CN111773387A - 一种通过改变bin1剪切体比例改善心脏横管结构的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过改变BIN1剪切体比例改善心脏横管结构的方法。本发明提供了改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11‑组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质在制备如下1)或2)所示产品中的应用：1)改善动物心脏横管结构产品；2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如的心衰、心率失常等)产品；本发明的实验证明了，大鼠心脏中主要存在的4种BIN1剪切体，不同BIN1剪切体功能不同，通过过表达剪切体(Bin1或Bin1+17)，改变BIN1/11‑和BIN1/11+组的相对含量，可显著改善心肌细胞横管结构。

Description

一种通过改变BIN1剪切体比例改善心脏横管结构的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过改变BIN1剪切体比例改善心脏横管结构的方法。

背景技术

人体的各种功能都需要靠心脏的正常泵血来维系血氧供应。心肌细胞动作电位沿横管传入细胞内部，因此横管在心肌兴奋收缩耦联中发挥重要作用。横管系统的完整性是心肌兴奋收缩耦联的结构保障。心衰细胞横管紊乱，兴奋收缩耦联效率下降。因此，研究心肌细胞横管的调控机制对人类健康具有重要意义。

大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种成熟mRNA分子，因而只翻译成一种蛋白质。但有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接)。基因的可变剪切在生命活动中发挥重要作用Amphiphysin 2蛋白家族中的BIN1基因有众多剪切体。BIN1基因含有20个外显子，其中外显子7、11、12、13、14、15、16和17共8个外显子存在可变剪切。在不同的组织和细胞中，BIN1基因发生可变剪切的外显子并不一样，如在神经系统中，外显子7和13是BIN1基因发生可变剪切的主要外显子，在肿瘤细胞中，外显子13和17是BIN1基因发生可变剪切的主要外显子。

发明内容

本发明的一个目的是提供改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质的用途。

本发明提供的改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质在制备如下A1)或A2)所示产品中的应用：

或本发明提供的改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下A1)或A2)所示产品中的应用：

A1)改善动物心脏横管结构产品；

A2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如心衰、心率失常等)产品；

所述BIN1/11-组剪切体为不含有BINI基因外显子11的剪切体组；

所述BIN1/11+组剪切体为含有BINI基因外显子11的剪切体组。

上述BINI基因外显子11序列为RKKSKLFSRLRRKKN。

BIN1基因genbank No.为XM_006254502(2014.8.7日提交)。

上述应用中，所述BIN1/11-组剪切体由mRNA剪切体Bin1和mRNA剪切体Bin1+17组成；

所述BIN1/11+组剪切体由mRNA剪切体Bin1+11和mRNA剪切体Bin1+11+17组成；

在本发明的实施例中，

所述mRNA剪切体Bin1的核苷酸序列为序列表中序列1，编码Bin1亚型；

所述mRNA剪切体Bin1+11的核苷酸序列为序列表中序列2，编码Bin1+11亚型；

所述mRNA剪切体Bin1+17的核苷酸序列为序列表中序列3，编码Bin1+17亚型；

所述mRNA剪切体Bin1+11+17核苷酸序列为序列表中序列4，编码1+11+17亚型。

上述应用中，所述改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质，或所述改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质均为提高动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组中任一剪切体的mRNA表达量的物质。

上述应用中，所述物质为提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质或提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量。在本发明的实施例中，该物质为过表达Bin1的重组载体，具体为pEGFP-Bin1载体。

上述应用中，所述物质为提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质或提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质。在本发明的实施例中，该物质过表达Bin1+17的重组载体，具体为表达GFP-Bin1+17的腺病毒载体。

提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质在制备如下B1)或B2)所示产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下B1)或B2)所示产品中的应用也是本发明保护的范围；

B1)改善动物心脏横管结构产品；

B2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如的心衰、心率失常等)产品。

上述提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质在制备如下C1)或C2)所示产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下C1)或C2)所示产品中的应用也是本发明保护的范围；

C1)改善动物心脏横管结构产品；

C2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如的心衰、心率失常等)产品。

上述提高BIN1/11-组任一种剪切体mRNA表达量或其编码亚型含量具体为过表达该剪切体后样品中该剪切体mRNA表达量或其编码亚型含量高于未过表达处理的样品中对应量，且BIN1/11+组任一种剪切体mRNA表达量或其编码亚型含量保持不变。

上述应用中，在本发明的实施例中，所述动物为小鼠或大鼠。

BIN1基因外显子11或含有BIN1基因外显子11的BIN1剪切体在制备如下D1)-D3)任一一种产品中的应用：

D1)改善心脏横管结构产品；

D2)促进心肌细胞形成横管结构产品；

D3)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如的心衰、心率失常等)产品。

BINI基因外显子11序列为RKKSKLFSRLRRKKN。

含有BIN1基因外显子11的BIN1剪切体为BIN1/11+组剪切体，具体为mRNA剪切体Bin1+11或mRNA剪切体Bin1+11+17。

本发明还有一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其为上述应用中的改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质；

或，本发明提供的产品，其为上述应用中改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质；

或，本发明提供的产品，其为如下1)-4)任一物质：

1)上述提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质；

2)上述提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量的物质；

3)上述提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质；

4)上述提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质；

所述产品为如下E1)-E3)任一种产品中的应用：

E1)改善心脏横管结构产品；

E2)促进心肌细胞形成横管结构产品；

E3)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病(具体如的心衰、心率失常等)产品。

上述应用中，所述改善动物心脏横管结构具体体现在如下至少一种：

1)促进动物心脏或心肌细胞形成横管结构；

2)增强动物心脏或心肌细胞中横管结构规律性；

3)使动物心脏或心肌细胞横管的横向成分比例增加和/或纵向成分比例减少；

4)逆转体外培养心肌细胞的横管系统重塑或增大心肌细胞膜上钙电流。

本发明的实验证明了，大鼠心脏中主要存在的4种BIN1剪切体，不同BIN1剪切体功能不同，通过过表达剪切体(Bin1或Bin1+17)，改变BIN1/11-和BIN1/11+组的相对含量，可显著改善心肌细胞横管结构。

附图说明

图1为大鼠心脏中BIN1剪切体。A，BIN1基因结构模式图(仅标出外显子)，不同的方框代表不同的外显子，方框里面的数字代表外显子数目，方框下面的数字为每个外显子所含有的核苷酸数目；B，含有外显子11的BIN1剪切体在骨骼肌、心肌以及脑组织中的表达。

图2为BIN1剪切体在大鼠心肌细胞的功能及定位。A，不含有外显子11的BIN1剪切体(uBIN1)编码的蛋白与α-actinin的共定位。B，含有外显子11的BIN1剪切体(pBIN1)编码的蛋白在细胞内可以诱导成管，形成网络结构。标尺为10um。。

图3为外显子11所编码的氨基酸残基可以抑制BIN1的SH3结构域在Z线的定位，右侧曲线图为相应荧光图中白色框内BIN1各种剪切体(绿色上曲线)与α-actinin(红色下曲线)荧光强度空间分布。

图4为成年大鼠心肌缺血组织中BIN1剪切体及MBNL1的变化情况。

图5为体外培养过程中成年大鼠心肌细胞Bin1剪切体及MBNL1发生变化。

图6为Bin1剪切体过表达转基因大鼠构建及横管结构检测。a，利用crisper-cas9技术将Bin1插入rRosa位点，通过与Myhc6-cre-ERT大鼠杂交，从而实现时间以及心脏特异性Bin1过表达；b，转基因成年大鼠连续注射他莫昔芬5天(剂量为0.5mg/g)，第七天进行心梗手术，术后一周进行功能实验；c，Westernblot检测Bin1过表达水平。参照基因为GAPDH。d为c的统计结果，e为激光共聚焦成像检测心肌细胞横管结构，f,图像6e进行快速傅里叶变换。使用Student’s t test进行数据检验.**P<0.01。

图7为大鼠心脏过表达Bin1后，Bin1+17以及含有外显子11的BIN1剪切体cDNA表达量变化，GAPDH为对照基因。

图8为大鼠心肌细胞过表达Bin1+17后，Bin1以及含有外显子11的BIN1剪切体cDNA表达量变化，GAPDH为对照基因。

图9为过表达Bin1+17可以阻止体外培养过程中成年大鼠心肌细胞横管系统的退化。A，过表达的Bin1+17可以使心肌细胞横管结构改善；B，为A的统计图，过表达Bin1+17可以使横管的横向组分增加，横管的纵向组分减少。每组n>20个细胞，分别来自3只动物。使用student’s t-检验：*，p<0.05表明差异显著。标尺为10μm。

图10为总BIN1的mRNA拷贝数标曲(A)和BIN1/11+组mRNA剪切体拷贝标曲(B)，其中横坐标的质粒为pEGFP-Bin1+1。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中部分材料的获得和实验方法如下：

1、成年大鼠心肌细胞分离与培养方法，具体实验方法参考文献：Zhou YY,et al，Culture and Adenoviral Infection of Adult Mouse Cardiac Myocytes:Methods forCellular Genetic Physiology.Am J Physiol Heart Circ Physiol Actions.2000 Jul；279(1):H429-36

2、新生大鼠心肌细胞(又称为乳鼠心肌细胞)分离方法，具体实验方法参考文献：du PréBC,et al.Neonatal Rat Cardiomyocytes as an in Vitro Model for CircadianRhythms in the Heart.J Mol Cell Cardiol Actions.2017 Nov；112:58-63

3、大鼠心肌缺血模型的建立方法，具体实验方法参考文献：Srikanth G.etal.Establishment of a rat model of myocardial infarction with a high survivalrate:A suitable model for evaluation of efficacy of stem cell therapy.Journalof Stem Cells&Regenerative Medicine 2009,5(1),30-36.

4、细胞免疫荧光成像技术。具体实验方法参考文献：Huang N,etal.Hierarchical assembly of centriole subdistal appendages via centrosomebinding proteins CCDC120 and CCDC68.Nature Communications 2017,8,15057.参数如下，一抗:α-actinin(sigma，1:400)4℃孵育过夜；二抗:Dylight 649标记的羊抗鼠二抗(abcam,1：200).

5、包埋前免疫电镜技术的实验方法，具体实验方法参考文献：Huang N,etal.Hierarchical assembly of centriole subdistal appendages via centrosomebinding proteins CCDC120 and CCDC68.Nature Communications 2017,8,15057.

一抗:anti-pBIN1(1:50)；二抗:银增强胶体金二抗(HQsilver,1：100).

7、实验中所用到的引物见下表：

根据Primer Premier 5设计引物，根据大鼠BIN1(genbank No.为XM_006254502，2014.8.7日提交)、MBNL1(genbank No.为NM_001191566)及GAPDH(genbank No.为NM_017008)序列设计引物如表1所示。

表1实验引物表

实施例1、心肌细胞中Bin1剪切体类型的发现

一、大鼠心脏中BIN1剪切体类型的鉴定

通过提取大鼠心脏组织的RNA，逆转录成cDNA，然后从BIN1基因第1个和第20个外显子设计引物，之后进行PCR，从而获取大鼠心脏组织中所有Bin1剪切体的PCR混合产物。接着通过T-A克隆的方法将BIN1剪切体的PCR混合产物连入pEASY-T1质粒载体中，转化大肠杆菌。然后挑取200个含有BIN1剪切体的大肠杆菌菌落，通过测序的方法鉴定出了大鼠心脏组织中BIN1剪切体的类型。

在大鼠心脏中鉴定出了6种BIN1剪切体类型：Bin1(1207bp)、Bin1+11(1252bp)、Bin1+13(1336bp)、Bin1+17(1279bp)、Bin1+11+17(1324bp)和Bin1+13+17(1408bp)，其中发生可变剪切的是中间的外显子11、13和17。

这些BIN1剪切体的丰度从高到低排列依次是：Bin1(58％)、Bin1+11(19％)、Bin1+11+17(15％)、Bin1+17(5％)、Bin1+13+17(2％)和Bin1+13(1％)。

由于Bin1+13+17(2％)和Bin1+13(1％)丰度少，因此后期只研究其他4种剪切体。

mRNA剪切体Bin1的核苷酸序列为序列表中序列1；

mRNA剪切体Bin1+11的核苷酸序列为序列表中序列2；

mRNA剪切体Bin1+17的核苷酸序列为序列表中序列3；

mRNA剪切体Bin1+11+17的核苷酸序列为序列表中序列4；

从上述可以看出，这4种剪切体可根据是否含有BIN1基因外显子11划分为2组(图1A)：

BIN1/11-组(不含外显子11)：由mRNA剪切体Bin1和mRNA剪切体Bin1+17组成；

BIN1/11+组(含有外显子11)：由mRNA剪切体Bin1+11和mRNA剪切体Bin1+11+17组成。

二、pBIN1定位在心肌细胞横管上

上述一表明BIN1外显子11是用于区分BIN1/11-组和BIN1/11+组的关键外显子，因此对该外显子功能进行研究。

通过合成BIN1外显子11编码的氨基酸残基-RKKSKLFSRLRRKKN，并用该短肽免疫兔子，获得BIN1外显子11的特异性抗体(效价为1:1000)。

制备成年大鼠心肌细胞，通过包埋前免疫电镜技术研究了含有外显子11的Bin1剪切体的在心肌细胞内的精确定位。

结果如图1B，含有外显子11的BIN1剪切体(pBIN1)主要分布在心肌细胞的横管结构上。由于外显子11分布在心肌细胞的横管结构上，因此，含有外显子11的Bin1剪切体对横管的形成可能有重要作用。

三、不同Bin1剪切体的功能

将大鼠心肌细胞中丰度较高的前四种Bin1剪切体(Bin1、Bin1+11、Bin1+11+17和Bin1+17)构建到真核表达载体pEGFP-C1中，通过观察绿色荧光蛋白定位及细胞形态来反映不同Bin1剪切体的定位，同时检测其对心肌细胞内部结构和功能的影响，具体方法如下：

1、表达剪切体的重组载体的构建

表达Bin1剪切体的重组载体pEGFP-Bin1为将序列1所示的Bin1剪切体的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1(Life science market,PVT1205)的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体，该载体表达融合蛋白Bin1-eGFP。

表达Bin1+11剪切体的重组载体pEGFP-Bin1+11为将序列2所示的Bin1+11剪切体的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体，该载体表达融合蛋白Bin1+11-eGFP。

表达Bin1+17剪切体的重组载体pEGFP-Bin1+17为将序列3所示的Bin1+17剪切体的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体，该载体表达融合蛋白Bin1+17-eGFP。

表达Bin1+11+17剪切体的重组载体pEGFP-Bin1+11+17为将序列4所示的Bin1+11+17剪切体的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体，该载体表达融合蛋白Bin1+11+17-eGFP。

2、转BIN1剪切体心肌细胞的获得

将上述重组载体pEGFP-Bin1、pEGFP-Bin1+11、pEGFP-Bin1+11+17和pEGFP-Bin1+17分别转入新生大鼠心肌细胞中，得到转pEGFP-Bin1心肌细胞、转pEGFP-Bin1+11心肌细胞、转pEGFP-Bin1+11+17心肌细胞和转pEGFP-Bin1+17心肌细胞。

3、绿色荧光蛋白定位及细胞形态

用免疫荧光成像技术检测转pEGFP-Bin1心肌细胞、转pEGFP-Bin1+11心肌细胞、转pEGFP-Bin1+11+17心肌细胞和转pEGFP-Bin1+17心肌细胞，且用a-actinin作为一抗，用于研究不同BIN1剪切体的功能。

结果如图2所示，mRNA剪切体Bin1表达的蛋白和Bin1+17表达的蛋白与新生大鼠心肌细胞Z线上蛋白α-actinin有很好的共定位，但是未形成横管结构(见图2A)；而mRNA剪切体Bin1+11表达的蛋白和mRNA剪切体Bin1+11+17表达的蛋白与a-actinin没有共定位，但是形成横管结构(网络结构，见图2B)。

根据2组剪切体结果比较可以看出，BIN1/11+组的剪切体可以使心肌细胞内形成管状的网络结构(横管结构)，而BIN1/11-组的剪切体不能诱导新生大鼠细胞膜内陷形成网络结构(横管结构)。

四、外显子11编码的氨基酸残基抑制Bin1的SH3结构域在Z线上定位

1、融合质粒的制备

表达外显子11和SH3结构域的融合质粒为将序列5所示的表达外显子11和SH3结构域的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体。

表达SH3结构域的融合质粒为将序列5第64位到第384位核苷酸所示的表达SH3结构域的核苷酸序列替换真核表达载体pEGFP-C1的BspeI和BamHI酶切位点之间的片段得到的载体。

2、转染乳鼠心肌细胞

将上述融合质粒分别转染乳鼠心肌细胞，得到表达外显子11和SH3结构域的转基因乳鼠心肌细胞和表达SH3结构域的转基因乳鼠心肌细胞。

3、细胞免疫荧光成像技术

用细胞免疫荧光成像技术(一抗为α-actinin抗体)检测上述2得到的表达外显子11和SH3结构域的转基因乳鼠心肌细胞(Exon11-linker-SH3)和表达SH3结构域的转基因乳鼠心肌细胞(SH3)。

结果如图3所示，A，在乳鼠心肌细胞内，SH3蛋白可以定位到Z线上；B，外显子11编码的氨基酸残基和SH3的融合蛋白不能定位到Z线上。

这一结果说明SH3结构域是介导Bin1剪切体编码亚型和Bin1+17剪切体编码亚型定位到Z线的主要结构域，而外显子11所编码的碱性氨基酸残基可能通过蛋白质三级结构上的相互作用，阻碍了Bin1+11剪切体编码亚型和Bin1+11+17剪切体编码亚型通过SH3结构域与Z线上相关蛋白的结合。

五、大鼠心肌缺血组织中不同BIN1剪切体及MBNL1的变化

以往研究发现，在心衰等一些病理情况下，心肌细胞横管系统出现重塑，从而引起横管排列紊乱，进而引起心肌细胞兴奋收缩耦联功能障碍。为了进一步研究BIN1和横管系统稳定性的关系，研究了心肌缺血引起的大鼠横管结构重塑模型中BIN1剪切体的变化情况，具体如下：

去除大鼠心肌缺血模型心梗大鼠左冠状动脉左前降支结扎下梗死的心肌组织，取剩下的心肌组织提取RNA(心梗组)；

对照组大鼠(正常Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，成年)取同样区域的心肌组织RNA(假手术组)；

将上述2中RNA均反转录得到cDNA作为待测样品，进而通过绝对定量PCR技术(具体方法参见如下文献Arabkari V,Clancy E,Dwyer RM,Kerin MJ,Kalinina O,Holian E,Newell J,Smith TJ.Relative and Absolute Expression Analysis of MicroRNAsAssociated with Luminal A Breast Cancer-A Comparison.Pathol Oncol Res.2020Apr；26(2):833-844.，标曲如图10A和图10B所示)研究了心肌缺血组织中不同BIN1剪切体的变化情况。

总BIN1的mRNA拷贝数的扩增正反向引物为表1中的总BIN1正向引物和总BIN1反向引物；

BIN1/11+组mRNA剪切体拷贝数的扩增正反向引物为表1中的pBIN1正向引物和pBIN1反向引物。

BIN1/11-的mRNA拷贝数由总BIN1的mRNA拷贝数减去BIN1/11+的mRNA拷贝数得到。

结果如图4所示，A，心肌缺血组织中(MI)总BIN1mRNA拷贝数没有明显变化；B，心肌缺血组织中(MI)含有外显子11的Bin1剪切体(pBIN1，BIN1/11+组)mRNA拷贝数增多；C，心肌缺血组织中(MI)不含外显子11的Bin1剪切体(BIN1/11-组)mRNA拷贝数减少。对照组n＝3，心肌缺血组n＝4。使用student’s t-检验：*，p<0.05表明差异显著。

六、体外培养的成年大鼠心肌细胞中不同Bin1剪切体的变化

体外培养的成年大鼠心肌细胞横管退化。将成年大鼠心肌细胞体外培养48小时，通过上述六种绝对定量PCR技术检测细胞中总BIN1及Bin1剪切体的拷贝数变化情况；

结果如图5所示，A，心肌细胞中总BIN1mRNA拷贝数随着培养时间减少；B，心肌细胞中含有外显子11的Bin1剪切体(BIN1/11+)mRNA拷贝数随着培养时间增多；C，心肌细胞中不含外显子11的Bin1剪切体(BIN1/11-)mRNA拷贝数随着培养时间减少。每组n＝3。使用One-Way ANOVA检验：*，p<0.05表明差异显著。可以看出，和急性分离得到的成年大鼠心肌细胞(0h)相比，培养48小时的成年大鼠心肌细胞中总BIN1的mRNA拷贝数减少，BIN1/11+的mRNA拷贝数增加，而BIN1/11-的mRNA拷贝数减少。

七、MBNL1在体外培养的成年大鼠心肌细胞及缺血组织中的变化情况

MBNL1是调节BIN1 mRNA可变剪切重要调节因子。利用相对定量荧光PCR，研究缺血的心肌组织和退化心肌细胞中MBNL1的变化情况

MBNL1基因的扩增引物由表1所示的MBNL1正向引物和MBNL1反向引物组成；

GAPDH基因的扩增引物由表1所示的GAPDH正向引物和GAPDH反向引物组成。

图4D，心肌缺血组织中MBNL1mRNA相对表达量，对照组n＝3，心肌缺血组n＝4，使用student’s t-检验：**，p<0.01，可以看出，心肌缺血组比对照组表达量增多，差异很显著。

图5D，大鼠心肌细胞中MBNL1基因mRNA相对表达量，每组n＝3，使用One-Way ANOVA检验：*，p<0.05，可以看出，随着培养时间增多，MBNL1的mRNA表达增加。

上述结果表明，MBNL1的mRNA水平均上升，MBNL1表达量的增加可能导致MBNL1和Bin1的pre-mRNA外显子11相互作用增多，从而影响了BIN1外显子11的剪切，进而引起BIN1/11+和BIN1/11-两类Bin1剪切体之间平衡的变化。

实施例2、改变BIN1各种剪切体比例改善心脏横管结构的方法

根据实施例1中证明可以看出，BIN1/11+和BIN1/11-两类Bin1剪切体对于心脏横管结构影响不同，因此，是否可以通过调节BIN1/11-组中各个剪切体mRNA表达量或其编码亚型的含量改善心脏横管结构，具体如下：

一、过表达mRNA剪切体Bin1且保持其他3种mRNA剪切体不变

1、目的转基因大鼠的制备

委托北京百奥塞图基因生物技术有限公司利用pEGFP-Bin1载体制备他莫昔芬可诱导的心脏特异性mRNA剪切体Bin1过表达的转基因大鼠。

与这批剪切体Bin1过表达的转基因大鼠对应的野生型大鼠，其与转基因大鼠相比，仅Bin1-eGFP过表达，其余不变。

2、转基因大鼠Westernblot验证Bin1过表达水平

如图6a和6b所示，Bin1过表达大鼠为他莫昔芬可诱导型大鼠。将上述Bin1过表达的转基因大鼠(BOE)和野生型大鼠(WT)注射他莫昔芬(剂量:每克老鼠体重注射0.5mg他莫昔芬)，每天注射1次，注射5天；每种大鼠大于5只。第七天对大鼠进行心梗手术，术后七天进行Bin1表达量检测及细胞横管结构检测。

提取注射5天后各个大鼠的心肌组织蛋白，Westernblot检测(一抗为anti-eGFP(abcam),anti-Bin1(Sigma),anti-GAPDH(abcam)，工作浓度为1μg/ml；二抗二抗1：1000稀释；HRP标记的GAPDH持家基因抗体1：20000稀释)。

结果如图6c所示，图6c的统计结果如图6d所示，可以看出，Bin1过表达的转基因大鼠(BOE)中Bin1-eGFP过表达，他莫昔芬可以诱导转基因大鼠心肌细胞中Bin1的过表达；与此同时，全BIN1蛋白表达量有增高趋势，但没有显著差异。

3、剪切体Bin1表达量提高且保持其他3种mRNA剪切体不变检测

提取上述2处理后注射5天后各个大鼠的心肌组织RNA，反转录得到cDNA，以cDNA作为模板，用引物进行相对定量PCR扩增；检测剪切体Bin1的mRNA表达量、剪切体Bin1+17的mRNA表达量、剪切体Bin1+11的mRNA表达量和剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量；以GAPDH基因为内参，GAPDH基因的扩增引物由表1所示的GAPDH正向引物和GAPDH反向引物组成。

剪切体Bin1+11的mRNA表达量和剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量可通过检测11外显子的表达量来判断，设计引物为根据大鼠BIN1(genbank No.为XM_006254502)基因设计，为表1中BIN1/11+正向引物和BIN1/11+反向引物。

上述检测剪切体Bin1的mRNA表达量的引物根据大鼠BIN1(genbank No.为XM_006254502)基因设计，为表1的Bin1正向引物和Bin1反向引物；

上述检测剪切体Bin1+17的mRNA表达量的引物可通过检测17外显子的表达量来判断，设计引物为表1的Bin1+17正向引物和Bin1+17反向引物；

结果如图7所示，左图为Bin1的mRNA表达量检测结果，中间图为含有外显子11剪切体的表达量，右图为剪切体Bin1+17的mRNA表达量的图，可以看出，与野生型大鼠相比，Bin1过表达的转基因大鼠(BOE)的剪切体Bin1的mRNA表达量明显提高，含有外显子11的剪切体表达不变(即剪切体Bin1+11的mRNA表达量和剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量不变)，剪切体Bin1+17的mRNA表达量变化不大。

4、表型观察

上述2处理后注射5天后各个大鼠的心梗手术后分离心肌细胞，细胞膜染料染色后，通过激光共聚焦成像检测心肌细胞横管结构。

结果如图6e和6f(对图像6e进行快速傅里叶变换，得到图像中横管空间分布的规律性)所示，可以看出，Bin1过表达的转基因大鼠(BOE)心肌细胞横管结构的规律性变强。这说明，提高BIN1/11-中的Bin1含量后可显著改善心肌细胞横管的结构。

二、过表达mRNA剪切体Bin1+17且保持其他3种mRNA剪切体不变

1、目的转基因细胞的制备

表达GFP-Bin1+17的腺病毒载体将序列6所示的GFP-Bin1+17的核苷酸序列替换真核表达载体pTOPO-Gateway(名称，thermofisherK240020)notI和kpnI酶切位点之间的片段得到的载体。

将表达GFP-Bin1+17的腺病毒载体转入成年大鼠心肌细胞，得到目的转基因细胞。

表达GFP的腺病毒载体将序列6第1位到第711位所示GFP序列替换真核表达载体pTOPO-Gateway(名称，thermofisherK240020)notI和kpnI酶切位点之间的片段得到的载体。

将表达GFP的腺病毒载体转入成年大鼠心肌细胞中，得到对照转基因细胞。

乳鼠心肌细胞转染前4个小时，将培养基换成不含血清和抗生素的的opti-MEM对心肌细胞进行饥饿处理。使用lipo2000转染质粒，将2μg的表达GFP-Bin1+17的腺病毒载体和3μL的lipo2000分别稀释在200μL的opti-MEM中，室温静置5分钟后将其缓慢混匀，室温孵育30分钟后加入到培养基中。37℃孵育6个小时后将培养基换成正常DMEM(含10％FBS)培养基，转染24—48小时后收取细胞，进行下一步实验操作。

本实验中用到的腺病毒由北京本元正阳生物技术有限公司包装并纯化，感染成年大鼠心室肌细胞用量为MOI＝10，病毒感染12小时后对细胞换液，感染24-48小时后收取细胞，之后进行下一步实验操作。

2、转基因细胞中剪切体Bin1+17表达量的鉴定

提取目的转基因细胞(Bin1+17-过表达)和对照转基因细胞(GFP)RNA，反转录得到cDNA，以cDNA作为模板，用引物表的引物进行相对定量PCR扩增；检测剪切体Bin1+17表达量的mRNA表达量、剪切体Bin1+11的mRNA表达量、剪切体Bin1的mRNA表达量、剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量；以GAPDH基因为内参，GAPDH基因的扩增引物由表1所示的GAPDH正向引物和GAPDH反向引物组成。

上述检测剪切体Bin1+17的mRNA表达量可通过检测17外显子的表达量来判断，设计引物为表1的Bin1+17正向引物和Bin1+17反向引物；

剪切体Bin1+11的mRNA表达量和剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量可通过检测11外显子的表达量判断，设计引物为表1的BIN1/11+正向引物和BIN1/11+反向引物。

上述检测剪切体Bin1的mRNA表达量的引物根据大鼠BIN1(genbank No.为XM_006254502)基因设计，为表1的Bin1正向引物和Bin1反向引物；

结果如图8所示，左图为Bin 1+17的mRNA表达量检测结果，中间图为剪切体Bin1的mRNA表达量，右图为含有外显子11剪切体的表达量，可以看出，与对照转基因细胞(GFP)相比，目的转基因细胞(Bin1+17-过表达)过表达Bin1+17后，Bin1+17剪切体显著增加，含有外显子11的Bin1剪切体没有显著变化(即剪切体Bin1+11的mRNA表达量和剪切体Bin1+11+17的mRNA表达量不变),Bin1的mRNA表达量没有变化。

3、心肌细胞的横管系统观察

转染48小时目的转基因细胞，细胞膜染色后。利用激光共聚焦成像方法检测心肌细胞的横管系统。

根据参考文献(Jing Han,et al.Morphogenesis of T-tubules in heartcells:the role of junctophilin-2.Science China Life Sciencesvolume56,pages647-652(2013))中对横管横向成分和纵向成分进行测量。

结果如图9所示，A，过表达的Bin1+17可以定位到心肌细胞Z线上；B，过表达Bin1+17可以使横管的横向组分增加,过表达Bin1+17可以使横管的纵向组分减少。

因此，提高BIN1/11-中的Bin1+17含量后，可以使横管的横向组分增加,纵向组分减少。BIN1/11-在心肌细胞Z线上定位增加，从而可以使得BIN1/11+诱导形成的横管可以固定在Z线上或者Z线附近。

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>一种通过改变BIN1剪切体比例改善心脏横管结构的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggcagaga tggggagcaa gggggtgacg gcggggaaga tcgcaagcaa tgttcagaag 60

aagctgactc gagctcagga gaaggtcctg cagaaactgg ggaaggcgga tgaaacgaag 120

gatgagcagt tcgaacagtg cgtccagaat ttcaataagc agctgacaga gggcacccgg 180

ctgcagaagg atcttcggac ctacctggct tctgttaaag ccatgcacga agcctccaag 240

aagctgagtg agtgtctcca ggaggtgtat gagcctgagt ggcctggcag ggatgaagcg 300

aacaagatag cagagaacaa tgacctgcta tggatggact atcaccagaa gctggtggac 360

caggctctgc tgaccatgga tacctacctg ggccagttcc ctgatatcaa gtcacgcatt 420

gccaagcggg ggcggaagct ggtggactac gacagcgccc ggcaccacta tgagtctctt 480

caaaccgcca aaaagaagga tgaagccaaa attgccaagg cagaagagga gctcatcaaa 540

gcccagaagg tgttcgagga gatgaatgtg gacctgcagg aggagctgcc atccctgtgg 600

aacagccgtg tgggtttcta tgtcaacacg ttccagagca tcgcgggtct ggaggaaaac 660

ttccataaag agatgagtaa gctcaatcag aacctcaatg atgtcctggt cagcctagag 720

aagcaacacg ggagcaacac cttcacagtc aaggcccagc ccagtgacag cgcccctgaa 780

aaagggaaca agagcccttc acctcctcca gatggttccc ctgctgctac ccctgagatc 840

agagtgaacc atgagccaga gccggccagt ggggcatcgc ctggggctac catccccaag 900

tccccatctc agagctctct cccggctgtg gtggtggaga ccttctcagc aactgtgaat 960

ggcgccgtgg agggcagcac tacgactgga cgcttggatc tgcccccggg attcatgttc 1020

aaggtgcaag cccagcatga ttacacggcc actgacactg acgagctgca actcaaagct 1080

ggcgatgtgg tactggtgat ccccttccag aacccagagg agcaggatga aggctggctc 1140

atgggtgtga aggagagcga ctggaatcag cacaaggaac tggagaaatg ccgcggcgtc 1200

ttcccggaga atttcacaga gcgggtgcag tga 1233

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggcagaga tggggagcaa gggggtgacg gcggggaaga tcgcaagcaa tgttcagaag 60

aagctgactc gagctcagga gaaggtcctg cagaaactgg ggaaggcgga tgaaacgaag 120

gatgagcagt tcgaacagtg cgtccagaat ttcaataagc agctgacaga gggcacccgg 180

ctgcagaagg atcttcggac ctacctggct tctgttaaag ccatgcacga agcctccaag 240

aagctgagtg agtgtctcca ggaggtgtat gagcctgagt ggcctggcag ggatgaagcg 300

aacaagatag cagagaacaa tgacctgcta tggatggact atcaccagaa gctggtggac 360

caggctctgc tgaccatgga tacctacctg ggccagttcc ctgatatcaa gtcacgcatt 420

gccaagcggg ggcggaagct ggtggactac gacagcgccc ggcaccacta tgagtctctt 480

caaaccgcca aaaagaagga tgaagccaaa attgccaagg cagaagagga gctcatcaaa 540

gcccagaagg tgttcgagga gatgaatgtg gacctgcagg aggagctgcc atccctgtgg 600

aacagccgtg tgggtttcta tgtcaacacg ttccagagca tcgcgggtct ggaggaaaac 660

ttccataaag agatgagtaa gctcaatcag aacctcaatg atgtcctggt cagcctagag 720

aagcaacacg ggagcaacac cttcacagtc aaggcccagc ccagaaagaa aactaaactg 780

ttctcacggc tgcgcagaaa gaagaacagt gacagcgccc ctgaaaaagg gaacaagagc 840

ccttcacctc ctccagatgg ttcccctgct gctacccctg agatcagagt gaaccatgag 900

ccagagccgg ccagtggggc atcgcctggg gctaccatcc ccaagtcccc atctcagagc 960

tctctcccgg ctgtggtggt ggagaccttc tcagcaactg tgaatggcgc cgtggagggc 1020

agcactacga ctggacgctt ggatctgccc ccgggattca tgttcaaggt gcaagcccag 1080

catgattaca cggccactga cactgacgag ctgcaactca aagctggcga tgtggtactg 1140

gtgatcccct tccagaaccc agaggagcag gatgaaggct ggctcatggg tgtgaaggag 1200

agcgactgga atcagcacaa ggaactggag aaatgccgcg gcgtcttccc ggagaatttc 1260

acagagcggg tgcagtga 1278

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggcagaga tggggagcaa gggggtgacg gcggggaaga tcgcaagcaa tgttcagaag 60

aagctgactc gagctcagga gaaggtcctg cagaaactgg ggaaggcgga tgaaacgaag 120

gatgagcagt tcgaacagtg cgtccagaat ttcaataagc agctgacaga gggcacccgg 180

ctgcagaagg atcttcggac ctacctggct tctgttaaag ccatgcacga agcctccaag 240

aagctgagtg agtgtctcca ggaggtgtat gagcctgagt ggcctggcag ggatgaagcg 300

aacaagatag cagagaacaa tgacctgcta tggatggact atcaccagaa gctggtggac 360

caggctctgc tgaccatgga tacctacctg ggccagttcc ctgatatcaa gtcacgcatt 420

gccaagcggg ggcggaagct ggtggactac gacagcgccc ggcaccacta tgagtctctt 480

caaaccgcca aaaagaagga tgaagccaaa attgccaagg cagaagagga gctcatcaaa 540

gcccagaagg tgttcgagga gatgaatgtg gacctgcagg aggagctgcc atccctgtgg 600

aacagccgtg tgggtttcta tgtcaacacg ttccagagca tcgcgggtct ggaggaaaac 660

ttccataaag agatgagtaa gctcaatcag aacctcaatg atgtcctggt cagcctagag 720

aagcaacacg ggagcaacac cttcacagtc aaggcccagc ccagtgacag cgcccctgaa 780

aaagggaaca agagcccttc acctcctcca gatggttccc ctgctgctac ccctgagatc 840

agagtgaacc atgagccaga gccggccagt ggggcatcgc ctggggctac catccccaag 900

tccccatctc agccagcaga ggcctccgag gtggtgggtg gaacccagga gccaggggag 960

acagcagcca gtgaagcgac ctccagctct ctcccggctg tggtggtgga gaccttctca 1020

gcaactgtga atggcgccgt ggagggcagc actacgactg gacgcttgga tctgcccccg 1080

ggattcatgt tcaaggtgca agcccagcat gattacacgg ccactgacac tgacgagctg 1140

caactcaaag ctggcgatgt ggtactggtg atccccttcc agaacccaga ggagcaggat 1200

gaaggctggc tcatgggtgt gaaggagagc gactggaatc agcacaagga actggagaaa 1260

tgccgcggcg tcttcccgga gaatttcaca gagcgggtgc agtga 1305

<210> 4

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atggcagaga tggggagcaa gggggtgacg gcggggaaga tcgcaagcaa tgttcagaag 60

aagctgactc gagctcagga gaaggtcctg cagaaactgg ggaaggcgga tgaaacgaag 120

gatgagcagt tcgaacagtg cgtccagaat ttcaataagc agctgacaga gggcacccgg 180

ctgcagaagg atcttcggac ctacctggct tctgttaaag ccatgcacga agcctccaag 240

aagctgagtg agtgtctcca ggaggtgtat gagcctgagt ggcctggcag ggatgaagcg 300

aacaagatag cagagaacaa tgacctgcta tggatggact atcaccagaa gctggtggac 360

caggctctgc tgaccatgga tacctacctg ggccagttcc ctgatatcaa gtcacgcatt 420

gccaagcggg ggcggaagct ggtggactac gacagcgccc ggcaccacta tgagtctctt 480

caaaccgcca aaaagaagga tgaagccaaa attgccaagg cagaagagga gctcatcaaa 540

gcccagaagg tgttcgagga gatgaatgtg gacctgcagg aggagctgcc atccctgtgg 600

aacagccgtg tgggtttcta tgtcaacacg ttccagagca tcgcgggtct ggaggaaaac 660

ttccataaag agatgagtaa gctcaatcag aacctcaatg atgtcctggt cagcctagag 720

aagcaacacg ggagcaacac cttcacagtc aaggcccagc ccagaaagaa aactaaactg 780

ttctcacggc tgcgcagaaa gaagaacagt gacagcgccc ctgaaaaagg gaacaagagc 840

ccttcacctc ctccagatgg ttcccctgct gctacccctg agatcagagt gaaccatgag 900

ccagagccgg ccagtggggc atcgcctggg gctaccatcc ccaagtcccc atctcagcca 960

gcagaggcct ccgaggtggt gggtggaacc caggagccag gggagacagc agccagtgaa 1020

gcgacctcca gctctctccc ggctgtggtg gtggagacct tctcagcaac tgtgaatggc 1080

gccgtggagg gcagcactac gactggacgc ttggatctgc ccccgggatt catgttcaag 1140

gtgcaagccc agcatgatta cacggccact gacactgacg agctgcaact caaagctggc 1200

gatgtggtac tggtgatccc cttccagaac ccagaggagc aggatgaagg ctggctcatg 1260

ggtgtgaagg agagcgactg gaatcagcac aaggaactgg agaaatgccg cggcgtcttc 1320

ccggagaatt tcacagagcg ggtgcagtga 1350

<210> 5

<211> 384

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

agaaagaaaa ctaaactgtt ctcacggctg cgcagaaaga agaacggaag cggaggaagc 60

ggaagctctc tcccggctgt ggtggtggag accttctcag caactgtgaa tggcgccgtg 120

gagggcagca ctacgactgg acgcttggat ctgcccccgg gattcatgtt caaggtgcaa 180

gcccagcatg attacacggc cactgacact gacgagctgc aactcaaagc tggcgatgtg 240

gtactggtga tccccttcca gaacccagag gagcaggatg aaggctggct catgggtgtg 300

aaggagagcg actggaatca gcacaaggaa ctggagaaat gccgcggcgt cttcccggag 360

aatttcacag agcgggtgca gtga 384

<210> 6

<211> 2016

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gatggcagag 720

atggggagca agggggtgac ggcggggaag atcgcaagca atgttcagaa gaagctgact 780

cgagctcagg agaaggtcct gcagaaactg gggaaggcgg atgaaacgaa ggatgagcag 840

ttcgaacagt gcgtccagaa tttcaataag cagctgacag agggcacccg gctgcagaag 900

gatcttcgga cctacctggc ttctgttaaa gccatgcacg aagcctccaa gaagctgagt 960

gagtgtctcc aggaggtgta tgagcctgag tggcctggca gggatgaagc gaacaagata 1020

gcagagaaca atgacctgct atggatggac tatcaccaga agctggtgga ccaggctctg 1080

ctgaccatgg atacctacct gggccagttc cctgatatca agtcacgcat tgccaagcgg 1140

gggcggaagc tggtggacta cgacagcgcc cggcaccact atgagtctct tcaaaccgcc 1200

aaaaagaagg atgaagccaa aattgccaag gcagaagagg agctcatcaa agcccagaag 1260

gtgttcgagg agatgaatgt ggacctgcag gaggagctgc catccctgtg gaacagccgt 1320

gtgggtttct atgtcaacac gttccagagc atcgcgggtc tggaggaaaa cttccataaa 1380

gagatgagta agctcaatca gaacctcaat gatgtcctgg tcagcctaga gaagcaacac 1440

gggagcaaca ccttcacagt caaggcccag cccagtgaca gcgcccctga aaaagggaac 1500

aagagccctt cacctcctcc agatggttcc cctgctgcta cccctgagat cagagtgaac 1560

catgagccag agccggccag tggggcatcg cctggggcta ccatccccaa gtccccatct 1620

cagccagcag aggcctccga ggtggtgggt ggaacccagg agccagggga gacagcagcc 1680

agtgaagcga cctccagctc tctcccggct gtggtggtgg agaccttctc agcaactgtg 1740

aatggcgccg tggagggcag cactacgact ggacgcttgg atctgccccc gggattcatg 1800

ttcaaggtgc aagcccagca tgattacacg gccactgaca ctgacgagct gcaactcaaa 1860

gctggcgatg tggtactggt gatccccttc cagaacccag aggagcagga tgaaggctgg 1920

ctcatgggtg tgaaggagag cgactggaat cagcacaagg aactggagaa atgccgcggc 1980

gtcttcccgg agaatttcac agagcgggtg cagtga 2016

Claims (10)

1.改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体的表达量的物质在制备如下A1)或A2)所示产品中的应用：

或，改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下A1)或A2)所示产品中的应用：

A1)改善动物心脏横管结构产品；

A2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病产品；

所述uBIN1(BIN1/11-)组剪切体为不含有BINI基因外显子11的剪切体组；

所述BIN1/11+组剪切体为含有BINI基因外显子11的剪切体组。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述BIN1/11-组剪切体由mRNA剪切体Bin1和mRNA剪切体Bin1+17组成；

所述BIN1/11+组剪切体由mRNA剪切体Bin1+11和mRNA剪切体Bin1+11+17组成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质，或所述改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质均为提高动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组中任一剪切体的mRNA表达量的物质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述物质为提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质或提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述物质为提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质或提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质。

6.提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质在制备如下B1)或B2)所示产品中的应用；

或提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下B1)或B2)所示产品中的应用；

B1)改善动物心脏横管结构产品；

B2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病产品。

7.提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质在制备如下C1)或C2)所示产品中的应用；

或，提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质在制备如下C1)或C2)所示产品中的应用；

C1)改善动物心脏横管结构产品；

C2)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病产品。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：

所述动物为小鼠或大鼠。

9.BIN1基因外显子11或含有BIN1基因外显子11的BIN1剪切体在制备如下D1)-D3)任一一种产品中的应用：

D1)改善心脏横管结构产品；

D2)促进心肌细胞形成横管结构产品；

D3)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病产品。

10.一种产品，其为权利要求1-5中任一所述的应用中的改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体和BIN1/11+组剪切体表达量的物质；

或，一种产品，其为权利要求1-5中任一所述的应用中改变动物心脏或心肌细胞中BIN1/11-组剪切体编码亚型和BIN1/11+组剪切体编码亚型的含量的物质；

或，一种产品，其为如下a-d中任一种：

a)权利要求6或7中的提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体的mRNA表达量的物质；

b)权利要求6或7中的提高动物心脏或心肌细胞中Bin1剪切体编码亚型的含量的物质；

c)权利要求6或7中的提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体的mRNA表达量的物质；

d)权利要求6或7中的提高动物心脏或心肌细胞中Bin1+17剪切体编码亚型的含量的物质；

所述BIN1/11-组剪切体由mRNA剪切体Bin1和mRNA剪切体Bin1+17组成；

所述BIN1/11+组剪切体由mRNA剪切体Bin1+11和mRNA剪切体Bin1+11+17组成；

所述产品为如下E1)-E3)任一种产品中的应用：

E1)改善心脏横管结构产品；

E2)促进心肌细胞形成横管结构产品；

E3)治疗由心脏横管结构紊乱引发的心脏病产品。

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