述的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是通过上述说明来指定的，并且打算将在所述权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化全涵盖在其中。

Claims (34)

1.一种用于治疗或缓解受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，包含向有需要的受试者投与治疗有效量的EZH2抑制剂，其中所述受试者患有选自由以下组成的群组的癌症：脑和中枢神经系统癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰脏癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、乳癌以及前列腺癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述SWI/SNF相关癌症的特征在于所述SWI/SNF复合物或所述SWI/SNF复合物的一或多种组分的降低表达和/或功能缺失。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的群组的癌症：成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤和非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述一或多种组分选自由以下组成的群组：SNF5、ATRX和ARID1A。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述功能缺失是由点突变、缺失和/或插入产生的功能缺失突变引起的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有SNF5的缺失。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有选自由以下组成的群组的ATRX突变：天冬酰胺(N)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置688处的野生型残基赖氨酸(K)(K688N)和异亮氨酸(I)取代在SEQIDNO:5的氨基酸位置366处的野生型残基蛋氨酸(M)(M366I)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有选自由以下组成的群组的ARID1A突变：在SEQIDNO:11的氨基酸位置884处的野生型残基半胱氨酸(C)的无义突变(C884*)；赖氨酸(K)取代在氨基酸位置966处的野生型残基谷氨酸(E)(E966K)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1411处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1411*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1720处在野生型残基苯丙氨酸(F)处的移码突变(F1720fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)之后的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1874处在野生型残基半胱氨酸(C)处的移码突变(C1874fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1957处的野生型残基天冬氨酸(D)(D1957E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1430处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1430*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1721处在野生型残基精氨酸(R)处的移码突变(R1721fs)；谷氨酸(E)取代在氨基酸位置1255处的野生型残基甘氨酸(G)(G1255E)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置284处的野生型残基甘氨酸(G)的移码突变(G284fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1722处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1722*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置274处在野生型残基蛋氨酸(M)处的移码突变(M274fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1847处在野生型残基甘氨酸(G)处的移码突变(G1847fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置559处在野生型残基P处的移码突变(P559fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1276处的野生型残基精氨酸(R)的无义突变(R1276*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2176处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q2176fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置203处在野生型残基组氨酸(H)处的移码突变(H203fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置591处在野生型残基丙氨酸(A)处的移码突变(A591fs)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置1322处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q1322*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置2264处的野生型残基丝氨酸(S)的无义突变(S2264*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置586处的野生型残基谷氨酰胺(Q)的无义突变(Q586*)；在SEQIDNO:11的氨基酸位置548处在野生型残基谷氨酰胺(Q)处的移码突变(Q548fs)；以及在SEQIDNO:11的氨基酸位置756处在野生型残基天冬酰胺(N)处的移码突变(N756fs)。
9.一种治疗或缓解有需要的受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，包含：
a.测定从所述受试者获得的样品中的至少一个选自由神经元分化基因、细胞周期抑制基因和肿瘤遏制基因组成的群组的基因的表达水平；
b.选择在步骤a中的至少一种基因的表达水平降低的受试者；以及
c.向在步骤b中所选择的受试者投与有效量的EZH2抑制剂，由此治疗或缓解所述受试者的癌症症状。
10.一种治疗或缓解有需要的受试者的SWI/SNF相关癌症的症状的方法，包含：
a.测定从所述受试者获得的样品中的至少一个选自由刺猬路径基因、myc路径基因和组蛋白甲基转移酶基因组成的群组的基因的表达水平；
b.选择在步骤a中的至少一种基因的表达水平增加的受试者；以及
c.向在步骤b中所选择的受试者投与有效量的EZH2抑制剂，由此治疗或缓解所述受试者的癌症症状。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤和非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤和非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述神经元分化基因是CD133、DOCK4或PTPRK。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞周期抑制基因是CKDN1A或CDKN2A。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤遏制基因是BIN1。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述刺猬路径基因是GLI1或PTCH1。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述myc路径基因是MYC。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶基因是EZH2。
19.一种诱导神经元分化、细胞周期抑制或肿瘤遏制的方法，包含使细胞与EZH2抑制剂接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述EZH2抑制剂的量足以增加至少一个选自由CD133、DOCK4、PTPRK、CKDN1A、CDKN2A和BIN1组成的群组的基因的表达。
21.一种抑制刺猬信号传导的方法，包含使细胞与EZH2抑制剂接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述EZH2抑制剂的量足以降低GLI1和/或PTCH1的表达。
23.一种诱导基因表达的方法，包含使细胞与EZH2抑制剂接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述EZH2抑制剂的量足以诱导神经元分化、细胞周期抑制和/或肿瘤遏制。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述基因选自由以下组成的群组：CD133、DOCK4、PTPRK、CKDN1A、CKDN2A和BIN1。
26.一种抑制基因表达的方法，包含使细胞与EZH2抑制剂接触。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述EZH2抑制剂的量足以抑制刺猬信号传导。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述基因是GLI1或PTCH1。
29.根据权利要求19到28中任一项所述的方法，其中所述细胞包含SNF5、ARID1A、ATRX和/或所述SWI/SNF复合物的组分的功能缺失。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述功能缺失是由SNF5的缺失引起的。
31.根据权利要求19到28中任一项所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：成神经管细胞瘤、恶性横纹肌样肿瘤和非典型畸胎样横纹肌样肿瘤。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述EZH2抑制剂是：
或其医药学上可接受的盐。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述EZH2抑制剂是：
或其医药学上可接受的盐。
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