KR20230156450A - 암을 치료하는 방법 - Google Patents

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KR20230156450A
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alkyl
tumor
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사라 케이 넛슨
나탈리 워홀릭
하이크 케일호크
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에피자임, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 암의 치료가 필요한 대상체에게 EZH2 저해제 화합물 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연구 또는 다른 비치료적 목적을 위한 이러한 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

암을 치료하는 방법{METHODS OF TREATING CANCER}
관련 출원
본 출원은 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/714,045호, 2013년 1월 31일자로 출원된 제61/758,972호, 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/714,140호, 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/714,145호, 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/780,703호 및 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/786,277호에 대한 우선권 및 유익을 주장한다. 이들 가출원 특허의 각각의 전문의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 암 치료 분야, 특히 SWI/SNF 복합체와 관련된 암(즉, SWI/SNF 매개 암)의 치료에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 SWI/SNF 복합체와 관련된 암의 증상을 치료, 완화, 예방, 감소 또는 달리 개선시키는 방법 및 조성물을 제공한다.
질환-연관 염색질-변형 효소(예를 들어, EZH2)는 증식성 장애, 대사 장애, 및 혈액 장애와 같은 질환에서 어떤 역할을 한다. 따라서, EZH2의 활성을 조절할 수 있는 소분자의 개발에 대한 필요가 있다.
본 발명은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여함으로써 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법을 제공하며, 대상체는 뇌 및 중추신경계암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가진다. 예를 들어, SWI/SNF-연관 암은 감소된 발현 및/또는 SWI/SNF 복합체의 기능상실 또는 SWI/SNF 복합체 중 하나 이상의 성분을 특징으로 한다.
예를 들어, 대상체는 수모세포종, 악성횡문근양종양 및 비정형 유기형/간상 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가진다.
예를 들어, 하나 이상의 성분은 SNF5, ATRX 및 ARID1A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 기능상실은 점 돌연변이, 결실, 및/또는 삽입으로부터 초래된 기능상실 돌연변이에 의해 야기된다.
예를 들어, 대상체는 SNF5의 결실을 가진다.
예를 들어, 대상체는 서열번호 5의 아미노산 위치 688에서 야생형 잔기 라이신(K)의 아스파라긴(N)으로의 치환(K688N), 및 서열번호 5의 아미노산 위치 366에서 야생형 잔기 메티오닌(M)의 아이소류신(I)으로의 치환(M366I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 ATRX의 돌연변이를 가진다.
예를 들어, 대상체는 서열번호 11의 아미노산 위치 884에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 넌센스 돌연변이(C884*), 아미노산 위치 966에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 라이신(K)으로의 치환(E966K), 서열번호 11의 아미노산 위치 1411에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q1411*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1720에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 틀 이동 돌연변이(frame shift mutation)(F1720fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G) 후의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1874에서 야생형 잔기 시스테인(C)에서의 틀 이동 돌연변이(C1874fs), 아미노산 위치 1957에서 야생형 잔기 아스파트산(D)의 글루탐산(E)으로의 치환(D1957E), 서열번호 11의 아미노산 위치 1430에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1430*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1721에서 야생형 잔기 알기닌(R)에서의 틀 이동 돌연변이(R1721fs), 아미노산 위치 1255에서 야생형 잔기 글라이신(G)의 글루탐산(E)으로의 치환(G1255E), 서열번호 11의 아미노산 위치 284에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G284fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1722에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1722*), 서열번호 11의 아미노산 위치 274에서 야생형 잔기 메티오닌(M)에서의 틀 이동 돌연변이(M274fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 559에서 야생형 잔기 P에서의 틀 이동 돌연변이(P559fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1276에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1276*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2176에서 야생형 잔기 글루타민(Q)에서의 틀 이동 돌연변이(Q2176fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 203에서 야생형 잔기 히스티딘(H)에서의 틀 이동 돌연변이(H203fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 591에서 야생형 잔기 알라닌(A)에서의 틀 이동 돌연변이(A591fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1322에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1322*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2264에서 야생형 잔기 세린(S)의 넌센스 돌연변이(S2264*), 서열번호 11의 아미노산 위치 586에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q586*), 서열번호 11의 아미노산 위치 548에서의 틀 이동 돌연변이(Q548fs), 및 서열번호 11의 아미노산 위치 756에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)에서의 틀 이동 돌연변이(N756fs)로 이루어진 군으로부터 선택된 ARID1A의 돌연변이를 가진다.
본 발명은 또한 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; (b) 단계 a에서의 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 (c) 단계 b에서 선택된 대상체에게 EZH2 저해제의 유효량을 투여함으로써 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화시키는 단계에 의해 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 헷지호그(hedgehog) 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; (b) 단계 a에서 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 (c) 단계 b에서 선택된 대상체에게 EZH2 저해제의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화시키는 단계에 의해 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다.
예를 들어, 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 또는 비정형 유기형 간상 종양일 수 있다.
예를 들어, 신경분화 유전자는 CD133, DOCK4 또는 PTPRK이다.
예를 들어, 세포주기 저해 유전자는 CKDN1A 또는 CDKN2A이다.
예를 들어, 종양 억제 유전자는 BIN1이다.
예를 들어, 헷지호그 경로 유전자는 GLI1 또는 PTCH1이다.
예를 들어, myc 경로 유전자는 MYC이다.
예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자는 EZH2이다.
본 발명은 또한 세포를 EZH2 저해제와 접촉시킴으로써 신경분화, 세포주기 저해 또는 종양억제를 유도하는 방법을 제공한다. EZH2 저해제는 CD133, DOCK4,PTPRK, CKDN1A,CDKN2A 및 BIN1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 EZH2 저해제와 접촉시킴으로써 헷지호그 신호처리를 저해하는 방법을 제공한다. EZH2 저해제는 GLI1 및/또는 PTCH1의 발현을 유도하기에 충분한 양일 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 EZH2 저해제와 접촉시킴으로써 유전자 발현을 유도하는 방법을 제공한다. EZH2 저해제는 신경분화, 세포주기 저해 및/또는 종양억제를 유도하기에 충분한 양일 수 있다. 예를 들어, 유전자는 CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CKDN2A 또는 BIN1일 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 EZH2 저해제와 접촉시킴으로써 유전자 발현을 저해하는 방법을 제공한다. EZH2 저해제는 헷지호그 신호처리를 저해하는데 충분한 양이다. 예를 들어, 유전자는 GLI1 또는 PTCH1일 수 있다.
예를 들어, 세포는 SNF5, ARID1A, ATRX, 및/또는 SWI/SNF 복합체의 성분의 기능상실을 가질 수 있다.
예를 들어, 기능상실은 SNF5의 결실에 의해 야기된다.
예를 들어, 세포는 암세포이다. 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 또는 비정형 유기형 간상 종양일 수 있다.
예를 들어, EZH2 저해제는 다음의 화학식을 갖는 화학식 A:
(A), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
예를 들어, EZH2 저해제는 다음의 화학식을 갖는 화학식 B:
(B), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
예를 들어, EZH2 저해제는 다음의 화학식을 갖는 화학식 C:
(C), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
예를 들어, EZH2 저해제는 다음의 화학식을 갖는 화학식 D:
(D), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
예를 들어, EZH2 저해제는 다음의 화학식을 갖는 화학식 E:
(E), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 명세서에서, 단수 형태는 또한 달리 문맥에서 명확하게 지시되지 않는 한, 복수를 포함한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 참고문헌은 특허청구된 발명에 대한 선행 기술이 되는 것으로 용인되지 않는다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1a 및 도 1b는 야생형(RD 및 SJCRH30) 및 돌연변이체 SNF5를 지니는 세포주의 일련의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면.
도 2a 내지 도 2e는 SNF5 돌연변이체 세포주 A204 (c), G401 (d) 및 G402 (e)가 야생형 세포주 RD (A) 및 SJCRH30 (B)에 비해 EZH2 화합물(화합물 E)에 대해 선택적으로 반응한다는 것을 확립하는 일련의 그래프를 도시한 도면.
도 3a 내지 도 3d는 G401 SNF 돌연변이체 세포주가 야생형 세포 RD에 비해 연한천에서 7일 후에 화합물 E에 반응한다는 것을 나타내는 일련의 막대 그래프를 도시한 도면. a는 세포주 RD(5,000개 세포/웰)를 나타낸다. b는 G401 세포(5,000개 세포/웰)를 나타낸다. c는 2D 성장에서 G401 세포를 나타낸다. d는 G401 세포(10,000개 세포/웰)를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 G401 SNF5 돌연변이체 세포주가 시험관내 화합물에 민감하다는 것을 나타내는 4개의 그래프를 도시한 도면. 야생형 세포주 SJCRH30(a) 및 RD(c) 및 SNF5 돌연변이체 세포주 G401(b) 및 A204(d)는 화합물 A의 표시 농도를 이용하여 7일 동안 전처리하고, 제0일에 반복하였다. 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표) 발광 세포 생존도 분석에 의해 세포 생존도를 결정하였다.
도 5a 내지 도 5d는 화합물 A 처리에 의한 G401 이종이식(악성횡문근양종양 모델)에서의 지속적인 퇴행을 나타내는 일련의 그래프를 도시한 도면. (a) 종양 퇴행은 표시한 용량에서 화합물 A에 의해 유도되었다. (b) 종양 퇴행은 표시된 용량에서 화합물 A의 1일 2회 투여에 의해 유도되었다. 데이터는 평균값± SEM (n=8)을 나타낸다. 화합물 투여를 제28일에 중단하였다. (c) G401 이종이식 종양 조직에서의 EZH2 표적 저해를 제21일에 마우스의 병행 코호트로부터 수집하였다. 각각의 지점은 H3K27Me3 대 전체 H3의 비를 나타낸다. 수평선은 그룹 평균값을 나타낸다. BLLQ = 정량화의 하한. (d, e) 비히클 처리(d) 및 화합물 A 처리(125㎎/㎏) 마우스로부터의 종양 샘플의 종양 히스톤 메틸화의 면역조직화학적 염색.
도 6은 SCLC 세포주에서 동정한 ATRX 돌연변이의 위치를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 7a는 LNCAP 전립선 암세포가 시험관내 화합물 E 처리에 의한 용량-의존적 세포 성장을 나타낸다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 7b는 WSU-DLCL2 및 LNCAP 세포에 대해 제11일 및 제14일에 화합물 E의 IC50 값을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 8a 내지 도 8c는 ATRX 돌연변이체 SCLC 계통 NCI-H446(a), SW1271(b) 및 NCI-H841(c)이 화합물 E에 반응한다는 것을 확립하는 3개의 그래프를 도시한 도면.
도 9a 내지 도 9c가 SCLC 계통 NCI-H841이 비히클 (a) 또는 4.1E-02 uM (b) 또는 3.3 uM (c)의 농도에서 또는 화합물 E로 처리 후에 형태를 변화시킨다는 것을 나타내는 3개의 현미경 사진을 도시한 도면.
도 10a 내지 도 10c는 세포 전체적 히스톤 메틸화 및 세포 생존도에 대한 화합물 A의 효과를 나타내는 일련의 그래프를 도시한 도면. (a) 화합물 A의 화학적 구조. (b) G401 및 RD 세포에서 세포의 H3K27Me3 수준의 농도-의존적 저해. (c) 시험관내 화합물 A에 의한 SMARCB1-결실 G401 세포 증식의 선택적 저해(ATP 함량에 의해 측정함). G401(패널 a 및 b) 및 RD 세포(패널 c 및 d)를 제7일에 본래의 파종 밀도에서 재플레이팅하였다. 각각의 점은 각각의 농도에 대한 평균을 나타낸다(n=3).
도 11A 및 도 11B는 생화학적 작용 메커니즘 연구를 나타내는 일련의 그래프를 도시한 도면. 화합물 A의 IC50 값은 SAM 농도가 증가함에 따라 증가하고(a), 올리고뉴클레오솜 농도가 증가함에 따라 최소로 영향받는데(b), 이는 작용의 SAM-경쟁적 및 뉴클레오솜-비경쟁적 메커니즘을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 세포의 히스톤 메틸화의 저해를 위한 세포주에서의 SMARCB1 및 EZH2 발현의 증명 및 화합물 A의 특이성을 입증하는 일련의 패널을 도시한 도면. (a) 세포 용해물을 SMARCB1, EZH2 및 액틴(장입 대조군)에 특이적인 항체를 이용하는 면역블롯에 의해 분석하였다. (b) G401 및 RD 세포에서 세포의 H3K27 메틸화의 선택적 저해. 세포를 4일 동안 화합물 A와 함께 인큐베이션시키고 나서, 산-추출된 히스톤을 면역블롯에 의해 분석하였다.
도 13a 및 도 13b는 화합물 A가 SMARCB1-결실된 MRT 세포에서 G1 정지(arrest) 및 세포자멸사를 유도한다는 것을 입증하는 일련의 막대 그래프를 도시한 도면. 14일까지 동안 비히클 또는 1μM 화합물 A 중 하나와 함께 인큐베이션 동안 RD(패널 A) 또는 G401 세포(패널 B)에서의 세포 주기 분석(유세포 분석기에 의해) 및 세포자멸사의 결정(TUNEL 분석). G1 정지를 제7일에 관찰하였고, 세포자멸사를 제11일 현재로 유도하였다. 데이터를 평균값± SEM로서 나타낸다(n=2). 나타낸 DMSO 대조군 값은 각각의 시점으로부터 평균± SEM이다. 세포를 분할하고 제4일, 제7일 및 제11일에 본래의 파종 밀도에서 재플레이팅하였다.
도 14a 내지 도 14b는 화합물 A가 SMARCB1 조절 유전자의 발현 및 세포 형태에서의 변화를 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. (a) RD 대조군 세포에 비한 G401 SMARCB1-결실 세포에서의 SMARCB1 조절 유전자의 기저 발현(qPCR에 의해 측정, n=2). (b) G401 및 RD 세포를 제2일, 제4일 및 제7일에 DMSO 또는 1 μM 화합물 A 중 하나와 함께 인큐베이션시켰다. 유전자 발현을 qPCR에 의해 결정하고(n=2) 각각의 시점의 DMSO 대조군에 대해 발현시켰다. 패널 a 내지 j는 각각 유전자 GLI1, PTCh1, DOCK4, CD133, PTPRK, BIN1, CDKN1A, CDKN2A, EZH2 및 MYC에 대응한다. (c) G402 세포를 14일 동안 DMSO(좌측 패널) 또는 1 μM 화합물 A(우측 패널) 중 하나와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 분할하고 제7일에 본래의 파종 밀도에 대해 재플레이팅하였다.
도 15a 내지 도 15d는 화합물 A로 처리한 G401 이종이식 보유 마우스에서 체중, 종양 퇴행 및 혈장 수준을 입증하는 일련의 그래프를 도시한 도면. (a) 체중을 28일 동안 BID 스케줄에 대해 화합물 A로 처리한 동물에 대해 1주 2회 결정하였다. 데이터를 평균값± SEM로서 제시한다(제21일까지 n=16, 제22일로부터 제60일 까지 n=8). (b) 표시한 용량에서 21일 동안 화합물 A의 1일 2회 (BID) 투여에 의해 유도된 종양 퇴행(평균값± SEM, n=16). * p <0.05, ** p < 0.01, 비히클에 대한 ANOVA, 던넷 사후 검정(Dunnett’s post-test)을 반복 측정. (c) 21일에 안락사시킨 8마리 마우스의 종양 중량. **** p < 0.0001, 피셔 정확 검정. (d) 21일에 화합물 A의 투약 5분 전 및 투약 3시간 후에 혈장을 수집하고, LC-MS/MS에 의해 화합물 수준을 측정하였다. 동물을 안락사시키고, 21일에 투약 3시간 후에 종양을 수집하였다. 종양 세포분쇄액을 만들고 나서, LC-MS/MS 분석을 실시하여 화합물 A 농도를 결정하였다. 이종이식이 21일에 너무 작았기 때문에 종양 화합물 수준은 특히 더 높은 용량 그룹에서 모든 동물로부터 결정할 수 없었다는 것을 주의한다. 점은 개개 동물에 대한 값을 나타내고; 수평선은 그룹 평균값을 나타낸다.
도 16a 내지 도 16c는 SCID 마우스에서 SMARCB1-결실 MRT 이종이식을 근절하였다는 것을 나타내는 일련의 그래프를 도시한 도면. (a) 표시한 용량에서 28일 동안 화합물 A의 1일 2회(BID) 투여에 의해 유도된 종양 퇴행. 화합물 투여를 제28일에 중단하고, 종양을 그들이 2000㎣에 도달될 때까지 재성장시켰다(평균값± SEM으로서 나타낸 데이터, n=8). (b) G401 이종이식 종양 조직에서 EZH2 표적 저해를 제21일에 안락사시킨 마우스로부터 수집하였다. 각각의 지점은 ELISA에 의해 측정한 H3K27Me3 대 전체 H3의 비를 나타낸다. 수평선은 그룹 평균값을 나타내며; 회색 기호는 ELISA 표준 곡선 밖의 값이다. (c) 21일 동안 화합물 A로 처리한 마우스로부터 수집한 G401 이종이식 종양 조직에서 유전자 발현의 변화. 패널 a 내지 d는 각각 유전자 CD133, PTPRK, DOCK4 및 GLI1에 대응한다. 데이터를 비히클± SEM과 비교한 배수 변화로서 제시한다(500㎎/㎏ 그룹에 대해 n=6, n=4). * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, 대 비히클, 피셔 정확 검정.
본 발명은 EZH2 저해제가 특정 바이오마커 또는 유전자의 변경된 발현 및/또는 기능상실을 특징으로 하는 SWI/SNF-연관 암을 효과적으로 처리할 수 있다는 발견에 부분적으로 기반한다. 구체적으로, 선택된 바이오마커 또는 유전자의 변경된 발현 및/또는 기능상실을 갖는 종양 또는 종양 세포는 본 발명의 EZH2 저해제에 대해 민감하다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여함으로써, 특히 특정 바이오마커 또는 유전자의 변경된 발현 및/또는 기능상실과 연관된 암을 치료함으로써 대상체에서 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 바이오마커는 SWI/SNF 복합체의 한 성분이다. 예를 들어, 유전자는 신경분화 유전자, 세포주기 유전자 저해 유전자, 종양 억제 유전자, 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간에서 SWI/SNF 복합체는 적어도 진화론적으로 보존된 코어 서브유닛 및 변이체 서브유닛을 포함한다. 진화론적으로 보존된 코어 서브유닛은 SNF5(또한 SMARCB1, INI1 또는 BAF47로 불림), SMARCA4(또한 BRM/SWI2-관련 유전자 1, BRG1로 알려짐), BAF155, 및 BAF170을 포함한다. 변이체 서브유닛은 BAF53(A 또는 B), BAF60(A, B 또는 C), BAF 57, BAF45(A, B, C 또는 D)를 포함한다. 다른 서브유닛은 ARIDI1A(또한 SMARCF1로서 알려짐), ARID1B, SMARCA2(또한 브라마(brahma) 상동체, BRM로서 알려짐), ATRX, BAF200, BAF180(또한 PBRM1로서 알려짐) 및 브로모도메인-함유 7(BRD7)을 포함한다. SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분은 복합체의 임의의 성분, 예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 성분/서브유닛에 의할 수 있다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 신경분화 유전자는 CD133(또한 PROM1로 불림), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 또는 GFAP일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 세포주기 저해 유전자는 CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4 또는 TRIM35일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 종양 억제 유전자는 BIN1일 수 있지만, 이것으로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "종양 억제 유전자"는 당업계에서 그의 통상적으로 이해되는 의미를 가지며, 즉, 발현 및 정상 기능이 신생물 표현형을 억제하거나 또는 세포자멸사를 유도하거나 또는 둘 다를 위해 작용하는 유전자이다. 일부 실시형태에서, 종양 억제 유전자는 세포주기 저해 유전자를 포함한다. 종양 억제유전자의 예시적인 범주는 그들의 작용에 기반하여 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
(1) 세포주기를 저해하는 유전자;
(2) DNA 손상에 대패 세포주기를 결합시키는 유전자. 세포 내에 손상된 DNA가 있을 때, 세포는 분할되어서는 안 된다. 손상이 수복된다면, 세포주기는 계속될 수 있다. 손상이 수복될 수 없다면, 세포는 세포자멸사(세포예정사)를 개시하여야 한다;
(3) 종양 세포가 분산되는 것을 방지하며, 접촉 저해의 손실을 차단하고, 전이를 저해하는 유전자. 이들 유전자 및 그들의 암호화된 단백질은 또한 전이 억제유전자로서 알려져 있다; 및
(4) DNA 수복 단백질. 이들 유전자에서의 돌연변이는 암의 위험을 증가시킨다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 헷지호그 신호처리 경로 유전자는 GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 또는 SMO일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, myc 경로 유전자는 MYC NMI, NFYC, NFYB, 사이클린 T1, RuvB-유사 1, GTF2I, BRCA1, T-세포 림프종 침습 및 전이-유도 단백질 1, ACTL6A, PCAF, MYCBP2, MAPK8, Bcl-2, 전사 개시 단백질 SPT3 상동체, SAP130, DNMT3A, 데카펜타플렉 상동체 3에 대한 모체, MAX, 데카펜타플렉(decapentaplegic) 상동체 2에 대한 모체, MYCBP, HTATIP, ZBTB17, 형질전환/전이 도메인-결합 단백질, TADA2L, PFDN5, MAPK1, TFAP2A, P73, TAF9, YY1, SMARCB1, SMARCA4, MLH1, EP400 또는 let-7일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자는 EZH2일 수 있지만, 이것으로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 EZH2 또는 이의 돌연변이체의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해하며, 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 특정 병태 및 질환을 치료 또는 방지하기 위한 후보이다. 본 발명은 암 또는 전암상태의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체, 용매화물 또는 입체이성질체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 치료될 수 있는 예시적인 암은 수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 화합물에 의해 치료될 암은 비 NHL 암이다.
본 발명은 추가로 암 또는 전암의 치료에서, 또는 이러한 암 또는 전암의 치료에 유용한 의약의 제조를 위해 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 용도를 제공한다. 치료될 수 있는 예시적인 암은수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 비 NHL 암의 치료를 위해, 또는 비 NHL 암의 치료에 유용한 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 단백질(예를 들어, 히스톤) 메틸화를 조절하기 위해, 예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 히스톤 탈메틸효소 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단백질 메틸화를 조절하기 위해 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. EZH2에 의한 메틸화 조절이 종양 형성에서, 특히 선택된 바이오마커/유전자의 종양 보유 변경 발현 및/또는 기능상실을 수반한다는 놀라운 발견에 기반하여, 본 명세서에 기재된 화합물은 이들 질병을 치료하기 위한, 즉, 상대 정상 세포에서의 대략적인 그의 수준까지 메틸화를 감소시키거나 또는 메틸화를 회복시키기 위한 적합한 후보이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 SWI/SNF 복합체 관련 종양 또는 종양 세포의 증식을 선택적으로 저해할 수 있다(도 1 내지 9에서 나타낸 바와 같음). 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 SWI/SNF 복합체 연관 암 또는 전암상태의 증상을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 SWI/SNF 복합체 연관 암 또는 전암 상태의 치료에서, 또는 이러한 암 또는 전암의 치료에 유용한 의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 용도를 제공한다.
또한 본 발명에서 EZH2 저해제에 대한 암을 갖는 대상체의 반응을 결정하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체로부터 샘플(핵산 샘플 또는 단백질 샘플)을 얻는 단계 및 감소된 발현, 반수체기능부전(haploinsufficiency) 및/또는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 기능상실을 검출하는 단계, 이 성분의 발현 및/또는 기능상실을 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다는 것을 나타낸다. 용어 "샘플"은 대상체로부터 유래된 임의의 혈액학적 샘플을 의미하며, 세포, 조직, 샘플, 체액(점막, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침 및 정액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 종양 세포 및 종양 조직을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 샘플은 치료 또는 시험 하에서 대상체에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로 샘플은 당업계에서 일상적인 실행에 따라 의사에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 기능상실을 검출하는 단계, SWI/SNF 복합체 감소된의 발현 및/또는 기능상실을 검출하는 단계를 위한 방법을 제공하며, 이러한 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 이러한 기능상실이 없는 대상체에 비해 암 또는 전암상태가 발생할 성향을 갖게 한다는 것(즉, 더 높은 위험을 가짐)을 나타낸다.
암 또는 전암상태에 관해 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "경향이 있는"은, 대상체 간의 암 또는 전암상태에 대한 다른 위험 인자(예를 들어, 화학적/환경, 식품 및 흡연 이력 등) 가 동일한 환경 하에서 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 갖지 않는 다른 대상체가 암 또는 전암상태로 고통받을 확률에 비해 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 지니는 대상체가 암 또는 전암상태로 고통받을 증가된 확률(예를 들어, 확률에서 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 이상의 증가)을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 내용에서 "위험"은 구체적 시간 기간에 걸쳐 사건이 일어날 확률에 관한 것이며, 대상체의 "절대" 위험 또는 "상대적" 위험을 의미할 수 있다. 절대 위험은 적절한 시간 코호트에 대해 측정후 실제 관찰과 관련하여 또는 적절한 시간 기간 동안 따르게 된 통계적으로 타당한 이력의 코호트로부터 발생된 지표값과 관련하여 측정될 수 있다. 상대적 위험은 저위험 코호트의 절대 위험 또는 평균 집단 위험에 비교한 대상체의 절대 위험의 비를 지칭하는데, 이는 임상적 위험 인자가 평가될 수 있는 방법에 따라 다를 수 있다. 주어진 시험 결과에 대한 양의 사건 대 음의 사건의 비율인 오즈비(odds ratio)가 또한 전환 없음에 대해 통상적으로 사용되며(오즈는 식 p/(1-p)에 따르며, 여기서 p는 사건의 확률이고, (1-p)는 사건이 없을 확률이다).
따라서, 본 발명은 대상체에서 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실의 유전적 스크리닝에 의해 대상체에 대한 맞춤형 의료(personalized medicine), 치료 및/또는 암 관리를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 EZH2 저해제에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계 및 대상체가 EZH2 저해제에 대해 반응성일 때, 대상체에게 EZH2 저해제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 입체이성질체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의해 암 또는 전암상태의 증상을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 반응은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분(예컨대 SNF5, ARID1A 또는 ATRX)의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 검출하는 단계에 의해 결정되며, 이러한 기능상실의 존재는 대상체가 EZH2 저해제에 대해 반응성이라는 것을 나타낸다.
다른 예에서, 본 발명은 암 또는 전암상태에 대해 주기적으로 대상체의 성향을 결정하는 단계에 의한 대상체에서의 암 관리 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 이러한 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실이 없는 대상체에 비해 암 또는 전암상태가 발생할 성향을 갖는다는 것을 나타낸다.
단지 예시적 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 치료방법은 include 단계 of (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 핵산 샘플 또는 단백질 샘플을 수집하는 단계, (b) 샘플 내 SWI/SNF 복합체 성분의 발현 수준 또는 작용 수준을 측정하는 단계, (c) 대조군 샘플에서 SWI/SNF의 성분의 발현 수준 또는 작용 수준을 측정하는 단계; (d) 시험 샘플에서 단계 (b)에서 측정한 성분의 발현 수준 또는 작용 수준을 대조군 샘플(또는 참조값)에서 단계 (c)에서 측정한 성분의 발현 수준 또는 작용 수준과 비교하는 단계; (e) 단계 (b)에서 측정한 성분의 발현 수준 또는 작용 수준이 단계 (c)에서 측정한 성분의 발현 수준 또는 작용 수준에 비해 감소 또는 상실(예를 들어, 반수체기능부전 또는 기능상실)될 때 치료를 위한 후보로서 대상체를 동정하는 단계; 및 (f) 단계 (e)에서 동정한 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계 또는 단계 (e)에서 동정한 대상체에 대한 치료 요법을 선택하는 단계를 포함한다. 대상체 샘플에서 성분의 발현 수준 또는 작용 수준은 대조군 샘플에서 성분의 발현 수준 또는 작용 수준에 비해, 예를 들어, 10%, 25%, 50% 또는 1-, 2-, 5-배 이상 감소된다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법은 SWI/SNF 복합체의 성분의 발현 수준 또는 작용 수준을 측정하는데 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 악성횡문근양종양, 수모세포종 또는 비정형 유기형 간상 종양을 가진다. 일부 실시형태에서, 성분은 SNF5, ARID1A 또는 ATRX이다.
예를 들어, 동정된 대상체는 가장 최근의 미국 종합 암 네트워크(National Comprehensive Cancer Network: NCCN) 가이드라인에서 기재된 바와 같은 돌봄 치료의 표준을 이용하여 치료될 수 있다.
예를 들어, 대조군 샘플은 건강한 정상 대상체로부터 얻어진다. 대안적으로, 대조군 샘플은 SWI/SNF 복합체와 관련된 암이 발생할 위험에 있지 않거나, 고통받지 않거나, 진단된 적이 없는 대상체로부터 얻어진다.
일 바람직한 양태에서, 본 발명은 EZH2 저해제에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계 및 대상체가 EZH2 저해제에 대해 반응하고 대상체가 뇌 및 CNS 암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 림프종, 골수종, 및/또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 가진다면, EZH2 저해제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계에 의해 대상체에서 암의 증상을 치료 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 반응은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SNF5, ARID1A, 및/또는 ATRX의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 검출하는 단계에 의해 결정되며, 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실의 존재는 EZH2 저해제에 반응한다는 것을 나타낸다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 EZH2 저해제에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계 및 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다면, 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의해 대상체에서 악성횡문근양종양의 증상을 치료 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 반응은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SNF5, ARID1A 및/또는 ATRX의 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실을 검출하는 단계에 의해 결정되며, 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다는 것을 나타낸다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 EZH2 저해제에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계 및 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다면, 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의해 수모세포종의 증상을 치료 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 반응은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SNF5, ARID1A 및/또는 ATRX의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 검출하는 단계에 의해 결정되며, 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다는 것을 나타낸다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 EZH2 저해제에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계 및 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다면, 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의해 비정형 유기형 간상 종양의 증상을 치료 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 반응은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계 및 SNF5, ARID1A 및/또는 ATRX의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 검출하는 단계에 의해 결정되며, 감소된 발현, 반수체기능부전, 및/또는 기능상실의 존재는 대상체가 EZH2 저해제에 반응한다는 것을 나타낸다.
악성횡문근 종양(MRT) 및 비정형 유기형 간상 종양(ATRT)는 고도로 악성이고, 국소로 침습성이며, 빈번하게 전이성이고, 특히 치명적인 뇌, 신장 및 연조직의 극도로 공격적인 소아암이다. 그들은 전형적으로 이배체이며 게놈 이상(genomic aberration)이 없지만; 그러나, 그들은 SWI/SNF 염색질 리모델링 복합체의 코어 성분인 SMARCB1(또한 SNF5, INI1 또는 BAF47로 불림)의 상실의 거의 완전한 침투를 특징으로 한다. SMARCB1의 이대립인자성(biallelic) 불활성화는 본질적으로 MRT 및 ATRT에서 유일한 사건인데, 이는 이런 게놈 이상에 대한 구동자 역할을 시사한다.
임의의 이론에 구속되는 일 없이, 본 발명의 화합물은 구체적으로 SMARCB1 돌연변이체 MRT 세포의 선택적 세포자멸사 사멸을 야기하는 세포의 H3K27 메틸화를 저해한다. 예를 들어, 화합물 A를 이용한 SMARCB1-결실 MRT 세포주의 시험관내 처리는 nM 범위에서 IC50 값에 의한 강한 항-증식성 효과를 유도한 한편; 대조군(야생형) 세포주는 최소로 영향받았다(도 10c 및 표 6). 더 나아가, 본 발명의 화합물은 신경분화, 세포주기 저해 및 종양억제의 유전자를 유도한 한편, 헷지호그 경로 유전자, MYC 및 EZH2의 발현을 억제한다. 예를 들어, 7일까지 동안 G401 SMARCB1-결실 세포의 화합물 A 처리는 모두 시간-의존적 방식으로 CD133, DOCK4 및 PTPRK 및 상향조절된 세포주기 저해제 CDKN1A 및 CDKN2A 및 종양 억제유전자 BIN1의 발현을 강하게 유도하였다(도 14b). 동시에, 헷지호그 경로 유전자, MYC 및 EZH2의 발현은 감소되었다. 특히, 14일 동안 화합물 A에 노출된 G402 SMARCB1-결실 세포는 신경-유사 형상을 추정하였다(도 14c).
따라서, 본 발명은 추가로 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 (c) 본 발명의 화합물의 유효량을 단계 (b)에서 선택한 대상체에게 투여하여, 이에 따라 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화하는 단계에 의해 치료가 필요한 대상체에서 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 선택한 대상체에게 본 발명의 화합물의 유효량을 투여하여, 이에 따라 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화하는 단계에 의해 치료가 필요한 대상체에서 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다.
또한 본 명세서에서 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계, 및 (b) 대상체가 단계 (a)에서 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 수준을 가질 때 암 요법을 선택하는 단계(암 요법은 대상체에게 본 발명의 화합물의 유효량의 투여를 포함함)에 의해 치료가 필요한 대상체에 대한 암 요법을 선택하는 방법이 제공된다.
본 발명은 추가로 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계, 및 (b) 대상체가 단계 (a)에서 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현 수준을 가질 때 암 요법을 선택하는 단계(암 요법은 대상체에게 본 발명의 화합물의 유효량의 투여를 포함함)에 의해 치료가 필요한 대상체에 대한 암 요법을 선택하는 방법이 제공된다.
단지 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 핵산 또는 단백질 샘플을 수집하는 단계, (b) 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, (c) 대조군 샘플에서 동일 유전자(들)의 발현 수준을 측정하는 단계; (d) 시험한 샘플에서의 단계 (b)에서 측정한 유전자의 발현 수준을 대조군 샘플에서의(또는 참조값에 대해) 단계 (c)에서 측정한 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계; (e) 단계 (b)에서 측정한 성분의 발현 수준이 단계 (c)에서 측정한 유전자의 발현 수준에 비해 감소될 때 처리를 위한 후보로서 대상체를 동정하는 단계; 및 (f) 단계 (e)에서 동정한 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량를 투여하는 단계 또는 단계 (e)에서 동정한 대상체에 대한 치료 요법을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 시험한 대상체에서 유전자의 발현 수준은 대조군 샘플의 유전자의 발현 수준에 비해, 예를 들어, 10%, 25%, 50% 또는 1-, 2-, 5-배 이상 감소된다.
단지 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 핵산 또는 단백질 샘플을 수집하는 단계, (b) 샘플에서 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, (c) 대조군 샘플에서 동일 유전자(들)의 발현 수준을 측정하는 단계; (d) 시험한 샘플에서 단계 (b)에서 측정한 유전자의 발현 수준을 대조군 샘플(또는 참조값에 대해) 단계 (c)에서 측정한 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계; (e) 단계 (b)에서 측정한 성분의 발현 수준이 단계 (c)에서 측정한 유전자의 발현 수준에 비해 증가될 때 치료를 위한 후보로서 대상체를 동정하는 단계; 및 (f) 단계 (e)에서 동정한 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계 또는 단계 (e)에서 동정한 대상체에 대한 치료 요법을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 시험한 대상체에서 유전자의 발현 수준은 대조군 샘플에서 유전자의 발현 수준에 비해, 예를 들어, 10%, 25%, 50% 또는 1-, 2-, 5-배 이상 증가된다.
용어 "발현 수준"은 관심 대상의 특정 유전자의 단백질, RNA 또는 mRNA 수준을 지칭한다. 당업계에 공지된 임의의 방법은 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 예는 역전이 및 증폭 분석(예컨대, PCR, 결찰 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCT), 혼성화 분석, 노던 블롯팅, 점 블롯팅, 인시츄 혼성화, 겔전기영동, 모세관 전기이동, 칼럼 크로마토그래피, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 면역염색 또는 질량분석법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생물학적 샘플에 대해 직접 또는 샘플로부터 단리한 단백질/핵산에 대해 분석을 수행할 수 있다. 이는 이들 분석을 수행하기 위한 적절한 기술에서 일상적인 실행이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서의 측정 단계는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터의 핵산 샘플을 본 명세서에 제시된 관심 대상의 유전자에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 측정 단계는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터의 단백질 샘플을 본 명세서에 제시된 관심 대상의 바이오마커에 결합하는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 유전자의 감소된 발현 수준은 참조값 또는 동일한 대상체로부터 얻은 상이한(또는 이전의) 샘플에서 측정된 이 유전자의 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%1000%, 1500% 이상만큼 그의 발현 수준에서의 감소를 의미한다.
특정 유전자의 증가된 발현 수준은 참조값 또는 동일한 대상체로부터 얻은 상이한(또는 이전의) 샘플에서 측정된 이 유전자의 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 그의 발현 수준에서의 증가를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "참조 또는 기준 수준/값"은 상호호환적으로 사용될 수 있고, 유사한 연령 범위를 갖는 그러한 대상체, 질환 상태(예를 들어, 병기(stage)), 동일 또는 유사한 인종 그룹을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 집단 연구로부터 유래된 수 또는 값에 대해 또는 암에 대한 치료를 받고 있는 대상체의 출발 샘플에 대한 것임을 의미한다. 이러한 참조값은 암의 수학적 알고리즘 및 계산된 지표로부터 얻은 집단의 통계학적 분석 및/또는 위험 예측 데이터로부터 유도될 수 있다. 참조 지표가 또한 구성되며 통계적 및 구조적 분류의 알고리즘 및 다른 방법을 사용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 참조 또는 기준값은 임의의 암으로 진단된 적이 없는 하나 이상의 건강한 대상체 또는 대상체로부터 유래된 대조군 샘플에서 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 참조 또는 기준값은 임의의 암 치료 전에 동일 대상체로부터 얻은 샘플에서 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 참조 또는 기준값은 암 치료 동안 동일 대상체로부터 얻은 샘플에서 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준이다. 대안적으로, 참조 또는 기준값은 동일 대상체로부터의 또는 시험한 대상체에 대해 유사한 연령 범위, 질환 상태(예를 들어, 병기)를 갖는 대상체로부터의 이전에 얻은 샘플에서 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준의 사전 측정이다.
일부 실시형태에서, 유효량은 치료 전에 대상체에서 감소된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준 또는 암의 하나 이상의 증상을 완화하는데 충분한 양을 증가시키는데 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 임의의 화합물의 치료 없이 참조값 또는 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 증가시키는데 충분한 양이다.
일부 실시형태에서, 유효량은 치료 전에 대상체에서 증가된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준 또는 암의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 충분한 양을 감소시키는데 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 임의의 화합물의 처리 없이 참조값 또는 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 헷지호그 경로 유전자, MYC 및 EZH2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 감소시키는데 충분한 양이다.
대상체에 대한 정확한 유효량은 대상체 체중, 크기 및 건강상태; 병태의 특성 및 정도; 및 투여를 위해 선택된 치료제에 의존할 것이다. 주어진 상황에 대한 유효량은 임상의의 기술 및 판단 내인 일상적일 실험에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 참조값 또는 사전 측정과 비교하는 단계, 및 (c) 비교 단계에 기반한 암 치료의 효능을 결정하는 단계에 의해 치료가 필요한 대상체에서 암 치료의 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 암 치료는 시험한 대상체에게 본 발명의 화합물을 투여하는 단계이다.
치료는 시험한 대상체가 1) 참조값 또는 사전 측정에 비해; 또는 2) 모니터링되는 시간 기간, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 이상에 걸쳐 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현을 가질 때에 유효하다. 기존의 치료가 효과적이지 않을 때에, 새로운 치료 또는 기존 치료의 증가된 투약량(예를 들어, 대상체에게 투여된 화합물의 투약량의 증가)은 시험 대상체에 대해 추구되어야 한다.
본 발명은 또한 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 기준값 또는 사전 측정과 비교하는 단계, 및 (c) 비교 단계에 기반하여 암 치료의 효능을 결정하는 단계에 의해 암 치료 치료가 필요한 대상체에서 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 암 치료는 시험한 대상체에게 본 발명의 EZH2 저해제를 투여하는 것이다.
예를 들어, 치료는 1) 참조값 또는 사전 측정에 비해; 또는 2) 모니터링 중인 시간 기간, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 이상에 걸쳐 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현을 가질 때에 유효하다. 기존의 치료가 효과적이지 않을 때에, 새로운 치료 또는 기존 치료의 증가된 투약량(예를 들어, 대상체에게 투여된 화합물의 투약량의 증가)은 시험 대상체에 대해 추구되어야 한다.
본 명세서에 제시된 임의의 방법에서, 암은 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 암은 수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 또는 비정형 유기형 간상 종양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "반응성"은 "반응적", "민감적" 및 "민감성"과 상호호환가능하며, 대상체가 EZH 저해제를 투여할 때에 치료적 반응을 나타낸다는 것, 예를 들어, 대상체의 종양 세포 또는 종양 조직은 세포자멸사 및/또는 괴사를 겪고/겪거나 감소된 성장, 분할 또는 증식을 나타낸다는 것을 의미한다. 이 용어는 또한 대상체가, EZH 저해제가 투여될 때에 치료적 반응을 나타내는 것의 전체적인 집단에 대한 더 높은 확률을 가질 것이거나 또는 가진다는 것, 예를 들어, 대상체의 종양 세포 또는 종양 조직이 세포자멸사 및/또는 괴사를 겪고/겪거나 감소된 성장, 분할 또는 증식을 나타낸다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "대상체"는 치료가 필요한 대상체와 상호호환가능하며, 이들 둘 다 EZH2-매개 단백질 메틸화가 부분적으로 작용하는 장애를 갖는 대상체, 또는 전체적 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 증가된 위험을 갖는 대상체를 지칭한다. 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체와 연관된 장애를 갖는 대상체일 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 전암상태를 가질 수 있다. 바람직하게는, 치료가 필요한 대상체는 암을 가진다. 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF복합체와 연관된 암을 가질 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체 중 적어도 하나의 성분에서의 기능상실과 연관된 암을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, a 치료가 필요한 대상체는 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암을 가진다. 바람직하게는, 치료가 필요한 대상체는 수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종을 가진다. 대안적으로, 치료가 필요한 대상체는 비 NHL 암을 가진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "대상체"는 포유류를 포함한다. 포유류는, 예를 들어 인간 또는 적절한 비-인간 포유류, 예컨대 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 낙타, 양 또는 돼지일 수 있다. 대상체는 또한 조류 또는 가금류일 수 있다. 일 실시형태에서, 포유류는 인간이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
치료가 필요한 대상체는 암 또는 전암상태을 갖는 것으로 이전에 진단 또는 동정된 적이 없는 대상체일 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 암 또는 전암상태를 갖는 것으로 이전에 진단 또는 동정된 적이 있는 대상체일 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 또한 암 또는 전암상태를 갖는(로 고통받는) 대상체일 수 있다. 대안적으로, 치료가 필요한 대상체는 전체적 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 위험을 가지는 대상체일 수 있다(즉, 전체적 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 성향을 갖는 대상체).
선택적으로 치료가 필요한 대상체는 암 또는 전암상태에 대한 적어도 하나의 치료적 개입을 이미 겪었거나, 겪고 있거나 또는 겪을 것이다.
치료가 필요한 대상체는 가장 최근의 요법에 대해 난치성인 암을 가질 수 있다. "난치성 암"은 치료에 반응하지 않는 암을 의미한다. 암은 치료의 시작 시 내성이 있을 수 있거나 또는 치료 동안 내성이 될 수 있다. 난치성 암은 또한 내성암으로 불린다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 가장 최근의 요법에 대해 관해 후 암 재발을 가진다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 암 치료에 효과적인 모든 것을 받고 실패하였다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 적어도 하나의 사전 요법을 받았다.
치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체와 연관된 암 또는 전암상태를 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분의 기능상실과 연관된 암 또는 전암상태를 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다. 바람직한 양태에서, 치료가 필요한 대상체는 뇌 및 중추신경계 (CNS) 암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암을 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다. 바람직하게는, 치료가 필요한 대상체는 뇌 및 CNS 암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 림프종, 골수종, 및/또는 육종을 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다. 예시적인 뇌 및 중추 CNS 암은 수모세포종, 핍지교종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종 및 송과체모세포종을 포함한다. 예시적인 난소암은 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종 및 난소 장액성 낭포선암종을 포함한다. 예시적인 췌장암은 췌관 선암종 및 췌장 내분비 종양을 포함한다. 예시적인 육종은 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 화합물에 의해 치료될 암은 비 NHL 암이다.
대안적으로, 치료가 필요한 대상체는 수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암을 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다. 바람직하게는, 대상체는 수모세포종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 췌관 선암종, 악성횡문근양종양, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 교모세포종, 뇌수막종, 송과체모세포종, 암육종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 유잉 육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및/또는 NOS 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암을 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다. 더 바람직하게는, 치료가 필요한 대상체는 악성횡문근양종양, 수모세포종 및/또는 비정형 유기형 간상 종양을 가졌거나, 가지고 있거나 또는 발생될 성향이 있을 수 있는 대상체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 수준을 가진다.
일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현 수준을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분/서브유닛의 기능상실을 가진다. 대안적으로, 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분/서브유닛의 감소된 발현 또는 반수체기능부전을 가진다. 특정 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 SNF5 서브유닛의 기능상실을 가진다.
본 발명의 임의의 방법에서, 치료가 필요한 대상체는 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 신호처리 성분의 감소된 발현, 반수체기능부전 또는 기능상실을 가질 수 있다. 이러한 하류의 성분은 폴리콤 복합체(polycomb complex: PcG) 및 그의 표적을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "기능상실"은 야생형에 비해 유전자 산물/단백질의 작용이 더 적거나 또는 없음을 지칭한다. SWI/SNF 복합체 성분의 기능상실은 성분/서브유닛 또는 전체 SWI/SNF 복합체가 야생형 성분/서브유닛 또는 전체 SWI/SNF 복합체에 비해 각각 생물학적 작용이 더 적거나 또는 없음을 의미한다. 기능상실은 전이성, 전이후 또는 번역후 메커니즘에 의해 야기될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 기능상실은 SWI/SNF 복합체 성분의 폴리펩타이드 또는 SWI/SNF 복합체 성분의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서의 점 돌연변이(예를 들어, 치환, 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이), 삽입, 및/또는 결실로부터 초래된 기능상실 돌연변이에 의해 야기된다. 본 명세서에서 지칭되는 돌연변이는 체세포 돌연변이다. 용어 "체세포 돌연변이"는 신체의 모든 세포에서 발현되지 않지만, 단지 단리된 세포에서 발견되는 적어도 하나의 대립유전자에서의 유해한 변경을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 체세포 돌연변이의 특징은, 그들이 특정 조직 또는 심지어 조직 또는 조직 내 세포의 부분으로 제한되고, 조직 또는 세포를 보유하는 전체 유기체에서 존재하지 않는다는 것이다. 용어 "야생형"은 자연적으로 생기는 공급원으로부터 단리될 때 해당 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰되며 따라서 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 임의로 설계된 것이다.
따라서, 기능상실 돌연변이 또는 감소된 발현은 당업계에서 이용가능한 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 기능상실 돌연변이는 유전자 산물의 생물학적 작용, 예컨대 SWI/SNF 복합체의 ATP-의존적 염색질 리모델링 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다. 대안적으로, 기능상실 돌연변이는 SWI/SNF 복합체의 성분을 암호화하는 핵산 서열에서 임의의 변경을 검출함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 기능상실 돌연변이를 갖는 SWI/SNF 복합체의 성분을 암호화하는 핵산 서열은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 적합하게 선택된 DNA 공급원 및 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 프라이머를 사용하여 전체-게놈 재서열화 또는 표적 영역 재서열화(후자는 또한 표적화된 재서열화로서 알려짐)에 의해 검출될 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 그리고 유전자적으로 게놈의 DNA 정제, 관심 대상의 영역을 증폭하기 위한 PCR 증폭, 직접순서결정법(cycle sequencing), 서열화 반응 클린업, 모세관 전기이동, 및/또는 데이터 분석 단계를 수반한다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 방법은 마이크로어레이-기반 표적화 영역 게놈의 DNA 포획 및/또는 서열화의 사용을 포함할 수 있다. 적절한 PCR 프라이머를 선택하고 재서열화를 수행하기 위한 키트, 시약 및 방법은, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 애질런트(Agilent) 및 님블겐(NimbleGen)(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))로부터 상업적으로 입수가능하다. 대안적으로 또는 추가로, 기능상실 돌연변이를 갖는 SWI/SNF 폴리펩타이드 를 갖는 핵산 서열은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 사우던 블롯을 사용하여 검출될 수 있다. 선택적으로, 기능상실 돌연변이는 성분 폴리펩타이드의 발현 없이 측정함으로써 또는 돌연변이체 성분 폴리펩타이드의 발현을 측정함으로써 검출될 수 있다. (돌연변이체) 폴리펩타이드 발현의 검출은 웨스턴 블롯 분석과 같은 당업계에서의 임의의 적합한 면역분석을 이용하여 수행될 수 있다.
SWI/SNF 복합체 성분의 인간 핵산 및 아미노산 서열은 이전에 기재되었다. 예를 들어, SNF5에 대해 젠뱅크 등록번호 NP_003064.2, NM_003073.3, NP_001007469.1 및 NM_001007468.1, ATRX에 대해 젠뱅크 등록번호 NM_000489.3, NP_000480.2, NM_138270.2 및 NP_612114.1, ARID1A에 대해 젠뱅크 등록번호 NP_006006.3, NM_006015.4, NP_624361.1 및 NM_139135.2를 참조하며, 이들 각각은 그들의 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
인간에서 hSNF5 체세포 돌연변이의 스펙트럼은 또한 문헌[Sevenet et al., Human Molecular Genetics, 8: 2359-2368, 1999]에 기재되어 있으며, 그의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
치료가 필요한 대상체는 SNF5의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상체는 SNF5 폴리펩타이드에서 SNF5의 결실 또는 SNF5 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
치료가 필요한 대상체는 ATRX의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상체는 서열번호 5의 아미노산 위치 688에서 야생형 잔기 라이신(K)의 아스파라긴(N)으로의 치환(K688N) 및 서열번호 5의 아미노산 위치 366에서 야생형 잔기 메티오닌(M)의 아이소류신(I)으로의 치환(M366I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함할 수 있다.
치료가 필요한 대상체는 ARID1A의 감소된 발현, 반수체기능부전 및/또는 기능상실을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상체는 서열번호 11의 아미노산 위치 884에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 넌센스 돌연변이(C884*), 아미노산 위치 966에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 라이신(K)으로의 치환(E966K), 서열번호 11의 아미노산 위치 1411에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q1411*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1720에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 틀 이동 돌연변이(F1720fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G) 후의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1874에서 야생형 잔기 시스테인(C)에서의 틀 이동 돌연변이(C1874fs), 아미노산 위치 1957에서 야생형 잔기 아스파트산(D)의 글루탐산(E)으로의 치환(D1957E), 서열번호 11의 아미노산 위치 1430에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1430*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1721에서 야생형 잔기 알기닌(R)에서의 틀 이동 돌연변이(R1721fs), 아미노산 위치 1255에서 야생형 잔기 글라이신(G)의 글루탐산(E)으로의 치환(G1255E), 서열번호 11의 아미노산 위치 284에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G284fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1722에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1722*), 서열번호 11의 아미노산 위치 274에서 야생형 잔기 메티오닌(M)에서의 틀 이동 돌연변이(M274fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 559에서 야생형 잔기 P에서의 틀 이동 돌연변이(P559fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1276에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1276*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2176에서 야생형 잔기 글루타민(Q)에서의 틀 이동 돌연변이(Q2176fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 203에서 야생형 잔기 히스티딘(H)에서의 틀 이동 돌연변이(H203fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 591에서 야생형 잔기 알라닌(A)에서의 틀 이동 돌연변이(A591fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1322에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1322*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2264에서 야생형 잔기 세린(S)의 넌센스 돌연변이(S2264*), 서열번호 11의 아미노산 위치 586에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q586*), 서열번호 11의 아미노산 위치 548에서의 틀 이동 돌연변이(Q548fs), 및 서열번호 11의 아미노산 위치 756에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)에서의 틀 이동 돌연변이(N756fs)로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "*"는 정지 코돈을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 "fs"는 틀 이동을 지칭한다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물(즉, EZH2 저해제)과 접촉시킴으로써 신경분화를 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 CD133(또한 PROM1로 불림), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 및 GFAP로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는데 충분한 양이다.
본 명세서에 사용된 용어 "신경분화를 유도하는"은 세포에 대한 직접적 또는 의도적 효과의 결과로서 세포가 신경계통의 세포로 발생하는 것을 야기하는 것을 지칭한다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 세포주기 저해를 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4 및 TRIM35로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는데 충분한 양이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포주기 저해를 유도하는"은 세포 분할 및/또는 복제 동안 임의의 단계에서 축적 또는 정지를 야기하는 것을 지칭한다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 종양억제를 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 BIN1 또는 임의의 종양 억제유전자의 발현을 증가시키는데 충분한 양이다.
용어 "종양억제를 유도하는"은 농양 크기의 감소, 종양 용적의 감소, 종양 수의 감소, 원발성 종양 부위에서 떨어진 다른 조직 또는 기관에서 전이성 병변 수의 감소, 담체만을 받은 집단에 비해 처리된 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가, 미처리 대상체의 집단에 비해 처리 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가, 본 발명의 화합물이 아닌 약물을 이용한 단독요법을 받은 집단에 비해 처리 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가, 담체만을 받은 집단에 비해 처리 대상체 집단의 사망률에서의 감소, 종양 성장률에서의 감소 또는 종양 재성장률에서의 감소를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 헷지호그 신호처리를 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 및 SMO로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 감소시키는데 충분한 양이다.
어구 "헷지호그 신호처리를 저해하는"는 화합물 처리를 이용하는 헷지호그 신호처리 세기(강도)가 임의의 화합물 처리가 없는 헷지호그 신호처리(강도)에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 감소된다는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 유전자 발현을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 신경분화, 세포주기 저해 및/또는 종양억제을 유도하는데 충분한 양이다. 이러한 유전자는 CD133(또한 PROM1로 불림), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64, GFAP, CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, TRIM35, BIN1 및 임의의 종양 억제유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
어구 "유전자 발현을 유도하는"은 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준이 임의의 화합물 처리가 없는 이 유전자의 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 증가된다는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시킴으로써 유전자 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 헷지호그 신호처리를 저해하는데 충분한 양이다. 이러한 유전자는 GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 또는 SMO이다.
어구 "유전자 발현을 저해하는"은 관심 대상의 특정 유전자의 발현 수준이 임의의 화합물 처리가 없는 이 유전자의 발현 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% 이상만큼 감소된다는 것을 의미한다.
신경분화, 세포주기 저해, 종양억제 및 헷지호그 신호처리 저해는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 세포는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있고 사용될 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 세포 배양물로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 세포는 대상체로부터 단리될 수 있다. 세포는 또한 대상체의 세포를 지칭할 수 있다.
세포는 SNF5, ARID1A, ATRX, 및/또는 SWI/SNF 복합체의 성분의 기능상실을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 SNF5의 결실을 포함할 수 있다.
세포는 암세포일 수 있으며, 여기서 암은 수모세포종, 핍지교종, 난소 투명 세포 암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 낭포선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성횡문근양종양, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 맥락막 얼기 암종, 맥락얼기 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경원성 종양, 핍지성상세포종, 핍지교종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 고환외 생식세포종, 신외성 횡문성 종양, 신경초종, 피부 편평세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관기저종양, 골육종, 횡문근육종, 상피 육종, 신장 수질 암종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 분류되지 않는(NOS) 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는 세포는 수모세포종, 악성횡문근양종양 또는 비정형 유기형 간상 종양의 암세포이다.
치료될 암은 미국암연합위원회(American Joint Committee on Cancer: AJCC) TNM 분류 시스템에 따라 병기 부여될 수 있으며, 종양(T)은 TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c 또는 T4d의 병기가 부여되고; 국소 림프절(N)은 NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b, 또는 N3c의 병기가 부여되었으며; 원격 전이(M)은 MX, M0 또는 M1의 병기가 부여될 수 있다. 치료될 암은 I기, IIA기, IIB기, IIIA기, IIIB기, IIIC기 또는 IV기로서 미국암연합위원회(AJCC) 분류에 따라 병기 부여될 수 있다. 치료될 암은 등급 GX (예를 들어, 등급은 평가될 수 없음), 등급 1, 등급 2, 등급 3 또는 등급 4로서 AJCC 분류에 따라 등급이 부여될 수 있다. 치료될 암은 pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b 또는 pN3c의 AJCC 병리학적 분류(pN)에 따라 병기 부여될 수 있다.
치료될 암은 DNA 세포분석, 유세포분석 또는 영상세포분석에 의해 평가될 수 있다. 치료될 암은 세포 분할의 합성 단계에서(예를 들어, 세포 분할의 S기에서) 세포의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 를 갖는 것으로 유형화될 수 있다. 치료될 암은 저 S-기 분획 또는 고 S-기 분획으로서 유형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "정상 세포"는 "세포 증식성 장애"의 부분으로부 분류될 수 없는 세포이다. 정상 세포는 원치않는 병태 또는 질환의 발생을 야기할 수 있는 비조절 또는 비정상 성장 또는 둘 다가 없다. 바람직하게는, 정상 세포는 정상적으로 작용하는 세포주기 검사점 제어 메커니즘을 가진다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "세포를 접촉시키는"은 화합물 또는 물질의 다른 조성물이 세포와 직접 접촉하거나 또는 세포에서 요망되는 생물학적 효과를 유도하기에 충분히 가까운 상태를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단독요법"은 치료가 필요한 대상체에 대한 단일 활성 또는 치료적 화합물의 투여를 지칭한다. 바람직하게는, 단독요법은 활성 화합물의 치료적 유효량의 투여를 수반할 것이다. 예를 들어, 암의 치료가 필요한 대상체에 대한 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체, 용매화물, 유사체 또는 유도체 중 하나를 이용하는 암 단독요법. 단독요법은 병용요법과 대비될 수 있으며, 이때 다중 활성 화합물의 조합은 바람직하게는 치료적 유효량으로 존재하는 조합의 각각의 성분과 함께 투여된다. 일 양태에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물을 이용하는 단독요법은 요망되는 생물학적 효과를 유도함에 있어 병용요법보다 더 효과적이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "치료하는" 또는 "치료하다"는 질환, 병태 또는 장애와 싸울 목적을 위한 환자의 관리 및 돌봄을 설명하며, 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 합병증을 완화하기 위한 또는 질환, 병태 또는 장애를 제거하기 위한 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 투여를 포함한다. 용어 "치료하다"는 또한 시험관내 세포 또는 동물 모델의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 또한 질환, 병태 또는 장애를 예방하기 위해 사용될 수 있고, 혹은 이러한 목적을 위해 적합한 후보를 동정하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "예방하는" 또는 "예방하다"는 질환, 병태 또는 장애의 증상 또는 합병증의 개시를 감소 또는 제거하는 것을 설명한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "완화"는 장애의 징후 또는 증상이 감소되는 과정을 설명하는 것을 의미한다. 중요하게는, 징후 또는 증상은 제거되는 일 없이 완화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 징후 또는 증상의 제거를 야기하며, 제거는 필요하지 않다. 유효 투약량은 징후 또는 증상의 중증도를 감소시킬 것으로 예상된다. 예를 들어, 다수 위치에서 생길 수 있는 암과 같은 장애의 징후 또는 증상은, 암의 중증도가 다수 위치 중 적어도 하나 내에서 감소된다면 완화된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중증도"는 전암성 또는 양성 상태로부터 악성 상태로 전환시키는 암의 가능성을 설명하는 것을 의미한다. 대안적으로, 또는 추가로, 중증도는, 예를 들어 TNM 시스템(국제 암연맹(International Union Against Cancer: UICC) 및 미국암연합위원회(AJCC)에 의해 허용됨)에 따라 또는 다른 기술-인식 방법에 의해 암 단계를 설명하는 것을 의미한다. 암 단계는 원발성 종양의 위치, 종양 크기, 종양의 수 및 림프절 연루(암의 림프절 내로의 퍼짐)와 같은 인자에 기반하여 암의 정도 또는 중증도를 지칭한다. 대안적으로, 또는 추가로, 중증도는 기술-인식된 방법에 의한 종양 등급을 설명하는 것을 의미한다(National Cancer Institute, www.cancer.gov 참조). 종양 등급은 그들이 현미경 하에서 보는 얼마나 비정상인지에 대해 그리고 얼마나 빠르게 종양이 성장하고 퍼질 가능성이 있는지에 대해 암세포를 분류하기 위해 사용된 시스템이다. 다수의 인자는 세포의 구조 및 성장 패턴을 포함하는 종양 등급을 결정할 때 고려된다. 종양 등급을 결정하기 위해 사용되는 구체적 인자는 각 유형의 암에 따라 다르다. 중증도는 또한, 얼마나 많은 종양 세포가 동일 조직 유형의 정상 세포와 비슷한지를 지칭하는, 분화로도 불리는 조직학적 등급을 기재한다(National Cancer Institute, www.cancer.gov 참조). 더 나아가, 중증도는 종양 세포 내 핵의 크기 및 형상 및 분화하는 종양 세포의 백분율을 지칭하는 핵 등급을 설명한다(National Cancer Institute, www.cancer.gov 참조).
본 발명의 다른 양태에서, 중증도는 종양이 성장 인자를 분화하거나, 세포밖 매트릭스를 분해하거나, 혈관을 발달시키거나, 병치된 조직에 대한 부착을 상실하거나, 또는 전이된 정도를 설명한다. 게다가, 원발성 종양이 전이된 위치의 수를 기재한다. 최종적으로 중증도는 변화하는 유형 및 위치의 종양을 처리하는 것의 어려움을 포함한다. 예를 들어, 수술불가능한 종양, 다수의 신체계에 대해 더 큰 접근을 갖는 해당 암(혈액학적 및 면역학적 종양), 및 전통적 치료에 가장 내성이 있는 암이 가장 중증인 것으로 고려된다. 이들 상황에서, 대상체의 기대 수명을 연장시키는 것 및/또는 통증을 감소시키는 것, 암성 세포의 비율을 감소시키는 것 또는 세포를 하나의 시스템으로 제한하는 것 및 암 병기/종양 등급/조직학적 등급/핵 등급을 개선시키는 것은 암의 징후 또는 증상을 완화시키는 것으로 고려된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "증상"은 질환, 질병, 손상의 적응증 또는 신체 내에서 정확하지 않은 무언가로서 정의된다. 증상은 증상을 경험하는 개체에 의해 느껴지거나 또는 의식되지만, 다른 사람에 의해서는 용이하게 의식되지 않을 수도 있다. 다른 사람은 비 의료 전문가로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "징후"는 또한 신체 내에서 정확하지 않은 무언가인 적응증으로서 정의된다. 그러나 징후는 의사, 간호사 또는 다른 의료 전문가에 의해 알 수 있는 것으로서 정의된다.
암은 거의 임의의 징후 또는 증상을 야기할 수 있는 질환의 그룹이다. 징후 및 증상은, 암이 암의 크기, 그것이 근처의 기관 또는 구조에 얼마나 영향을 미치는지에 의존할 것이다. 암이 퍼지면(전이됨), 증상을 신체의 다른 부분에서 나타날 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 크기의 감소를 초래할 수 있다. 종양 크기의 감소는 또한 "종양 퇴행"으로서 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 종양 크기는 치료 전 그의 크기에 비해 5% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 종양 크기는 10% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소되고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소되며; 가장 바람직하게는, 75% 이상만큼 감소된다. 종양 크기는 측정의 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 크기는 종양 직경으로서 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 용적의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 암 치료 후에, 종양 용적은 치료 전에 그의 크기에 비해 5% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 종양 용적은 10% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소되고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소되며; 가장 바람직하게는, 75% 이상만큼 감소된다. 종양 용적은 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 수의 감소를 초래한다. 바람직하게는, 치료 후에, 종양 수는 치료 전 수에 비해 5% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 종양 수는 10% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소되고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소되며; 가장 바람직하게는, 75% 초과만큼 감소된다. 종양 수는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 수는 육안으로 구체화된 배율로 볼 수 있는 종양을 계수화함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는, 구체화된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하는 것은 원발성 종양 부위로부터 떨어진 다른 조직 또는 기관에서 전이성 병변 수의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 전이성 병변의 수는 치료 전 수에 비해 5% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 전이성 병변의 수는 10% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소되고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소되며; 가장 바람직하게는, 75% 초과로 감소된다. 전이성 병변의 수는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 전이성 병변의 수는 육안에 대해 또는 구체화된 배율에서 전이성 병변을 계수화함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는, 구체화된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하는 것은 담체만을 받은 집단에 비해 치료된 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 가장 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가된다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는, 예를 들어 집단에 대해 활성 화합물의 치료 개시 후에 평균 생존 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는 또한, 예를 들어 집단에 대해 활성 화합물 치료의 제1 라운드의 완료 후에 평균 생존 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 미처리 대상체 집단에 비해 처리 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 및 가장 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가된다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는, 예를 들어 집단에 대해 활성 화합물에 의한 치료의 개시 후 평균 생존 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는 또한, 예를 들어 집단에 대해 활성 화합물 치료의 제1 라운드의 완료 후에 평균 생존 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체, 용매화물, 유사체 또는 유도체가 아닌 약물로 단독요법을 받은 집단에 비해 처리 대상체 집단의 평균 생존 시간에서의 증가를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 및 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가된다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는, 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 처리의 개시 후 생존의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간에서의 증가는 또한, 예를 들어 활성 화합물을 이용한 치료의 제1 라운드의 완료 후에 평균 생존 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 담체만을 받은 집단에 비해 처리된 대상체 집단의 사망률에서의 감소를 초래할 수 있다. 암을 치료하는 것은 미처리 집단에 비해 처리된 대상체 집단의 사망률에서의 감소를 초래할 수 있다. 암을 치료하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체, 용매화물, 유사체 또는 유도체가 아닌 약물로 단독요법을 받은 집단에 비해 처리 대상체 집단의 사망률에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 사망률은 2% 초과만큼; 더 바람직하게는, 5% 초과만큼; 더 바람직하게는, 10% 초과만큼; 및 가장 바람직하게는, 25% 초과만큼 감소된다. 처리된 대상체 집단의 사망률에서의 감소는 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 사망률에서의 감소는, 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 처리의 개시 후에 단위 시간 당 질환-관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 사망률에서의 감소는 또한, 예를 들어, 활성 화합물을 이용한 치료의 제1 라운드의 완료 후에 단위 시간 당 평균 질환-관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 성장률에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 종양 성장률은 치료 전 수에 비해 적어도 5%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 종양 성장률은 적어도 10%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되며; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소된다. 종양 성장률은 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 성장률은 단위 시간 당 종양 직경에서의 변화에 따라 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 재성장에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 종양 재성장은 5% 미만이고; 더 바람직하게는, 종양 재성장은 10%미만이며; 더 바람직하게는, 20%미만이고; 더 바람직하게는, 30%미만이며; 더 바람직하게는, 40%미만이고; 더 바람직하게는, 50%; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 미만이며; 가장 바람직하게는, 75%미만이다. 종양 재성장은 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 재성장은, 예를 들어 처리를 따른 사전 종양 수축 후에 종양 직경에서의 증가를 측정함으로써 측정된다. 종양 재성장에서의 감소는 치료가 중단된 후에 종양이 재발생되는 것의 실패로서 표시된다.
암을 치료하는 것은 세포 증식률에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 세포 증식률은 적어도 5%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 50%; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소된다. 세포 증식률은 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식률은, 예를 들어 단위 시간 당 조직 샘플 내 분할하는 세포 수를 측정함으로써 측정된다.
암을 치료하는 것은 증식 세포 비율에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 증식 세포 비율은 적어도 5%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소된다. 증식 세포 비율은 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 증식 세포 비율은, 예를 들어 조직 샘플 내 비분화 세포 수에 대해 분할 세포 수를 정량화함으로써 측정된다. 증식 세포 비율은 유사분열 지수와 동일할 수 있다.
암을 치료하는 것은 세포 증식의 영역 또는 구역 크기의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 세포 증식의 영역 또는 구역 크기는 치료 전 그의 크기에 비해 적어도 5%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되며; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소된다. 세포 증식의 영역 또는 구역 크기는 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식의 영역 또는 구역 크기는 세포 증식의 영역 또는 구역의 직경 또는 폭으로서 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 비정상 외관 또는 형태를 갖는 세포의 수 또는 비율에서의 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후에, 비정상 형태를 갖는 세포의 수는 치료 전 그의 크기에 비해 적어도 5%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소되며; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소되고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되며; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소된다. 비정상 세포 외관 또는 형태는 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 비정상 세포 형태는, 예를 들어 도립 조직 배양 현미경을 사용하여 현미경에 의해 측정될 수 있다. 비정상 세포 형태는 핵 다형성의 형태를 취할 수 있다.
암을 치료하는 것은 세포사를 초래할 수 있으며, 바람직하게는, 세포사는 집단 내 세포 수의 적어도 10%의 감소를 초래한다. 더 바람직하게는, 세포사는 적어도 20%의 감소; 더 바람직하게는, 적어도 30%의 감소, 더 바람직하게는, 적어도 40%의 감소, 더 바람직하게는, 적어도 50%의 감소; 가장 바람직하게는, 적어도 75%의 감소를 의미한다. 집단에서 세포의 수는 임의의 재생가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단에서 세포의 수는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS), 면역형광 현미경 및 광현미경에 의해 측정될 수 있다. 세포사를 측정하는 방법은 문헌[Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003]에서 나타낸 바와 같다. 양태에서, 세포사는 세포자멸사에 의해 일어난다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "선택적으로"는 다른 집단에서보다 하나의 집단에서 더 높은 빈도로 일어나는 경향을 의미한다. 화합물 집단은 세포 집단일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 암 또는 전암성 세포 상에서 선택적으로 작용하지만, 정상 세포 상에서는 작용하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 하나의 분자 표적(예를 들어, 표적 단백질 메틸트랜스퍼라제)를 조절하기 위해 선택적으로 작용하지만, 다른 분자 표적(예를 들어, 비표적 단백질 메틸트랜스퍼라제)를 상당하게 조절하지는 않는다. 본 발명은 또한 단백질 메틸트랜스퍼라제와 같은 효소의 활성을 선택적으로 저해하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 사건은, 그것이 집단 B에 비해 집단 A에서 더 빈번하게 2배 초과로 일어난다면, 집단 B에 비해 집단 A에서 선택적으로 일어난다. 사건은, 그것이 집단 A에서 5배 초과로 일어난다면, 선택적으로 일어난다. 사건은, 그것이 집단 A에서 더 빈번하게 10배 초과로; 더 바람직하게는, 50배 초과로; 훨씬 더 바람직하게는, 100배 초과로; 가장 바람직하게는, 집단 B에 비해 집단 A에서 더 빈번하게 1000배 초과로 일어난다면 선택적으로 일어난다. 예를 들어, 세포사는, 그것이 정상 세포에 비해 암세포에서 2배 초과로 빈번하게 일어난다면, 암세포에서 선택적으로 일어나는 것으로 언급된다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 분자 표적(예를 들어, 표적 단백질 메틸트랜스퍼라제)의 활성을 조절할 수 있다. 조절하는 것은 분자 표적의 활성을 자극 또는 저해하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은, 그것이 상기 화합물의 존재만을 결여하는 동일 조건 하에서 분자 표적의 활성에 비해 적어도 2배만큼 분자 표적의 활성을 자극 또는 저해한다면, 분자 표적의 활성을 조절한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은, 그것이 상기 화합물의 존재만을 결여하는 동일 조건 하에서 분자 표적의 활성에 비해 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배만큼 분자 표적의 활성을 자극 또는 저해한다면, 분자 표적의 활성을 조절한다. 분자 표적의 활성은 임의의 재생가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 분자 표적의 활성은 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 분자 표적의 활성은 효소적 활성 분석 또는 DNA 결합 분석에 의해 시험관내에서 측정될 수 있고, 혹은 분자 표적의 활성은 리포터 유전자의 발현을 분석함으로써 생체내에서 측정될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은, 화합물의 첨가가 상기 화합물의 존재만을 결여하는 동일 조건 하에서 분자 표적의 활성에 비해 10% 초과만큼 분자 표적의 활성을 자극 또는 저해한다면, 분자 표적의 활성을 유의하게 조절하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "동질효소 선택적"은 효소의 제2 동형에 비해 효소의 제1 동형의 우선적인 저해 또는 자극(예를 들어, 단백질 메틸트랜스퍼라제 동질효소 베타에 비해 단백질 메틸트랜스퍼라제 동질효소 알파의 우선적인 저해 또는 자극)을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 생물학적 효과를 달성하는데 필요한 투약량에서 최소 4배 차이, 바람직하게는 10배 차이, 더 바람직하게는 50배 차이를 입증한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 이 차이가 저해 범위에 걸쳐 있고, 차이는 관심 대상의 분자 표적에 대해 IC50에서, 즉, 50% 저해에서 예시된다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물을 세포 또는 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것은 관심 대상의 단백지리 메틸트랜스퍼라제의 활성에 대한 조절(즉, 자극 또는 저해)을 초래할 수 있다.
H3-K27의 메틸화의 검출, 트라이메틸화된 H3-K27의 형성, 모노메틸화된 H3-K27의 다이메틸화된 H3-K27로의 전환, 또는 다이메틸화된 H3-K27의 트라이메틸화된 H3-K27로의 전환은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 방법은 미국 특허 제20120071418호에서 찾을 수 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물을 세포 또는 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것은 세포내 표적(예를 들어, 기질) 활성의 조절(즉, 자극 또는 저해)를 초래한다. 몇몇 세포내 표적은, 단백질 메틸트랜스퍼라제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 발명의 화합물을 이용하여 조절될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 유효량은 정상 세포에 대해 상당하게 세포독성이 아니다. 화합물의 치료적 유효량은, 치료적 유효량으로 화합물의 투여가 정상 세포의 10% 초과에서 세포사를 유도하지 않는다면, 정상 세포에 대해 유의하게 세포독성이 아니다. 화합물의 치료적 유효량은, 치료적 유효량으로 화합물의 투여가 정상 세포의 10% 초과에서 세포사를 유도하지 않는다면, 정상 세포의 생존도에 상당하게 영향을 미치지 않는다. 양태에서, 세포사는 세포자멸사에 의해 생긴다.
세포를 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물과 접촉시키는 것은 암세포에서 선택적으로 세포사를 유도 또는 활성화할 수 있다. 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물을 투여하는 것은 암세포에서 선택적으로 세포사를 유도 또는 활성화할 수 있다. 세포를 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물과 접촉시키는 것은 세포 증식성 장애에 의해 영향받은 하나 이상의 세포에서 선택적으로 세포사를 유도할 수 있다. 바람직하게는, 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물을 투여하는 것은 세포 증식성 장애에 의해 영향받은 하나 이상의 세포에서 선택적으로 세포사를 유도할 수 있다.
당업자는 본 명세서에 논의된 공지된 기술 또는 동등한 기술의 상세한 설명을 위해 일반적 참고문헌을 참조할 수 있다. 이들 교재는[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990)]를 포함한다. 이들 교재는 물론 본 발명의 양태를 제조하거나 또는 사용함에 있어 참조될 수 있다.
본 명세서에 기재되니 임의의 방법으로 사용될 수 있는 화합물(즉, EZH2 저해제)는 하기 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 가질 수 있다:
[화학식 I]
식 중,
R701은 H, F, OR707, NHR707, -(C≡C)-(CH2)n7-R708, 페닐, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬, 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬이되, 페닐, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬 또는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬은 각각 독립적으로 할로, C1-3 알킬, OH, O-C1-6 알킬, NH-C1-6 알킬, 및, C3-8 사이클로알킬 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬로 치환된 C1-3 알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되며, 각각의 O-C1-6 알킬 및 NH-C1-6 알킬은 하이드록실, O-C1-3 알킬 또는 NH-C1-3 알킬로 선택적으로 치환되고, 각각의 O-C1-3 알킬 및 NH-C1-3 알킬은 O-C1-3 알킬 또는 NH-C1-3 알킬로 선택적으로 추가로 치환되며;
각각의 R702 및 R703은 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-6 알콕실 또는 C6-C10 아릴옥시이고, 각각은 하나 이상의 할로로 선택적으로 치환되고;
각각의 R704 및 R705는 독립적으로 C1-4 알킬이며;
R706은 N(C1-4 알킬)2에 의해 치환된 사이클로헥실이되, C1-4 알킬 중 하나 또는 둘 다는 C1-6 알콕시로 치환되거나; 또는 R706은 테트라하이드로피라닐이고;
R707은 하이드록실, C1-4 알콕시, 아미노, 모노- 또는 다이-C1-4 알킬아미노, C3-8 사이클로알킬 및 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이되, C3-8 사이클로알킬 또는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬은 각각 독립적으로 C1-3 알킬로 추가로 선택적으로 치환되고;
R708는 OH, 할로, 및 C1-4 알콕시, 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬, 또는 O-C1-6 알킬이되, 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬은 선택적으로 OH 또는 C1-6 알킬로 추가로 치환될 수 있으며;
n7은 0, 1 또는 2이다.
예를 들어, R706은 N(C1-4 알킬)2에 의해 치환된 사이클로헥실이되, C1-4 알킬 중 하나는 비치환이고, 나머지는 메톡시로 치환된다.
예를 들어, R706은 이다.
예를 들어, 화학식 II의 화합물은:
[화학식 II]
이다.
예를 들어, R702는 메틸 또는 아이소프로필이고, R703은 메틸 또는 메톡실이다.
예를 들어, R704는 메틸이다.
예를 들어, R701은 OR707이고, R707은 OCH3 또는 몰폴린으로 선택적으로 치환된 C1-3 알킬이다.
예를 들어, R701은 H 또는 F이다.
예를 들어, R701은 테트라하이드로피라닐, 페닐, 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 이미다졸릴 또는 피라졸릴이며, 이들 각각은 메틸, 메톡시, 몰폴린으로 치환된 에틸 또는 -OCH2CH2OCH3으로 선택적으로 치환된다.
예를 들어, R708은 몰폴린, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 다이아제판, 또는 아제티딘이며, 각각은 선택적으로 OH 또는 C1-6 알킬로 치환된다.
예를 들어, R708은 몰폴린이다.
예를 들어, R708은 C1-6 알킬로 치환되는 피페라진이다.
예를 들어, R708은 t-뷰틸 또는 C(CH3)2OH이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 화합물(즉, EZH2 저해제)는 하기 화학식 III의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 가질 수 있다:
[화학식 III]
.
식 중,
R801은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 7원 헤테로사이클로알킬, 페닐 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, 이들의 각각은 O-C1-6 알킬-Rx 또는 NH-C1-6 알킬-Rx로 치환되되, Rx는 하이드록실, O-C1-3 알킬 또는 NH-C1-3 알킬이며, Rx가 하이드록실일 때를 제외하고, Rx는 O-C1-3 알킬 또는 NH-C1-3 알킬로 선택적으로 추가로 치환되며; 또는 R801은 -Q2-T2로 치환된 페닐이되, Q2는 결합 또는 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T2는 선택적으로 치환된 4- 내지 12-원 헤테로사이클로알킬이며; R801은 선택적으로 추가로 치환되고;
각각의 R802 및 R803은 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-6 알콕실 또는 C6-C10 아릴옥시이며, 각각은 선택적으로 하나 이상의 할로로 치환되고;
각각의 R804 및 R805는 독립적으로 C1-4 알킬이며;
R806은 -Qx-Tx이되, Qx는 결합 또는 C1-4 알킬 링커이고, Tx는 H, 선택적으로 치환된 C1-4 알킬, 선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬 또는 선택적으로 치환된 4- 내지 14-원 헤테로사이클로알킬이다.
예를 들어, 각각의 Qx 및 Q2는 독립적으로 결합 또는 메틸 링커이고, 각각의 Tx 및 T2는 독립적으로 테트라하이드로피라닐, 1, 2 또는 3개의 C1-4 알킬기에 의해 치환되는 피페리디닐 또는 N(C1-4 알킬)2에 의해 치환된 사이클로헥실이되, C1-4 알킬 중 하나 또는 둘 다는 C1-6 알콕시로 선택적으로 치환되며;
예를 들어, R806은 N(C1-4 알킬)2에 의해 치환된 사이클로헥실이거나, 또는 R806은 테트라하이드로피라닐이다.
예를 들어, R806은 이다.
예를 들어, R801은 페닐 또는 O-C1-6 알킬-Rx로 치환된 5- 또는 6-원 헤테로아릴이거나, 또는 R801은 CH2-테트라하이드로피라닐로 치환된 페닐이다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 화학식 IVa 또는 IVb을 가진다:
식 중, Z'은 CH 또는 N이고, R807은 C2-3 알킬-Rx이다.
예를 들어, R807은 -CH2CH2OH, -CH2CH2OCH3 또는 -CH2CH2OCH2CH2OCH3이다.
예를 들어, R802는 메틸 또는 아이소프로필이고, R803은 메틸 또는 메톡실이다.
예를 들어, R804는 메틸이다.
본 발명의 화합물은 하기 화학식 V 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스터를 가질 수 있다:
[화학식 V]
.
식 중,
R2, R4 및 R12는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이고;
R6은 C6-C10 아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, 이들 각각은 하나 이상의 -Q2-T2로 선택적으로 치환되되, Q2는 결합 또는 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T2는 H, 할로, 사이아노, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A--C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -NRbC(O)ORa, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb 또는 RS2이며, 이때 각각의 Ra, Rb 및 Rc는 독립적으로 H 또는 RS3이고, A-는 약제학적으로 허용가능한 음이온이며, 각각의 RS2 및 RS3은 독립적으로, C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께 0 또는 1개의 추가적인 헤테로원자를 갖는 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS2, RS3 및 Ra 및 Rb에 의해 형성된 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 고리는 하나 이상의 -Q3-T3으로 선택적으로 치환되되, Q3은 결합 또는 C1-C3 알킬 링커이고, 각각은 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 선택적으로 치환되며, T3은 할로, 사이아노, C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, ORd, COORd, -S(O)2Rd, -NRdRe 및 -C(O)NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, 또는 -Q3-T3은 옥소; 또는 임의의 2개의 이웃하는 -Q2-T2이며, 그들이 부착된 원자와 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5- 또는 6-원 고리를 형성하고, 할로, 하이드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되며;
R7은 -Q4-T4이며, 이때 Q4는 결합, C1-C4 알킬 링커, 또는 C2-C4 알케닐 링커이고, 각각의 링커는 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 선택적으로 치환되며, T4는 H, 할로, 사이아노, NRfRg, -ORf, -C(O)Rf, -C(O)ORf, -C(O)NRfRg, -C(O)NRfORg, -NRfC(O)Rg, -S(O)2Rf 또는 RS4이되, 각각의 Rf 및 Rg는 독립적으로 H 또는 RS5이며, 각각의 RS4 및 RS5는 독립적으로 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 각각의 RS4 및 RS5는 하나 이상의 -Q5-T5로 선택적으로 치환되되, Q5는 결합, C(O), C(O)NRk, NRkC(O), S(O)2 또는 C1-C3 알킬 링커이며, Rk는 H 또는 C1-C6 알킬이고, T5는 H, 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴 또는 S(O)qRq이며, 이때 q는 0, 1 또는 2이고, Rq는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, T5가 H, 할로, 하이드록실, 또는 사이아노일 때를 제외하고 T5는 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되거나; 또는 -Q5-T5는 옥소이고;
R8은 H, 할로, 하이드록실, COOH, 사이아노, RS6, ORS6 또는 COORS6이며, 이때 RS6은 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 또는 다이-C1-C6 알킬아미노이고, RS6은 할로, 하이드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 및 다이-C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되거나; 또는 R7 및 R8은 그들이 부착된 N 원자와 함께 0 내지 2개의 추가적인 헤테로원자를 갖는 4 내지 11-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, R7 및 R8에 의해 형성된 각각의 4 내지 11-원 헤테로사이클로알킬 고리는 하나 이상의 -Q6-T6으로 선택적으로 치환되되, Q6은 결합, C(O), C(O)NRm, NRmC(O), S(O)2, 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rm은 H 또는 C1-C6 알킬이며, T6은 H, 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)pRp이며, 이때, p는 0, 1 또는 2이고, Rp는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, T6이 H, 할로, 하이드록실, 또는 사이아노일 때를 제외하고, T6은 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되거나; 또는 -Q6-T6은 옥소이다.
예를 들어, R6은 C6-C10 아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, 이들 각각은 선택적으로, 하나 이상의 -Q2-T2로 독립적으로 치환되되, Q2는 결합 또는 C1-C3 알킬 링커이고, T2는 H, 할로, 사이아노, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A- -C(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -S(O)2Ra 또는 RS2이며, 이때 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 RS3이고, 각각의 RS2 및 RS3은 독립적으로, C1-C6 알킬이거나, 또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 또는 1개의 추가적인 헤테로원자를 갖는 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS2, RS3 및 Ra 및 Rb에 의해 형성된 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리는 선택적으로, 하나 이상의 -Q3-T3으로 독립적으로 치환되되, Q3은 결합 또는 C1-C3 알킬 링커이고, T3은 할로, C1-C6 알킬, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, ORd, -S(O)2Rd 및 -NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, 또는 -Q3-T3은 옥소이거나; 또는 임의의 2개의 이웃하는 -Q2-T2는 그들이 부착된 원자와 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5- 또는 6-원을 형성한다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 화학식 VI의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 VI]
식 중, Q2는 결합 또는 메틸 링커이고, T2는 H, 할로, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A- 또는 -S(O)2NRaRb이며, R7은 피페리디닐, 테트라하이드로피란, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이고, 각각은 하나의 -Q5-T5로 선택적으로 치환되며, R8은 에틸이다.
본 발명의 화합물은 하기 화학식 VIa를 가질 수 있다:
[화학식 VIa]
식 중,
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 RS3이고, RS3은 C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 또는 1개의 추가적인 헤테로원자를 갖는 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS3 및 Ra 및 Rb에 의해 형성된 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬 고리는 하나 이상의 -Q3-T3으로 선택적으로 치환되되, Q3은 결합 또는 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 각각 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T3은 할로, 사이아노, C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, ORd, COORd, -S(O)2Rd, -NRdRe 및 -C(O)NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고, 또는 -Q3-T3은 옥소이며;
R7은 -Q4-T4이고, 이때 Q4는 결합, C1-C4 알킬 링커 또는 C2-C4 알케닐 링커이며, 각각의 링커는 할로, 사이아노, 하이드록실 또는 C1-C6 알콕시로 선택적으로 치환되고, T4는 H, 할로, 사이아노, NRfRg, -ORf, -C(O)Rf, -C(O)ORf, -C(O)NRfRg, -C(O)NRfORg, -NRfC(O)Rg, -S(O)2Rf 또는 RS4이며, 이때 각각의 Rf 및 Rg는 독립적으로 H 또는 RS5이고, 각각의 RS4 및 RS5는 독립적으로 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이며, 각각의 RS4 및 RS5는 하나 이상의 -Q5-T5로 선택적으로 치환되되, Q5는 결합, C(O), C(O)NRk, NRkC(O), S(O)2 또는 C1-C3 알킬 링커이며, Rk는 H 또는 C1-C6 알킬이고, T5는 H, 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)qRq이고, 이때 q는 0, 1 또는 2이며, Rq는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T5가 H, 할로, 하이드록실 또는 사이아노일 때를 제외하고, T5는 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되고; 또는 -Q5-T5는 옥소이며; 단, R7은 H가 아니고;
R8는 H, 할로, 하이드록실, COOH, 사이아노, RS6, ORS6 또는 COORS6이며, 이때 RS6은 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노 또는 다이-C1-C6 알킬아미노이고, RS6은 할로, 하이드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노 및 다이-C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되며; 또는 R7 및 R8은 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 내지 2개의 추가적인 헤테로원자를 가지고 선택적으로 하나 이상의 -Q6-T6로 선택적으로 치환된 4 내지 11-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하되, Q6는 결합, C(O), C(O)NRm, NRmC(O), S(O)2 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rm은 H 또는 C1-C6 알킬이고, T6는 H, 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)pRp 이고, 이때 p는 0, 1 또는 2이며, Rp는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T6는 H, 할로, 하이드록실 또는 사이아노일 때를 제외하고, T6는 할로, C1-C6 알킬, 하이드록실, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 다이-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되거나; 또는 -Q6-T6는 옥소이다.
예를 들어, Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, N 원자에 대해 0 또는 1개의 추가적인 헤테로원자를 갖는 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 고리는 하나 이상의 -Q3-T3으로 선택적으로 치환되되, 헤테로사이클로알킬은 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 트라이아졸리디닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리닐이다.
예를 들어, R7은 C3-C8 사이클로알킬 또는 4 내지 7-원 헤테로사이클로알킬이며, 각각은 하나 이상의 -Q5-T5로 선택적으로 치환된다.
예를 들어, R7은 피페리디닐, 테트라하이드로피란, 테트라하이드로-2H-티오피라닐, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 피롤리디닐 또는 사이클로헵틸이며, 각각은 하나 이상의 -Q5-T5로 선택적으로 치환된다.
예를 들어, R8은 할로, 하이드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 사이아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노 및 다이-C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 H이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 화합물은:
(화합물 A), 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 화합물은:
, 이들의 입체이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 화합물은:
, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용에 적합한 화합물은 화학식 VII의 화합물 또는 이의 염을 포함한다:
[화학식 VII]
식 중,
V1는 N 또는 CR7이고,
V2는 N 또는 CR2이며, 단, V1이 N이고, V2가 N이고,
X 및 Z는 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)바이사가클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로, 사이아노, -CORa, - CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
Y는 H 또는 할로이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C6-C10)바이사가클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb이며;
R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트라이플루오로메틸, 알콕시 또는 할로이고, 이때 상기 (C1-C8)알킬은 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬 또는 알콕시이며;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 사이아노, 트라이플루오로메틸, -NRaRb 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)사이클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)사이클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)바이사가클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로사이클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되며;
임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기는 -O(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C8)알킬-헤테로사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬-헤테로사이클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra,- CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, OC(O)NRaRb, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa., -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb,-NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C6-C10)바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이되, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기는 할로, 하이드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬 및 SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5 내지 8원 포화 또는 불포화 고리를 표시하되, 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 하이드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되되, 상기 고리는 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합되거나;
또는 a 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합된 6- 내지 10-원 브릿지 이환식 고리계를 표시하고;
각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa., -SO2Ra,
-NRaC(O)ORa, -NRaRb 또는 -CO2Ra이다.
화삭식 I의 일반 구조에 의해 포함되는 화합물의 하위그룹은 다음과 같이 표시된다:
화학식 VII의 하위그룹 A
X 및 Z는 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -NRaRb 및 -ORa로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H 또는 F이며;
R1은 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트라이플루오로메틸, 알콕시 또는 할로이며, 이때 상기 (C1-C8)알킬은 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택된 1 내지 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
R7은 수소, (C1-C3)알킬 또는 알콕시이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 사이아노, 트라이플루오로메틸,-NRaRb 및 할로로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R6은 수소, 할로, 사이아노, 트라이플루오로메틸, 아미노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬;, 아릴, 헤테로아릴, 아실아미노; (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐; -SO2Ra; -SO2NRaRb 및-NRaSO2Rb으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐기는 -O(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C8)알킬-헤테로사이클로알킬, (C3-C8)사이클로알킬-헤테로사이클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, - NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C6-C10)바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이되, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기는 할로, 하이드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬 및 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되고;
또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5 내지 8원 포화 또는 불포화 고리를 표시하되, 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 하이드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되고, 상기 고리는 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합되며;
또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합된 6- 내지 10-원 브릿지 이환식 고리계를 표시한다. 이 특정 하위그룹 A에서 아릴 또는 헤테로아릴기는 퓨란, 티오펜, 피롤, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 피라졸, 옥사다이아졸, 티아다이아졸, 트라이아졸, 테트라졸, 벤조퓨란, 벤조티오펜, 벤조옥사졸, 벤조티아졸, 페닐, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 트라이아진, 테트라진, 퀴놀린, 신놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 및 나프티리딘 또는 다음과 같은 다른 아릴 또는 헤테로아릴기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고:
(1)에서,
A는 O, NH 또는 S이며; B는 CH 또는 N이고, C는 수소 또는 C1-C8 알킬이거나; 또는
(2)에서,
D는 수소 또는 C1-C8 알킬에 의해 선택적으로 치환된 N 또는 C이고; 또는
(3)에서,
E는 NH 또는 CH2이고; F는 O 또는 CO이며; G는 NH 또는 CH2이며; 또는
(4)에서,
J는 O, S 또는 CO이고; 또는
(5)에서,
Q는 CH 또는 N이고;
M은 CH 또는 N이며;
L/(5)는 수소, 할로, 아미노, 사이아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb 또는 -ORa이되,
임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되고; Ra 및 Rb는 상기와 같이 정의되며; 또는
(6)에서,
L/(6)은 NH 또는 CH2이고; 또는
(7)에서,
M/(7)은 수소, 할로, 아미노, 사이아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb 또는 -ORa이되,
임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및
-OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3기에 의해 선택적으로 치환되고; Ra 및 Rb는 상기와 같이 정의되거나; 또는
(8)에서,
P는 CH2, NH, O 또는 S이고; Q/(8)는 CH 또는 N이며; n은 0 내지 2이거나; 또는
(9)에서,
S/(9) 및 T/(9)는 C이거나, 또는 S/(9)는 C이고 T/(9)는 N이거나, 또는 S/(9)는 N이고 T/(9)는 C이며;
R은 수소, 아미노, 메틸, 트라이플루오로메틸 또는 할로이고;
U는 수소, 할로, 아미노, 사이아노, 나이트로, 트라이플루오로메틸, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -ORa 또는 4-(1H-피라졸-4-일)이며,
임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra,-CONRaRb, -SRa, SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, - OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3기에 의해 선택적으로 치환되되; Ra 및 Rb는 상기 정의한 바와 같다.
화학식 VII의 서브그룹 B
X 및 Z는 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -NRaRb 및 -ORa로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
Y는 H이며;
R1은 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬이고;
R2는 수소, (C1-C3)알킬 또는 할로이며, 이때 상기 (C1-C3)알킬은 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택된 1 내지 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
R7은 수소, (C1-C3)알킬 또는 알콕시이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬 또는 할로이며;
R6은 수소, 할로, 사이아노, 트라이플루오로메틸, 아미노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아실아미노; (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐, -SO2Ra, -SO2NRaRb 또는 -NRaSO2Rb이고;
임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐 또는 헤테로아릴알키닐기는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, - SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C6-C10)바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이되, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 바이사가클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기는 독립적으로 selected from 할로, 하이드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬 및 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고;
또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5 내지 8원 포화 또는 불포화 고리를 표시하되, 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 하이드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되고, 상기 고리는 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합되며;
또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께 취해져서 (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 선택적으로 융합된 6- 내지 10-원 브릿지 이환식 고리계를 표시한다. 이 정의에서 아릴 또는 헤테로아릴은 퓨란, 티오펜, 피롤, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 피라졸, 옥사다이아졸, 티아다이아졸, 트라이아졸, 테트라졸, 벤조퓨란, 벤조티오펜, 벤조옥사졸, 벤조티아졸, 페닐, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 트라이아진, 테트라진, 퀴놀린, 신놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린 및 나프티리딘 또는 다음과 같은 다른 아릴 또는 헤테로아릴기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고:
(1)에서,
A는 O, NH 또는 S이며; B는 CH 또는 N이고, C는 수소 또는 C1-C8 알킬이거나; 또는
(2)에서,
D는 수소 또는 C1-C8 알킬에 의해 선택적으로 치환된 N 또는 C이고; 또는
(3)에서,
E는 NH 또는 CH2이고; F는 O 또는 CO이며; G는 NH 또는 CH2이며; 또는
(4)에서,
J는 O, S 또는 CO이고; 또는
(5)에서,
Q는 CH 또는 N이고;
M은 CH 또는 N이며;
L/(5)는 수소, 할로, 아미노, 사이아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb 또는 -ORa이되,
임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 선택적으로 치환되고; Ra 및 Rb는 상기와 같이 정의되며; 또는
(6)에서,
L/(6)은 NH 또는 CH2이고; 또는
(7)에서,
M/(7)은 수소, 할로, 아미노, 사이아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb,
-NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb 또는 -ORa이되,
임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra, - CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3기에 의해 선택적으로 치환되고; Ra 및 Rb는 상기와 같이 정의되거나; 또는
(8)에서,
P는 CH2, NH, O 또는 S이고; Q/(8)는 CH 또는 N이며; n은 0 내지 2이거나; 또는
(9)에서,
S/(9) 및 T/(9)는 C이거나, 또는 S/(9)는 C이고 T/(9)는 N이거나, 또는 S/(9)는 N이고 T/(9)는 C이며;
R은 수소, 아미노, 메틸, 트라이플루오로메틸 또는 할로이고;
U는 수소, 할로, 아미노, 사이아노, 나이트로, 트라이플루오로메틸, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -ORa 또는 4-(1H-피라졸-4-일)이며,
임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)사이클로알킬기는 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C5-C8)사이클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 사이아노, -CORa, -CO2Ra,-CONRaRb,-SORa,-SO2Ra, -SO2NRaRb, 나이트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3기에 의해 선택적으로 치환되되; Ra 및 Rb는 상기 정의한 바와 같다.
일부 실시형태에서, EZH2는 저해제는:
, 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
일부 실시형태에서, EZH2는 저해제는:
, 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
본 명세서에 기재된 화합물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 화학식 VII를 갖는 화합물은 WO 2011/140325호; WO 2011/140324호; 및 WO 2012/005805호에 기재된 방법에 따라 합성될 수 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "알킬", "C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 알킬" 또는 "C1-C6 알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 직쇄(선형) 포화 지방족 탄화수소기 및 C3, C4, C5 또는 C6 분지 포화 지방족 탄화수소기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬기를 포함하도록 의도된다. 알킬의 예는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, s-뷰틸, t-뷰틸, n-펜틸, s-펜틸 또는 n-헥실과 같은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 직쇄 또는 분지된 알킬은 6개 이하의 탄소 원자(예를 들어, 직쇄에 대해 C1-C6, 분지쇄에 대해 C3-C6)를 가지며, 다른 실시형태에서, 직쇄 또는 분지된 알킬은 4개 이하의 탄소 원자를 가진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 30개의 탄소 원자(예를 들어, C3-C10)를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 모노- 또는 다고리(예를 들어, 축합, 브릿지 또는 스피로 고리)계를 지칭한다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헵테닐 및 아다만틸을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "헤테로사이클로알킬"은, 달리 특정되지 않는 한, 하나 이상의 헤테로원자(예컨대 O, N, S 또는 Se)를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 3 내지 8원 단환식, 7 내지 12원 이환식(축합, 브릿지 또는 스피로 고리), 또는 11 내지 14원 삼환식 고리계(축합, 브릿지 또는 스피로 고리)를 지칭한다. 헤테로사이클로알킬기의 예는 피페리디닐, 피페라지닐, 피롤리디닐, 다이옥사닐, 테트라하이드로퓨라닐, 아이소인돌리닐, 인돌리닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 트라이아졸리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 옥시란일, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 다이하이드로피라닐, 피라닐, 몰폴리닐, 1,4-다이아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵타닐, 2-옥사-6-아자스피로[3.3]헵타닐, 2,6-다이아자스피로[3.3]헵타닐, 1,4-다이옥사-8-아자스피로[4.5]데카닐 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "선택적으로 치환된 알킬"은 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상에서 하나 이상의 수소 원자를 대체하는 지정된 치환체를 갖는 비치환된 알킬 또는 알킬을 지칭한다. 이러한 치환체는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
"아릴알킬" 또는 "아르알킬" 모이어티는 아릴(예를 들어, 페닐메틸(벤질))로 치환된 알킬이다. "알킬아릴" 모이어티는 알킬로 치환된 아릴(예를 들어, 메틸페닐)이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "알킬 링커"는 C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 직쇄(선형) 포화 2가 지방족 탄화수소기 및 C3, C4, C5 또는 C6 분지 포화 지방족 탄화수소기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, C1-C6 알킬 링커는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬 링커기를 포함하도록 의도된다. 알킬 링커의 예는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 모이어티, 예컨대, 메틸(-CH2-), 에틸(-CH2CH2-), n-프로필(-CH2CH2CH2-), i-프로필(-CHCH3CH2-), n-뷰틸(-CH2CH2CH2CH2-), s-뷰틸(-CHCH3CH2CH2-), i-뷰틸(-C(CH3) 2CH2-), n-펜틸(-CH2CH2CH2CH2CH2-), s-펜틸(-CHCH3CH2CH2CH2-) 또는 n-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"알케닐"은 길이가 유사한 불포화 지방족기 및 상기 기재한 알킬에 대한 가능한 치환을 포함하지만, 적어도 하나의 이중 결합을 함유한다. 예를 들어, 용어 "알케닐"은 직쇄 알케닐기(예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 뷰테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐), 및 분지 알케닐기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 직쇄 또는 분지된 알케닐기는 그의 백본에서 6개 이하의 탄소원자를 가진다(예를 들어, 직쇄에 대해 C2-C6, 분지쇄에 대해 C3-C6). 용어 "C2-C6"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알케닐기를 포함한다. 용어 "C3-C6"은 3 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알케닐기를 포함한다.
용어 "선택적으로 치환된 알케닐"은 하나 이상의 탄화수소 백본 탄소 원자 상에서 하나 이상의 수소 원자를 대체하는 지정된 치환체를 갖는 비치환된 알케닐 또는 알케닐을 지칭한다. 이러한 치환체는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
"알키닐"은 길이가 유사한 불포화 지방족 및 상기 기재한 알킬에 대해 가능한 치환을 포함하지만, 적어도 하나의 삼중결합을 함유한다. 예를 들어, "알키닐"은 직쇄 알키닐기(예를 들어, 에티닐, 프로피닐, 뷰티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐) 및 분지된 알키닐기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 직쇄 또는 분지된 알키닐기는 그의 백본에서 6개 이하의 탄소 원자를 가진다(예를 들어, 직쇄에 대해 C2-C6, 분지쇄에 대해 C3-C6). 용어 "C2-C6"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알키닐기를 포함한다. 용어 "C3-C6"은 3 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알키닐기를 포함한다.
용어 "선택적으로 치환된 알키닐"은 하나 이상의 탄화수소 백본 탄소 원자 상에서 하나 이상의 수소 원자를 대체하는 지정된 치환체를 갖는 비치환된 알키닐 또는 알키닐을 지칭한다. 이러한 치환체는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
다른 선택적으로 치환된 모이어티(예컨대 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴)는 비치환된 모이어티와 지정된 치환체 중 하나 이상을 갖는 모이어티를 둘 다 포함한다. 예를 들어, 치환된 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 알킬기로 치환된 것, 예컨대 2,2,6,6-테트라메틸-피페리디닐 및 2,2,6,6-테트라메틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐을 포함한다.
"아릴"은 "컨쥬게이트된" 또는 적어도 하나의 방향족 고리를 지니는 다환식계를 포함하는 방향성을 지니는 기를 포함하며, 고리 구조 내에 임의의 헤테로원자를 함유하지는 않는다. 예는 페닐, 벤질, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈레닐 등을 포함한다.
"헤테로아릴"기는 고리 구조 내에 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 것을 제외하고, 상기 정의한 바와 같은 아릴기이며, 또한 "아릴 헤테로사이클" 또는 "헤테로방향족"으로서 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 탄소 원자 및 하나 이상의 헤테로원자, 예를 들어, 1 또는 1 내지 2 또는 1 내지 3 또는 1 내지 4 또는 1 내지 5 또는 1 내지 6개의 헤테로원자, 또는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 헤테로원자로 이루어진 안정한 5-, 6- 또는 7-원 단환식 또는 7-, 8-, 9-, 10-, 11- 또는 12-원 이환식 방향족 헤테로환식 고리를 포함하도록 의도되며, 독립적으로 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 질소 원자는 치환 또는 비치환된(즉, N 또는 NR, 여기서 R은 H 또는 정의된 바와 같은 다른 치환체)될 수 있다. 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있다(즉, N→O 및 S(O)p, 여기서 p = 1 또는 2). 방향족 헤테로사이클 내 S 및 O 원자의 전체 수는 1 이하라는 것을 주목하여야 한다.
헤테로아릴기의 예는 피롤, 퓨란, 티오펜, 티아졸, 아이소티아졸, 이미다졸, 트라이아졸, 테트라졸, 피라졸, 옥사졸, 아이소옥사졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘 등을 포함한다.
더 나아가, 용어 "아릴" 및 "헤테로아릴"은 다환식 아릴 및 헤테로아릴기, 예를 들어, 삼환식, 이환식, 예를 들어, 나프탈렌, 벤조옥사졸, 벤조다이옥사졸, 벤조티아졸, 벤조이미다졸, 벤조티오펜, 메틸렌다이옥시페닐, 퀴놀린, 아이소퀴놀린, 나프트리딘, 인돌, 벤조퓨란, 퓨린, 벤조퓨란, 데아자퓨린, 인돌리진을 포함한다.
다환식 방향족 고리의 경우에, 모든 고리가 방향족(예를 들어, 퀴놀린)일 수도 있지만, 고리 중 단지 하나만이 방향족(예를 들어, 2,3-다이하이드로인돌)이 될 필요가 있다. 두 번째 고리는 또한 축합 또는 브릿지될 수 있다.
사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리는 상기 기재한 바와 같은 이러한 치환체, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 알킬아미노카보닐, 아르알킬아미노카보닐, 알케닐아미노카보닐, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 아르알킬카보닐, 알케닐카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 지니는 하나 이상의 고리 위치(예를 들어, 고리-형성 탄소 또는 헤테로원자, 예컨대 N)에서 치환될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기는 또한 방향족이 아닌 지환식 또는 헤테로환식 고리와 축합 또는 브릿지되어 다환식계(예를 들어, 테트랄린, 메틸렌다이옥시페닐) 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "카보사이클" 또는 "탄소환식 고리"는 구체화된 수의 탄소를 갖는 임의의 안정한 단환식, 이환식 또는 삼환식 고리를 포함하는 것으로 의도되며, 이들 중 어떤 것은 포화, 불포화 또는 방향족일 수 있다. 카보사이클은 사이클로알킬 및 아릴을 포함한다. 예를 들어, C3-C14 카보사이클은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 탄소 원자를 갖는 단환식, 이환식 또는 삼환식 고리를 포함하도록 의도된다. 카보사이클의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로뷰테닐, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헵테닐, 사이클로헵틸, 사이클로헵테닐, 아다만틸, 사이클로옥틸, 사이클로옥테닐, 사이클로옥타다이에닐, 플루오레닐, 페닐, 나프틸, 인다닐, 아다만틸 및 테트라하이드로나프틸을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 브릿지된 고리는 또한, 예를 들어, [3.3.0]바이사이클로옥탄, [4.3.0]바이사이클로노난, [4.4.0]바이사이클로데칸 및 [2.2.2]바이사이클로옥탄을 포함하는, 카보사이클의 정의에 포함된다. 하나 이상의 탄소 원자가 2개의 비인접 탄소 원자를 연결할 때에, 브릿지된 고리가 생긴다. 일 실시형태에서, 브릿지 고리는 1 또는 2개의 탄소 원자이다. 브릿지는 항상 단환식 고리를 삼환식 고리로 전환한다는 것이 언급된다. 고리가 브릿지될 때, 고리에 대해 열거된 치환체는 또한 브릿지 상에 존재할 수 있다. 축합된(예를 들어, 나프틸, 테트라하이드로나프틸) 및 스피로 고리가 또한 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "헤테로사이클" 또는 "헤테로환식기"는 적어도 하나의 고리 헤테로원자(예를 들어, N, O 또는 S)를 함유하는 임의의 고리 구조(포화, 불포화 또는 방향족)를 포함한다. 헤테로사이클은 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로사이클의 예는 몰폴린, 피롤리딘, 테트라하이드로티오펜, 피페리딘, 피페라진, 옥세탄, 피란, 테트라하이드로피란, 아제티딘 및 테트라하이드로퓨란을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
헤테로환식기의 예는, 아크리디닐, 아조시닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조티오퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 벤조옥사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트라이아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈아이소옥사졸릴, 벤즈아이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카바졸릴, 4aH-카바졸릴, 카볼리닐, 크로마닐, 크로메닐, 신놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-다이티아지닐, 다이하이드로퓨로[2,3-b]테트라하이드로퓨란, 퓨라닐, 퓨라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 아이소벤조퓨라닐, 아이소크로마닐, 아이소인다졸릴, 아이소인돌리닐, 아이소인돌릴, 아이소퀴놀리닐, 아이소티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 메틸렌다이옥시페닐, 몰폴리닐, 나프티리디닐, 옥타하이드로아이소퀴놀리닐, 옥사다이아졸릴, 1,2,3-옥사다이아졸릴, 1,2,4-옥사다이아졸릴, 1,2,5-옥사다이아졸릴, 1,3,4-옥사다이아졸릴, 1,2,4-옥사다이아졸5(4H)-온, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥신돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페노옥사티닐, 페노옥사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴노옥살리닐, 퀴뉴클리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로아이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아다이아지닐, 1,2,3-티아다이아졸릴, 1,2,4-티아다이아졸릴, 1,2,5-티아다이아졸릴, 1,3,4-티아다이아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 트라이아지닐, 1,2,3-트라이아졸릴, 1,2,4-트라이아졸릴, 1,2,5-트라이아졸릴, 1,3,4-트라이아졸릴 및 잔테닐을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치환된"은 지정된 원자 상에서 임의의 하나 이상의 수소 원자가 표시된 기로부터의 선택으로 대체된다는 것을 의미하며, 단, 지정된 원자의 정상 원자가는 초과되지 않으며, 치환은 안정한 화합물을 초래한다. 치환체가 옥소 또는 케토(즉, =O)일 때에, 원자 상에서 2개의 수소 원자는 대체된다. 케토 치환체는 방향족 모이어티 상에 존재하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 고리 이중 결합은 2개의 인접한 고리 원자(예를 들어, C=C, C=N 또는 N=N)간에 형성된 이중 결합이다. "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로 단리를 견뎌내기에 충분히 강한 화합물 및 효능 있는 치료제로의 제형을 나타내는 것을 의미한다.
치환체에 대한 결합이 고리에서 2개의 원자를 연결하는 결합을 가교하는 것으로 나타날 때, 이러한 치환체는 고리에서 임의의 원자에 결합될 수 있다. 이러한 치환체가 주어진 화학식의 화합물의 나머지에 결합되는 것을 통해 치환체가 원자를 나타내는 일 없이 열거될 때에, 이러한 치환체는 이러한 화학식에서 임의의 원자를 통해 결합될 수 있다. 치환체 및/또는 변수의 조합은, 이러한 조합이 안정한 화합물을 초래하는 경우에만 허용가능하다.
임의의 변수(예를 들어, R1)가 화합물에 대한 임의의 구성성분 또는 화학식에서 1회 이상 생길 때, 각 경우에서 그것의 정의는 모든 다른 경우에서의 그의 정의와 독립적이다. 따라서, 예를 들어, 기가 0 내지 2개의 R1 모이어티로 치환될 것으로 나타난다면, 기는 선택적으로 2개까지의 R1 모이어티로 선택적으로 치환될 수 있고, 각각의 경우에 R1은 R1의 정의로부터 독립적으로 선택된다. 또한 치환체 및/또는 변수의 조합은, 이러한 조합이 안정한 화합물을 초래하는 경우에만 허용가능하다.
용어 "하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH 또는 -O-를 지니는 기를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다. 용어 "과할로겐화된"은 일반적으로 모든 수소 원자가 할로겐 원자에 의해 대체된 모이어티를 지칭한다. 용어 "할로알킬" 또는 "할로알콕실"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 알킬 또는 알콕실을 지칭한다.
용어 "카보닐"은 산소 원자에 대해 이중 결합으로 연결된 탄소를 함유하는 화합물 및 모이어티를 포함한다. 카보닐을 함유하는 모이어티의 예는 알데하이드, 케톤, 카복실산, 아마이드, 에스터, 무수물 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "카복실"은 -COOH 또는 그의 C1-C6 알킬 에스터를 지칭한다.
"아실"은 아실 라디칼(R-C(O)-) 또는 카보닐기를 함유하는 모이어티를 포함한다. "치환된 아실"은 수소 원자 중 하나 이상이, 예를 들어, 알킬기, 알키닐기, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티에 의해 대체된 아실기를 포함한다.
"아로일"은 카보닐기에 결합된 아릴 또는 헤테로방향족 모이어티를 지니는 모이어티를 포함한다. 아로일기의 예는 페닐카복시, 나프틸 카복시 등을 포함한다.
"알콕시알킬", "알킬아미노알킬" 및 "티오알콕시알킬"은 상기 기재한 바와 같은 알킬기를 포함하되, 산소, 질소 또는 황 원자는 하나 이상의 탄화수소 백본 탄소 원자로 대체된다.
용어 "알콕시" 또는 "알콕실"은 산소 원자에 공유적으로 연결된 치환 및 비치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐기를 포함한다. 알콕시기 또는 알콕시 라디칼의 예는, 메톡시, 에톡시, 아이소프로필옥시, 프로폭시, 뷰톡시 및 펜톡시기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치환된 알콕시기의 예는 할로겐화된 알콕시기를 포함한다. 알콕시기는 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티와 같은 기로 치환될 수 있다. 할로겐 치환된 알콕시기의 예는 플루오로메톡시, 다이플루오로메톡시, 트라이플루오로메톡시, 클로로메톡시, 다이클로로메톡시 및 트라이클로로메톡시를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "에터" 또는 "알콕시"는 2개의 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합된 산소를 함유하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 용어는 알킬기에 공유적으로 결합된 산소 원자에 공유적으로 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 지칭하는 "알콕시알킬"을 포함한다.
용어 "에스터"는 카보닐기의 탄소에 결합된 산소 원자에 대해 결합된 탄소 또는 헤테로원자를 함유하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 용어 "에스터"는 알콕시카복시기, 예컨대 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 뷰톡시카보닐, 펜톡시카보닐 등을 포함한다.
용어 "티오알킬"은 황 원자에 연결된 알킬기를 함유하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 티오알킬기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 카복시산, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 아미노(알킬아미노, 다이알킬아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포네이토, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 트라이플루오로메틸, 사이아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티와 같은 기로 치환될 수 있다.
용어 "티오카보닐" 또는 "티오카복시"는 황 원자에 대해 이중 결합으로 연결된 탄소를 함유하는 화합물 및 모이어티를 포함한다.
용어 "티오에터"는 2개의 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합된 황 원자를 함유하는 모이어티를 포함한다. 티오에터의 예는 알크티오알킬, 알크티오알케닐, 및 알크티오알키닐을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "알크티오알킬"은 알킬기에 결합된 황 원자에 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 지니는 모이어티를 포함한다. 유사하게, 용어 "알크티오알케닐"은 알킬, 알케닐 또는 알키닐기가 알케닐기에 공유적으로 결합된 황 원자에 결합된 모이어티를 지칭하며; "알크티오알키닐"은 알킬, 알케닐 또는 알키닐기가 알키닐기에 공유적으로 결합된 황 원자에 결합된 모이어티를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "아민" 또는 "아미노"는 비치환 또는 치환된 -NH2를 지칭한다. "알킬아미노"는 -NH2의 질소가 적어도 하나의 알킬기에 결합된 화합물의 기를 포함한다. 알킬아미노기의 예는 벤질아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 펜에틸아미노 등을 포함한다. "다이알킬아미노"는 -NH2의 질소가 적어도 2개의 추가적인 알킬기에 결합된 화합물의 기를 포함한다. 다이알킬아미노기의 예는 다이메틸아미노 및 다이에틸아미노를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "아릴아미노" 및 "다이아릴아미노"는 질소가 각각 적어도 1 또는 2개의 아릴기에 결합된 기를 포함한다. "아미노아릴" 및 "아미노아릴옥시"는 아미노로 치환된 아릴 및 아릴옥시를 지칭한다. "알킬아릴아미노", "알킬아미노아릴" 또는 "아릴아미노알킬"은 적어도 하나의 알킬기 및 적어도 하나의 아릴기에 결합된 아미노기를 지칭한다. "알킬아미노알킬"은 알킬기에 또한 결합된 질소 원자에 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 지칭한다. "아실아미노"는 질소가 아실기에 결합되는 기를 포함한다. 아실 아미노의 예는 알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 유레이도기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "아마이드" 또는 "아미노카복시"는 카보닐 또는 티오카보닐기의 탄소에 결합된 질소 원자를 함유하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 용어 "알크아미노카복시"기는 카보닐 또는 티오카보닐기의 탄소에 결합된 아미노기에 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 포함한다. 또한 카보닐 또는 티오카보닐기의 탄소에 결합된 아미노기에 결합된 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하는 "아릴아미노카복시"기를 포함한다. 용어 "알킬아미노카복시", "알케닐아미노카복시", "알키닐아미노카복시" 및 "아릴아미노카복시"는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 모이어티가 각각 카보닐기의 탄소에 차례로 결합된 질소 원자에 결합된 모이어티를 포함한다. 아마이드는 직쇄 알킬, 분지된 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클과 같은 치환체로 치환될 수 있다. 아마이드기 상의 치환체는 추가로 치환될 수 있다.
본 명세서에서, 화합물의 구조식은 일부 경우에 편의를 위해 특정 이성질체를 나타내지만, 본 발명은 모든 이성질체, 예컨대 기하학적 이성질체, 비대칭 탄소에 기반한 광학 이성질체, 입체이성질체, 호변체 등을 포함할 수 있으며, 모든 이성질체는 동일한 수준의 활성을 갖는 것으로 이해된다. 추가로, 결정 다형성은 화학식에 의해 표시되는 화합물에 대해 존재할 수 있다. 임의의 결정 형태, 이의 결정 형태 혼합물 또는 무수물 또는 수화물은 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 언급된다. 더 나아가, 생체내 본 발명의 화합물의 분해에 의해 생성되는 소위 대사산물은 본 발명의 범주 내이다.
"이성질 현상"은 동일한 분자식을 가지지만 그들의 원자의 결합 순서가 다르거나 또는 공간 내 그들의 원자의 배열이 다른 화합물을 의미한다. 공간에서 그들의 원자의 배열이 다른 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 칭하며, 서로 비대칭거울상(non-superimposable mirror image)인 입체이성질체는 "거울상체" 또는 때때로 광학 이성질체로 칭해진다. 반대의 키랄성의 동일한 양의 개개 거울상체 형태를 함유하는 혼합물은 "라세미 혼합물"로 칭해진다.
4개의 동일하지 않은 치환체에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 칭해진다.
"키랄 이성질체"는 적어도 하나의 키랄 중심을 지니는 화합물을 의미한다. 하나 이상의 키랄 중심을 지니는 화합물은 개개 부분입체이성질체로서 또는 부분입체이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있고, "부분입체이성질체 혼합물"로 칭해진다. 하나의 키랄 중심이 존재할 때, 입체이성질체는 해당 키랄 중심의 절대 입체배치(R 또는 S)를 특징으로 할 수 있다. 절대 입체배치는 키랄 중심에 부착된 치환체의 공간에서의 배열을 지칭한다. 고려 중인 키랄 중심에 부착된 치환체는 문헌[Sequence Rule of Cahn, Ingold and Prelog. (Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116)]에 따라 랭크된다.
"기하 이성질체"는 이중 결합 또는 사이클로알킬 링커(예를 들어, 1,3-사이클로뷰틸)에 대해 입체 방해된 회전으로 그들의 존재를 가지는 부분입체이성질체를 의미한다. 이들 입체배치는 칸-잉골드-프레로그(Cahn-Ingold-Prelog) 규칙에 따라 기들이 분자 내 이중결합의 동일측 또는 반대측 상에 있는지를 나타내는, 접두사 시스 및 트랜스, 또는 Z 및 E에 의해 그들의 명칭이 구분된다.
본 발명의 화합물은 상이한 키랄 이성질체 또는 기하이성질체로서 도시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 화합물이 키랄 이성질체 또는 기하 이성질체 형태를 가질 때, 모든 이성질체 형태는 본 발명의 범주에 내에 포함되는 것으로 의도되고, 화합물의 명명은 임의의 이성질체 형태를 제외하지 않는다는 것이 이해되어야 하며, 모든 이성질체가 동일한 수준의 활성을 가지지 않을 수도 있다는 것이 이해된다.
더 나아가, 본 발명에서 논의되는 구조 및 다른 화합물은 이들의 모든 아트로프(atropic) 이성질체를 포함하며, 모든 아트로프 이성질체가 동일한 수준의 활성을 가지지 않을 수도 있다는 것이 이해된다. "아트로프 이성질체"는 두 이성질체의 원자가 공간에서 상이하게 배열되는 입체이성질체의 유형이다. 아트로프 이성질체는 중심 결합에 대해 거대한 기의 회전의 입체방해에 의해 야기되는 제한된 회전에 대해 그들의 존재를 가진다. 이러한 아트로프 이성질체는 전형적으로 혼합물로서 존재하지만, 크로마토그래피 기법에서 최근의 진보의 결과로서, 선택 경우에 2개의 아트로프 이성질체의 혼합물을 분리할 수 있었다.
"호변체"는 평형상태에서 존재하고 하나의 이성질체로부터 다른 것으로 용이하게 전환되는 2 이상의 구조적 이성질체 중 하나이다. 이 전환은 인접한 컨쥬게이트된 이중 결합의 전환을 수반하는 수소 원자의 형식적 이동을 초래한다. 호변체는 용액 중에서 호변체 세트의 혼합물로서 존재한다. 호변체화가 가능한 용액에서, 호변체의 화학적 평형상태가 도달될 것이다. 호변체의 정확한 비는 온도, 용매 및 pH를 포함하는 몇몇 인자에 의존한다. 호변이성에 의해 상호 전환되는 호변체의 개념은 호변체화로 불린다.
가능한 호변체화의 다양한 유형 중에서, 2가지가 통상적으로 관찰된다. 케토-엔올 호변체화에서, 전자 및 수소 원자의 동시 이동이 일어난다. 고리-쇄 호변체화는 동일 분자에서 하이드록시기(-OH) 중 하나와 반응하는 당 쇄 분자 내 알데하이드기(-CHO)의 결과로서 생겨서, 글루코스에 의해 나타나는 바와 같이 환식(고리형상) 형태를 제공한다.
통상적인 호변체 쌍은: 케톤-엔올, 아마이드-나이트릴, 락탐-락팀, 헤테로환식 고리 내 아마이드-이미드산 호변체(예를 들어, 구아닌, 티민 및 사이토신과 같은 핵염기에서), 이민-엔아민 및 엔아민-엔아민이다. 케토-엔올 평형상태의 예는 이하에 나타내는 바와 같이 피리딘-2(1H)-온과 대응하는 피리딘-2-올 간이다.
본 발명의 화합물은 상이한 호변체로서 도시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 화합물이 호변체 형태일 때, 모든 호변체 형태는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도되며, 화합물의 명명은 임의의 호변체 형태를 제외하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특정 호변체는 다른 것보다 더 높은 수준의 활성을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
용어 "결정 다형체" 또는 "다형체" 또는 "결정 형태"는 화합물이 상이한 결정 패킹 배열로 결정화할 수 있는 결정 구조를 의미하며, 이들 모두는 동일한 원소의 조성물을 가진다. 상이한 결정 형태는 보통 상이한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도 경도, 결정 형상, 광학적 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 가진다. 재결정화 용매, 결정화 속도, 저장 온도 및 기타 인자는 하나의 결정 형태가 지배적이 되도록 야기할 수 있다. 화합물의 결정 다형체는 상이한 조건 하에서 결정화에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 화학식의 화합물은 화합물 그 자체, 적용가능하다면, 그들의 염 및 그들의 용매화물을 포함할 수있다. 염은, 예를 들어, 아릴- 또는 헤테로아릴-치환된 벤젠 화합물 상에서 음이온과 양으로 하전된 기(예를 들어, 아미노) 사이에 형성될 수 있다. 적합한 음이온은 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 황산염, 중황산염, 설파민산염, 질산염, 인산염, 시트르산염, 메탄설포네이트, 트라이플루오로아세테이트, 글루탐산염, 글루쿠론산염, 글루타르산염, 말산염, 말레산염, 숙신산염, 퓨마르산염, 타르타르산염, 토실산염, 살리실산염, 락트산염, 나프탈렌설포네이트, 및 아세테이트(예를 들어, 트라이플루오로아세테이트)를 포함한다. 용매 "약제학적으로 허용가능한 음이온"은 약제학적으로 허용가능한 염을 형성하는데 적합한 음이온을 지칭한다. 마찬가지로, 염은 또한 아릴- 또는 헤테로아릴-치환된 벤젠 화합물 상에서 양이온과 음으로 하전된 기(예를 들어, 카복실레이트) 사이에 형성될 수 있다. 적합한 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 및 암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸암모늄 이온을 포함한다. 아릴- 또는 헤테로아릴-치환된 벤젠 화합물은 또한 4차 질소 원자를 함유하는 해당 염을 포함한다.
추가적으로, 본 발명의 화합물, 예를 들어, 화합물의 염은 수화 또는 불수화(무수) 형태 중 하나로 또는 다른 용매 분자와의 용매화물로 존재할 수 있다. 수화물의 비제한적 예는 일수화물, 이수화물 등을 포함한다. 용매화물의 비제한적 예는 에탄올 용매화물, 아세톤 용매화물 등을 포함한다.
"용매화물"은 용매의 화학량론적 또는 비화학량론적 양을 함유하는 용매 추가 형태를 의미한다. 일부 화합물은 결정질 고체 상태에서 고정된 몰 비의 용매 분자를 가두는 경향을 가지며, 따라서 용매화물을 형성한다. 용매가 물이라면, 형성된 용매화물은 수화물이고; 용매가 알코올이라면, 형성된 용매화물은 알코올레이트이다. 수화물은 하나 이상의 물 분자와 물질 한 분자의 조합에 의해 형성되며, 이때 물은 H2O로서 그의 분자 상태를 유지한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 다른 것과 구조적으로 유사하지만 조성이 약간 다른(하나의 원자의 상이한 원소의 원자에 의한 대체에서 또는 특정 작용기의 존재에서, 또는 하나의 작용기의 다른 작용기에 의한 대체에서와 같이) 화학적 화합물을 지칭한다. 따라서, 유사체는 기능 및 외관이 유사 또는 비슷하지만, 기준 화합물에 대한 구조에 있는 또는 유래는 아닌 화합물이다.
본 명세서에 정의된 바와 같은, 용어 "유도체"는 공통 중심 구조를 갖는 화합물을 지칭하며, 본 명세서에 기재된 다양한 기로 치환된다. 예를 들어, 화학식 I에 의해 표시되는 모든 화합물은 아릴- 또는 헤테로아릴-치환된 벤젠 화합물이며, 공통 중심으로서 화학식 I을 가진다.
용어 "생등배전자체(bioisostere)"는 원자의 또는 원자 그룹의 다른, 광범위하게 유사한 원자 또는 원자의 그룹으로의 교환으로부터 초래되는 화합물을 지칭한다. 생등배전자체 대체의 목적은 모 화합물에 대해 유사한 생물학적 특성을 지니는 새로운 화합물을 만드는 것이다. 생등배전자체 대체는 물리화학에 또는 위상 수학에 기반할 수 있다. 카복실산 생등배전자체의 예는 아실, 설폰이미드, 테트라졸, 설포네이트 및 포스포네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996] 참조.
본 발명은 모 화합물에서 생기는 원자의 모든 동위원소를 포함하도록 의도된다. 동위원소는 동일한 원자수를 가지지만 상이한 질량수를 갖는 해당 원자를 포함한다. 일반적 예로서 제한 없이, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함하고, 탄소의 동위원소는 C-13 및 C-14를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 화학식의 화합물의 합성을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 실시예에 나타낸 바와 같은 다음의 반응식에 따르는 본 발명의 다양한 개시 화합물의 합성을 위한 상세한 방법을 제공한다.
조성물이 구체적 성분을 갖거나, 포함하거나 또는 포함하는 것으로 기재되는 경우 설명 전체적으로, 조성물은 또한 열거된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다는 것이 상정된다. 유사하게, 방법 또는 공정이 구체적 공정 단계를 갖거나, 포함하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 공정은 인용된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 추가로, 단계의 순서 또는 특정 작용을 수행하기 위한 순서는 본 발명의 작동가능한 채로 남아있는 한 중요하지 않다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 2 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 합성 공정은 매우 다양한 작용기를 용인할 수 있고, 따라서 다양한 치환된 출발 물질이 사용될 수 있다. 공정은, 그것이 특정 예에서 화합물을 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물로의 추가로 전환시키는데 바람직할 수도 있지만, 일반적으로 전반적인 공정의 마지막에서 또는 마지막 근처에서 목적으로 하는 최종 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질, 문헌에 공지된 화합물을 이용하는 다양한 방법에서 또는 용이하게 제조된 중간체로부터, 당업자에게 공지되거나 또는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 표준 합성 방법 및 절차를 사용함으로써 제조될 수 있다. 유기 분자의 제조 및 작용기 전환 및 조작을 위한 표준 합성 방법 및 절차는 적절한 과학적 문헌으로부터 또는 해당 분야에서의 표준 교재로부터 얻을 수 있다. 비록 임의의 하나 또는 몇몇 공급원으로 제한되는 것은 아니지만, 고전적 교재, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Smith, M. B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)]은 당업자에게 공지된 유기 합성의 유용하고 인정된 참고 교재이다. 합성 방법의 다음의 설명은 예시를 위해 설계되지만, 본 발명의 제조를 위한 일반적 절차를 제한하지 않는다.
본 발명의 화합물은 당업자에게 친숙한 다양한 방법에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 화학식을 지니는 본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질 또는 문헌 절차를 사용하여 제조될 수 있는 출발 물질로부터 이하의 반응식 1 내지 10에서 도시된 절차에 따라 제조될 수 있다. 반응식 1 내지 10에서 Z 및 R기(예컨대 R2, R3, R4, R6, R7, R8 및 R12)는 달리 구체화되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 임의의 화학식에서 정의된 바와 같다.
당업자는 본 명세서에 기재된 반응 순서 및 합성 반응 동안, 보호기의 도입 및 제거와 같은 특정 순서가 변할 수 있다는 것을 언급할 것이다.
당업자는 특정기가 보호기의 사용을 통해 반응 조건으로부터의 보호를 필요로 할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 보호기는 또한 분자 내 유사한 작용기를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 보호기의 목록 및 이들 기의 도입 및 제거 방법은 문헌[Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999]에서 찾을 수 있다.
바람직한 보호기는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
하이드록실 모이어티에 대해: TBS, 벤질, THP, Ac
카복실산에 대해: 벤질 에스터, 메틸 에스터, 에틸 에스터, 알릴 에스터
아민에 대해: Cbz, BOC, DMB
다이올에 대해: Ac (x2) TBS (x2), 또는 아세토나이드와 함께 취할 때
티올에 대해: Ac
벤즈이미다졸에 대해: SEM, 벤질, PMB, DMB
알데하이드에 대해: 다이-알킬 아세탈, 예컨대 다이메톡시 아세탈 또는 다이에틸 아세틸.
본 명세서에 기재된 반응 반응식에서, 다수의 입체이성질체가 생성될 수 있다. 특정 입체이성질체를 나타낼 때, 반응으로부터 생성될 수 있는 모든 가능한 입체이성질체를 의미하는 것으로 이해된다. 당업자는 반응이 우선적으로는 하나의 이성질체를 제공하기 위해 최적화될 수 있거나, 또는 새로운 반응식이 단일 이성질체를 생성하도록 고안될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 혼합물이 생성된다면, 박막 크로마토그래피, 분취 HPLC, 분취 카이랄 HPLC, 또는 분취 SFC와 같은 기법이 이성질체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.
다음의 약어는 본 명세서 전체적으로 사용되며 이하에 정의한다:
Ac 아세틸
AcOH 아세트산
aq. 수성
BID 또는 b.i.d. 1일 2회(하루에 두번)
BOC tert-뷰톡시 카보닐
Cbz 벤질옥시 카보닐
CDCl3 중수소 클로로폼
CH2Cl2 다이클로로메탄
DCM 다이클로로메탄
DMB 2,4 다이메톡시 벤질
DMF N,N-다이메틸폼아마이드
DMSO 다이메틸 설폭사이드
EA 또는 EtOAc 에틸 아세테이트
EDC 또는 EDCI N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드
ESI- 전자분무 음성모드
ESI+ 전자분무 양성모드
EtOH 에탄올
h 시간
H2O 물
HOBt 1-하이드록시벤조트라이아졸
HCl 염화수소 또는 염산
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
K2CO3 탄산칼륨
LC/MS 또는 LC-MS 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼
M 몰농도
MeCN 아세토나이트릴
min 분
Na2CO3 탄산나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NaHCO3 중탄산나트륨
NaHMDs 나트륨 헥사메틸다이실라자이드
NaOH 수산화나트륨
NaHCO3 중탄산나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NMR 핵자기 공명
Pd(OH)2 팔라듐 다이하이드록사이드
PMB 파라 메톡시벤질
p.o. 입으로(경구 투여)
ppm 백만분율
분취 HPLC 분취 고성능 액체 크로마토그래피
PYBOP (벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
Rt 또는 RT 실온
TBME tert-뷰틸 메틸 에터
TFA 트라이플루오로아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
THP 테트라하이드로피란
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 화학식의 화합물을 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적 조성물"은 대상체에게 투여를 위한 적합한 형태로 본 발명의 화합물을 함유하는 제형이다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 벌크 또는 단위 제형이다. 단위 제형은, 예를 들어, 캡슐, IV 백, 정제, 에어로졸 흡입기 상의 단일 펌프 또는 바이알을 포함하는 임의의 다양한 형태이다. 조성물의 단위 용량에서 활성 성분(예를 들어 개시된 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 이성질체의 제형)의 양은 효과적인 양이며, 수반된 특정 치료에 따라 변한다. 당업자는 환자의 연령 및 병태에 따라서 투약량에 대한 일상적인 변형을 하는 것이 때때로 필요하다는 것을 인식할 것이다. 투약량은 또한 투여 경로에 의존할 것이다. 경구, 폐, 직장, 비경구, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 흡입, 협측, 설하, 흉막내, 척추강내, 비강내 등을 포함하는 다양한 경로가 상정된다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 일 실시형태에서, 활성 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 임의의 보존제, 완충제 또는 필요한 추진제와 멸균 조건 하에서 혼합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 어구 "약제학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시 사용에 적합하고, 합리적인 유해/유익비에 비례하는 해당 화합물, 음이온, 양이온, 물질, 조성물, 담체 및/또는 제형을 지칭한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고 비독성이며, 생물학적이지 않거나 또는 달리 바람직하지 못하지 않고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약제학적 용도에 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조함에 있어 유용한 부형제를 의미한다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 1종과 1종 이상의 이러한 부형제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 양립가능하게 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 애컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글라이콜, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장 조절제. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알 중에 밀봉될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물은 화학치료적 치료를 위해 현재 사용되는 잘 공지된 다수의 방법에서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 암의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 종양 내로 직접 주사되거나, 혈류 또는 체강 내로 주사되거나 또는 경구로 취해지거나 또는 패치를 이용하여 피부를 통해 도포될 수 있다. 선택된 용량은 효과적인 치료를 구성하기에 충분하지만 허용가능하지 않은 부작용을 야기할만큼 높지는 않아야 한다. 질환 병태(예를 들어, 암, 전암 등)의 상태 및 환자의 건강상태는 바람직하게는 치료 후 합리적인 기간 동안 밀접하게 모니터링되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료적 유효량"은 동정된 질환 또는 병태를 치료, 완화 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료적 또는 저해적 효과를 나타내기 위한 약제학적 작용제의 양을 지칭한다. 효과는 당업계에 공지된 임의의 분석 방법에 의해 검출될 수 있다. 대상체에 대한 정확한 유효량은 대상체의 체중, 크기 및 건강상태; 질환의 특성 및 정도; 및 투여를 위한 치료제 또는 선택된 치료제의 조합에 따를 것이다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 임상의의 기술 및 판단 내에서 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 양태에서, 치료될 질환 또는 병태는 암이다. 다른 양태에서, 치료될 질환 또는 병태는 세포 증식성 장애이다.
임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 예를 들어 종양 세포의 세포 배양 분석에서, 또는 동물 모델, 보통 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 처음에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 정보는 인간에서 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 치료적/예방적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차, 예를 들어 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(집단의 50%에 대해 치명적인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 간의 용량 비는 치료지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다. 투약량은 사용된 투약 형태, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라서 이 범위 내에서 다를 수 있다.
투약량 및 투여는 충분한 수준의 활성제(들)를 제공하거나 또는 목적으로 하는 효과를 유지하도록 조절된다. 고려될 수 있는 인자는 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적 건강 상태, 연령, 체중 및 대상체의 성별, 식이요법, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 내약성/요법에 대한 반응을 포함한다. 장시간 작용하는 약제학적 조성물은 특정 제형의 반감기 및 클리어런스율에 따라서 3 내지 4일마다, 매주 또는 2주마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 활성 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 일반적으로 공지된 방식으로, 예를 들어 전통적인 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 가루화, 에멀전화, 캡슐화, 엔트래핑 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 활성 화합물의 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 물론, 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
주사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성) 또는 분산물 및 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포(Cremophor) EL(상표명)(뉴저지주 파시패니에 소재한 BASF) 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 용이한 주사능(syringeability)이 존재하는 정도로 유동되어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물유기체의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물유기체 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에 조성물 중에, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 및 솔비톨 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 화합물을 포함시키고, 필요하다면, 그 후에 멸균여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이의 이전에 멸균 여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 치료적 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척액으로서 사용을 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있되, 유체 담체 내 화합물은 경구로 적용되거나, 스위쉬(swish)되거나 뱉어내 지거나 또는 삼켜진다. 약제학적으로 양립가능한 결합제 및/또는 애주번트 물질은 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 트로키 등은 임의의 다음의 성분 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트래거캔스검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로츠(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 가압 용기 또는 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이 또는 네뷸라이저의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 대해 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 추진제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여를 위해, 세정제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같이 신체로부터의 빠른 제거에 대해 화합물을 보호할 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의, 생체양립가능한 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재료는 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc)로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대해 단클론성 항체에 의해 감염된 세포에 대해 표적화된 리포좀을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투약량의 투여의 용이함 및 균일성을 위한 단위 제형에서 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약량 단위는 치료될 대상체에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적으로 하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료적 효과에 의해 좌우되고 직접적으로 의존한다.
치료적 적용에서, 본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물의 투약량은 작용제, 수용 환자의 연령, 체중 및 임상적 상태, 및 임상의의 경험 및 판단 또는 요법을 투여하는 실행자, 특히 선택된 투약량에 영향을 미치는 인자에 따라 다르다. 일반적으로 용량은 종양 성장을 늦추고 바람직하게는 퇴보시키며, 또한 바람직하게는 암의 완전한 퇴보를 야기하는 것을 초래하는데 충분하여야 한다. 투약량은 약 0.01㎎/㎏/일 내지 약 5000㎎/㎏/일의 범위에 있을 수 있다. 바람직한 양태에서, 투약량은 약 1㎎/㎏/일 내지 약 1000㎎/㎏/일의 범위에 있을 수 있다. 양태에서, 용량은 단일, 분할 또는 연속 용량(용량은 환자의 체중(㎏), 체표면적(㎡) 및 연령(세)에 대해 조절될 수 있음)으로 약 0.1㎎/일 내지 약 50g/일; 약 0.1㎎/일 내지 약 25g/일; 약 0.1㎎/일 내지 약 10g/일; 약 0.1㎎ 내지 약 3 g/일; 또는 약 0.1㎎ 내지 약 1g/일의 범위에 있을 것이다. 약제학적 작용제의 유효량은 임상의 또는 기타 자격이 있는 관찰자에 의해 언급되는 바와 같은 객관적으로 동정가능한 개선을 제공하는 것이다. 예를 들어, 환자에서 종양의 퇴보는 종양의 직경을 참조로 하여 측정될 수 있다. 종양 직경의 감소는 퇴보를 나타낸다. 퇴보는 또한 치료가 중단된 후에 다시 생기는 종양의 실패에 의해 표시된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "투약 효과적 방식"은 대상체 또는 세포에서 목적으로 하는 생물학적 효과를 생성하기 위한 활성 화합물의 양을 지칭한다.
약제학적 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 포장 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물은 염을 추가로 형성할 수 있다. 모든 이들 형태는 또한 특허청구된 발명의 범주 내에서 상정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물이 이의 산 또는 염기염을 제조함으로써 변형되는 본 발명의 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기 또는 유기산염, 카복실산과 같은 산성잔기의 알칼리 또는 유기염 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 전통적인 비-독성 염 또는 모 화합물의 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 비-독성 염은 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시에탄 설폰산, 아세트산, 아스코브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 중탄산, 탄산, 시트르산, 에데트산, 에탄 다이설폰산, 1,2-에탄 설폰산, 퓨마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글라이콜산, 글라이콜 아르사닐산, 헥실레조신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토바이오닉산, 라우릴 황산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 나프실산, 질산, 옥살산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 아아세트산, 숙신산, 설팜산, 설파닐산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 톨루엔 설폰산, 및 통상적으로 생기는 아민산, 예를 들어, 글라이신, 알라닌, 페닐알라닌, 알기닌 등으로부터 선택된 무기산 및 유기산으로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용가능한 염의 다른 예는 헥산산, 사이클로펜탄 프로피온산, 파이루브산, 말론산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로-[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3차 뷰틸아세트산, 뮤콘산 등을 포함한다. 본 발명은 또한 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 대체되는 모 화합물에서 존재할 때 형성되는 염을 포함하거나; 또는 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메트아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기를 배위한다. 염 형태에서, 화합물 대 염의 양이온 또는 음이온의 비가 1:1, 또는 1:1이 아닌 임의의 비, 예를 들어, 3:1, 2:1, 1:2 또는 1:3일 수 있다는 것이 이해된다.
약제학적으로 허용가능한 염에 대한 모든 언급은 동일한 염 중에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 용매 추가 형태(용매화물) 또는 결정 형태(다형체)를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 화합물은 또한 에스터, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 에스터로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 화합물 중의 카복실산 작용기는 그것의 대응하는 에스터, 예를 들어, 메틸, 에틸 또는 다른 에스터로 전환될 수 있다. 또한, 화합물 중의 알코올기는 그것의 대응하는 에스터, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트 또는 다른 에스터로 전환될 수 있다.
화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 경구로, 비강으로, 경피로, 폐로, 흡입으로, 협측으로, 설하로, 복강내로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 직장으로, 흉막내로, 척추강내로 및 비경구로 투여된다. 일 실시형태에서, 화합물은 경구로 투여된다. 당업자는 특정 투여 경로의 이점을 인식할 것이다.
화합물을 이용하는 투약 요법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료될 병태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 화합물 및 이의 염을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택된다. 보통의 숙련된 의사 또는 수의사는 병태의 진행을 예방, 대응 또는 저지하기 위해 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
개시된 본 발명의 화합물의 제형 및 투여를 위한 기술은 문헌[Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에서 찾을 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 제제에서 사용된다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 비활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수성 또는 유기 용액을 포함한다. 화합물은 본 명세서에 기재된 범위에서 요망되는 투약량을 제공하는데 충분한 양으로 이러한 약제학적 조성물 중에 존재할 것이다.
본 명세서에서 사용된 모든 백분율 및 비는, 달리 표시되지 않는 한, 중량이다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상이한 실시예로부터 명백하게 된다. 제공된 실시예는 본 발명을 실시함에 있어 유용한 상이한 성분 및 방법을 예시한다. 실시예는 특허청구된 발명을 제한하지 않는다. 본 개시내용에 기반하여, 당업자는 본 발명을 실행하는데 유용한 다른 성분 및 방법을 동정하고 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 합성 반응식에서, 화합물은 단순함을 위해 하나의 특정 입체 배치로 그려질 수 있다. 이러한 특정 입체 배치는 본 발명을 하나 또는 다른 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 그것이 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물을 제외하는 것으로 해석되어서는 안 되지만; 주어진 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체는 다른 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체보다 더 높은 활성 수준을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일단 생성되면 상기 기재된 방법에 의해 설계, 선택 및/또는 최적화된 화합물은 화합물이 생물학적 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 분석을 사용하여 특성규명될 수 있다.　 예를 들어, 분자는 그들이 예측된 활성, 결합 활성 및/또는 결합 특이성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 이하에 기재된 해당 분석을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 통상적인 분석에 의해 특성규명될 수 있다.
더 나아가, 고속대량 스크리닝(high-throughput screening)을 사용하여 이러한 분석을 사용하는 분석의 속도를 높일 수 있다. 그 결과, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 활성에 대해 본 명세서에 기재된 분자를 빠르게 스크리닝하는 것이 가능할 수 있다. 고속대량 스크리닝을 수행하기 위한 일반적 방법은, 예를 들어 문헌[Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker]; 및 미국 특허 제5,763,263호에 기재되어 있다.　 고속대량 분석은 이하에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 상이한 분석 기법을 사용할 수 있다.
본 발명의 EZH2 저해제는, 요망된다면, EZH2 저해제를 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 키트(예를 들어, 포장 또는 디스펜서 장치)에서 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 수반할 수 있다. 양립가능한 약제학적 담체 중에서 제형화된 본 발명의 EZH2 저해제를 포함하는 조성물은 또한 제조될 수 있으며, 적절한 용기 내에 놓이고, 표시된 병태의 치료에 대해 표지된다. 사용 설명서가 또한 제공될 수 있다.
또한 메틸화된 H3-K27을 검출하는 복수의 메틸화 검출 시약을 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 키트는 모노-메틸화된 H3-K27, 다이-메틸화된 H3-K27 및 트라이-메틸화된 H3-K27 검출 시약을 포함한다. 검출 시약은, 예를 들어 항체 또는 이의 단편, 폴리펩타이드 또는 앱타머이다.
키트는 또한 SWI/SNF 복합체의 적어도 하나의 성분, 예를 들어, 키트의 형태로 함께 포장된 야생형 및/또는 돌연변이체 성분 핵산에 의해 암호화된 단백질에 대한 돌연변이체 성분 핵산 서열 또는 항체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열과 같은 상동성 핵산 서열을 갖는 돌연변이체 성분 핵산 서열을 특이적으로 동정하는 핵산의 기능상실을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 성분 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 길이로 200, 150, 100, 50, 25, 10 이하일 수 있다. 키트는 특히 앱타머 또는 항체, 대조군 제형(양성 및/또는 음성) 및/또는 검출가능한 표지, 예컨대 플루오레세인, 녹색 형광 단백질, 로다민, 사이아닌 염료, 알렉사(Alexa) 염료, 루시퍼라제, 방사성표지를 별개의 용기 내에 함유할 수 있다. 추가로, SWI/SNF 복합체의 생물학적 활성(예컨대, 그의 염색질 리모델링 활성)을 검출하기 위한 시약이 키트에 포함될 수 있다.
분석을 수행하기 위한 설명서(예를 들어, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 키트 내에 포함될 수 있다. 예를 들어 분석은 당업계에 공지된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학(IHC), 면역형광(IF), 서열화 및 질량 분석법(MS)의 형태일 수 있다.
실시예 1: EZH2의 저해에 의한 유전적으로 변경된 림프종 및 악성횡문근 종양에서의 지속적 종양 퇴행
화합물 A는 EZH2의 강력하고 선택적인 저해제이다: 방사성동위원소 표지된 SAM 및 기질로서 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜 또는 H3K27에 대응하는 펩타이드 중 하나를 포함하는 무세포 생화학적 분석은 저해상수(Ki) 값 2.5±0.5 n㏖/ℓ 및 IC50 값 11±5nM(뉴클레오솜 분석) 또는 16±12nM(펩타이드 분석)을 지니는 야생형 EZH2를 함유하는 인간 PRC2의 활성을 선택적으로 저해한다는 것을 나타내었다. IC50 값은 인간 및 래트 EZH2 효소에 대해서뿐만 아니라 모든 공지된 림프종 기능변화 돌연변이를 보유하는 EZH2 단백질에 대해 유사하였다. 화합물 A의 IC50 값은 SAM의 농도가 증가함에 따라 증가되었지만, 올리고뉴클레오솜의 양을 증가시킴으로써 최소로 영향받았고, 이는 저해의 SAM-경쟁적 및 뉴클레오솜-비경쟁적 양상과 일치된다. HMT 선택성을 입증하기 위해, 라이신과 알기닌 HMT를 둘 다 포함하는 EZH2 이외의 HMT의 패널에 대한 화합물 A의 저해를 평가하였다. 화합물 A는 EZH1에 대해 35배 선택성 및 시험한 14개의 다른 HMT에 대해 4500배 초과의 선택성을 나타내었다.
화합물 A는 세포에서 세포의 H3K27 메틸화를 특이적으로 저해한다: WSU-DLCL2 EZH2 Y641F 돌연변이체 림프종 세포를 4일 동안 화합물 A와 함께 인큐베이션시켰을 때, 전체 H3K27Me3 수준에서 0.26μM의 평균 IC50 값(ELISA에 의해 결정된 H3K27Me3 수준)과 함께 농도-의존적 감소를 관찰하였다. 메틸화 저해의 역학을 연구할 때에, 인큐베이션의 3 내지 4일 후에 90% 저해가 단지 달성되었기 때문에 H3K27Me3의 반감기는 대략 1일이었다. OCI-LY19 EZH2 야생형 림프종 세포를 4일 동안 2.7μM 화합물 A와 함께 인큐베이션시켰을 때, 단지 영향받은 메틸 마크는 PRC2 촉매 작용의 3가지의 공지된 생성물인 H3K27Me1, H3K27Me2 및 H3K27Me3이었다. 화합물 A와 함께 인큐베이션은 또한 H3K27 아세틸화에서 증가를 초래하였다. 전체 H3K27 트라이메틸화 수준에 대한 화합물 A의 능력은 야생형 또는 돌연변이체 EZH2 중 하나를 발현시키는 계통을 포함하는 몇몇 다른 인간 림프종 세포주에서 추가로 시험하였다. 화합물 A는 EZH2 상태와 독립적인 모든 세포주에서 유사한 효능으로 H3K27Me3을 감소시켰다(표 1).
화합물 A는 EZH2 점 돌연변이를 보유하는 림프종 세포주의 선택적 사멸을 야기한다: 화합물 A와 함께 WSU-DLCL2 EZH2 Y641F 돌연변이체 세포의 인큐베이션은 제6일 증식 분석에서 평균 IC50 값 0.28±0.14μM로 항-증식성 효과를 야기하였다. 살아있는 세포수에 대한 화합물 A의 효과의 역학을 11일의 연장된 기간에 걸쳐 추가로 시험하였다. 화합물 A의 항증식성 효과는 WSU-DLCL2 세포가 4일 초과 동안 화합물에 노출된 후에 명확하였고, 이는 화합물 A-매개 세포의 H3K27 메틸화 저해의 역학과 일치되었다. 11일 분석에서 WSU-DLCL2 세포 증식의 화합물 A 저해에 대한 IC50 값(0.0086μM, 표 1)은 6일 증식 분석에 의해 얻은 결과와 비교할 때 더 낮았고, 이는 더 긴 인큐베이션 기간에 의해 민감성이 증가되었음을 시사하였다. WSU-DLCL2 세포와 대조적으로, 11일에 걸친 OCI-LY19 인간 림프종 세포(잔기 Y641에 대해 EZH2 야생형)의 성장은, 세포주 둘 다에 대한 H3K27Me3 저해에 대해 유사한 IC50 값에도 불구하고 상당하게 영향받지 않았다(표 1). 11일의 전체 인큐베이션 기간을 고려하여 세포가 증식을 중단하는 농도를 동정하기 위해, 특정 세포주에 대한 가장 낮은 세포독성 농도(LCC)를 계산하였다. WSU-DLCL2 EZH2 Y641F 돌연변이체 인간 림프종 세포에 대한 LCC 값은 EZH2에 대한 야생형인 OCI-LY19와 비교할 때 상당히 더 낮았다(표 1). 이 문맥의 특이적 세포 사멸은 연장된 림프종 세포주 패널을 이용하는 11일 증식 분석으로부터의 결과에 의해 추가로 뒷받침되었다. RL 세포주(EZH2 Y641N)를 제외하고 EZH2 돌연변이를 보유하는 모든 세포주는, 세포주를 야생형 EZH2와 비교할 때 화합물 A의 항증식성 효과에 대해 더 민감하였다(표 1). 파이퍼(Pfeiffer) 세포주(EZH2 A677G)는 Y641 돌연변이체 세포주에 걸쳐 IC50 값 및 LCC에 의해 각각 측정되는 바와 같이 화합물 A에 대한 민감성에서의 20 내지 300배 증가를 나타내었다. 다음에 지속 세포 사멸에 필요한 화합물 노출의 최소 시간을 세척 실험에 의해 조사하였다. 7일 동안(그 후에 화합물 세척 7일) 또는 14일 동안 연속적으로 화합물 A와 함께 인큐베이션시킨 WSU-DLCL2세포에 대해 제11일 또는 제14일에 대한 LCC 값은 유사하였다(표 2). 그러나 단지 4일 동안의 약물 노출은 연속적 인큐베이션과 유사한 LCC 값을 유도하기에 충분하지 않았다.
화합물 A는 EZH2 돌연변이체 림프종 세포에서 G1 정지 및 세포자멸사를 유도한다: 다음에, WSU-DLCL2 세포에서 세포주기 진행 및 세포자멸사에 대한 7일 동안 화합물 A(1 μM)와 함께 인큐베이션의 효과를 평가하였다. G1기에서 세포의 증가(%) 및 S기 및 G2/M기에서 세포의 감소(%)는 화합물 A 인큐베이션의 2일 후에 명확하였다. 4일 후에 최대 효과를 달성하였다. 하위-G1 분획에서 증가는 명확하지 않았는데, 이는 7일 동안의 화합물 A 인큐베이션에 의해 세포자멸사가 유도되지 않았다는 것을 시사하였다. 이는 세포독성 효과가 인큐베이션의 7일 후에만 관찰되었다는 것을 나타내는 화합물 A의 존재에서의 WSU-DLCL2의 성장 곡선과 일치된다. 14일까지 동안 화합물 A와 함께 WSU-DLCL2 세포의 인큐베이션 후에, TUNEL 분석에 의해 결정한 세포자멸사 세포의 분획은 제14일에 비히클에 비해 상당히 증가되었고, 이는 화합물 A-매개 세포사가 세포자멸사의 유도를 통해 발생되었음을 나타낸다.
화합물 A의 경구 투여는 마우스에서 EZH2 돌연변이체 이종이식 모델에서 EZH2 표적 저해를 야기한다: EZH2 돌연변이체 림프종 이종이식을 보유하는 마우스에서 전신 화합물 노출 및 생체내 표적 저해에 대한 화합물 A의 경구 투약 효과를 조사하였다. 우선, WSU-DLCL2 이종이식에 의해 피하로 이식한 SCID 마우스에 4일 또는 7일 동안 화합물 A로 경구 투약하였다. 최종 투약 전 5분 또는 투약 후 3시간에 화합물 A 혈장 수준을 측정하는 것은 노출에서 명확한 용량 의존적 증가를 나타내었다. 160㎎/㎏ TID 또는 213㎎/㎏ BID에서 투약한 동물만이 투약 주기 내내 WSU-DLCL2에 대해 LCC 초과의 혈장 내 평균 화합물 수준을 유지하였다(1652ng/㎖, 고려한 마우스 혈장 단백질 결합과 함께). 최종 투약 후 3시간에 수집한 종양으로부터의 세포분쇄액에서 화합물 결정은 2개 구획에서 가장 높은 용량 그룹 화합물 수준에 대해서만 유사하다는 것을 나타내었다. 종양 내 H3K27Me3 수준을 분석하였을 때, 용량 의존적 EZH2 표적 저해를 관찰하였다. H3K27Me3 저해는 213㎎/㎏ QD에서 투약한 마우스로부터 종양에서 더 적었는데, 이는 투약 주기 전체적으로 LCC 초과의 혈장 농도를 유지하는 것이 최적의 표적 저해에 필요하다는 것을 시사한다. 4일 동안 160㎎/㎏ TID로 투약하는 것은 동일 용량 및 스케줄에서 7일 동안의 투약보다 약간 더 낮은 표적 저해를 초래하였는데, 이는 연장된 투약이 WSU-DLCL2 종양에서 표적 저해 정도를 증가시켰다는 것을 나타내었다. BID와 QD 스케줄 둘 다를 평가하는 KARAPS-422 이종이식을 이용하여 피하로 이식한 누드 마우스에서 유사한 7-일 연구를 수행하였다. 화합물 A는 요법 둘 다에서 종양 H3K27Me3 수준의 용량-의존적 감소를 유도하였다.
화합물 A는 몇몇 EZH2 돌연변이체 림프종 이종이식에서 유의한 항종양 효과를 유도한다: WSU-DLCL2 EZH2 Y641F 돌연변이체 이종이식 종양 보유 SCID 마우스를 28일 동안 화합물 A로 처리하였을 때, 150㎎/㎏ TID의 가장 높은 용량에서 58%인 용량-의존적 종양 성장 저해를 관찰하였다. 가장 높은 용량을 투여한 동물만이 투약 주기 전체적으로 WSU-DLCL2 세포에 대한 LCC 초과의 평균 화합물 A 혈장 수준을 유지하였다. 28일 동안 화합물 A의 투약은 7일 투약에 의해 관찰한 것과 대조적으로 혈장과 비교하여 종양 조직에서 상대적 화합물 축적을 유도하였다. 28일에 수집한 종양으로부터의 히스톤의 ELISA 분석은 용량-의존적 표적 저해를 나타내었다. WSU-DLCL2 이종이식에서 H3K27Me3 수준은 7일에 비해 28일에 대해 투약한 마우스에서 더 낮았고, 이는 화합물 A의 연장된 투여가 표적 저해 정도를 증가시켰음을 나타내었다. KARPAS-422 EZH2 Y461N 돌연변이체 이종이식에서, BID 스케줄에 대한 화합물 A의 28일 투약은 훨씬 더 극적인 효과를 가졌다. 80.5㎎/㎏ BID만큼 낮은 용량에서 종양 성장 저해를 관찰하였지만, 더 고용량은 이종이식을 근절하였고, 투약 중단 후 90일까지 동안 재성장이 관찰되지 않았다. KARPAS-422 이종이식 보유 마우스에서 간헐적 투약 스케줄을 연구하였을 때, 또한 화합물 A는 7일 투약/7일 중단 및 21일 투약/7일 중단 스케줄의 2회 주기를 이용하여 상당한 용량-의존적 항종양 효과를 나타내었다. 모든 투약 스케줄에 대해, 각각 90 및 361㎎/㎏ BID에서 종양 성장 저해 및 완전한 퇴행을 관찰하였다. 시험관내에서 이 세포주에 대한 화합물 A의 강력한 항증식성 효과에 의해 시사되는 바와 같이 파이퍼 EZH2 A677G 돌연변이체 이종이식 모델은 가장 민감한 종양 모델이었다. 가장 낮은 것(30㎎/㎏ QD)을 제외한 모든 화합물 A 투약 그룹(QD 스케줄)은 모든 동물에서 완전한 종양 퇴행을 나타내었다. 또한, 연구의 마지막(화합물 A 투여를 중단한 후 36일)까지 종양 재성장을 관찰하였다. 30㎎/㎏ QD에서 종양 재성장이 관찰되었지만, 이 매우 낮은 용량은 투여 기간 동안 종양 정체를 유도하였다. 내약성 문제 때문에, 1140㎎/㎏ QD로 투여한 마우스에 대해 12일에 투약을 중단하였고; 12일 동안 단지 화합물 A에 노출한 이 그룹에서 여전히, 지속적인 완전한 퇴행을 관찰하였다.
화합물 A는 시험관내 및 생체내에서 SMARCB1 돌연변이체 MRT 세포를 선택적으로 사멸시킨다: EZH2 저해가 MARCB1-결실 MRT 세포의 성장 및 저해에 대해 임의의 효과를 가지는지 여부를 시험하였다. 시험관내 14일 증식 분석에서 화합물 A와 함께 SMARCB1-결실 MRT 세포주 G401 및 A204를 인큐베이션시키는 것은 nM 범위에서 IC50 값에 의한 강한 항증식성 효과를 유도한 반면, SMARCB1을 발현시킨 대조군 세포주 RD 및 SJCRH30은 최소로 영향받았다(표 3). 28일 동안 266 또는 532㎎/㎏ BID에서 화합물 A를 이용하는 피하 G401 이종이식을 보유하는 SCID 마우스의 투약은 해당하는 극도로 빠르게 성장하는 종양을 제거하였다. KARPAS-422 및 파이퍼 EZH2 돌연변이체 NHL 이종이식 모델과 유사하게 재성장은 투약 중단 후 32일인 연구 마지막에 관찰되지 않았다. 133㎎/㎏로 투약한 화합물 A는 투여 기간 동안 정체를 유도하였고, 투약 중단 후 비히클에 비해 상당한 종양 성장을 생성하였다. 제21일에 각 그룹으로부터의 마우스의 서브세트로부터 채취한 종양은 모든 용량에서 강한 EZH2 표적 저해를 나타내었다.
화합물 A는 용량 의존적 방식으로 비종양 조직에서의 H3K27 메틸화를 저해한다: 상기 기재한 데이터는 화합물 A가 SWI/SNF 구동 암 및 MRT에 대한 새로운 치료 양상을 나타낸다는 것을 입증한다. 투약 후 약력학적 바이오마커 조절을 측정하는 것을 종종 전임상 모델로부터의 데이터에 기반한 반응을 생성하기 위해 예측된 표적 저해 정도를 평가하기 위한 조기의 임상 시험에서 수행하였다. 투약 후 종양 생검의 수집이 종종 가능하지 않기 때문에, 말초혈단핵세포(peripheral blood monuclear cell: PBMC), 피부 또는 골수와 같은 더 용이하게 접근가능한 대리 조직을 종종 대신 수집한다. 대리 조직에서 EZH2 표적 저해를 시험하기 위해, 수컷 및 암컷 스프레그 돌리 래트에게 28일 동안 100, 300 또는 1000㎎/㎏ 화합물 A를 경구로 투여하였고, PBMC, 골수 및 피부 샘플을 연구 마지막에 수집하였다. 화합물 A의 혈장 수준은 수컷과 암컷 래트에서 용량 의존적으로 증가되며, 혈장 수준은 수컷에서의 혈장 수준에 비해 암컷에서 일반적으로 더 높았다. 내약성 문제 때문에, 1000㎎/㎏ 그룹에서의 암컷은 제23일에 안락사시켰다. 용량 의존적 표적 저해를 ELISA에 의해 측정하여 화합물 A로 투약한 래트로부터의 PBMC 및 골수에서 관찰하였다. 표적 저해 정도는 28일 동안 투약한 수컷(1000㎎/㎏의 동일 용량)에 비해 22일 동안 투약한 암컷으로부터의 PBMC에 대해 덜 표명되었다. H3K27Me3 양성 세포에서의 용량 의존적 감소는 IHC 분석에 의해 평가되는 바와 같이 화합물 A-용량 래트의 피부 표피에서 관찰하였다. 가장 고용량에서 최대 효과를 관찰하였고, 이미 화합물 A 투여의 22일 후에 명백하였다.
화합물 A는 시험관내 다른 EZH2 저해제로서의 유사한 특성, 예컨대 다른 HMT에 비교할 때에 생화학적 분석에서 EZH2에 대해 매우 높은 특이성 및 EZH2 돌연변이 NHL 세포주의 맥락 특이적 사멸을 야기하는 세포 H3K27 메틸화의 특이적 저해를 나타내었다. 그러나, 이 화합물은 효능의 대략 10배 증가를 달성하였는데, 이는 생화학적 분석 및 세포 기능 분석에서 결정한 감소된 Ki 및 IC50 값에 의해 반영된다. 추가로, 화합물 A는 이종이식 종양 및 비종양 조직에서 용량 의존적 EZH2 표적 저해를 야기하는 설치류에 투여될 때 우수한 경구 생체이용가능성을 나타내었다. 중요하게는, 화합물 A의 투약은 마우스 보유 EZH2 돌연변이체 림프종 이종이식에서 상당한 항종양 효과를 유도하였다. 반응은 종양 근절(투약 중단 후 재성장 없음)로부터 용량 의존적 종양 성장 저해의 범위에 있었다. 항종양 활성의 지연된 개시(4 내지 7일 후)는 시험관내에서 화합물 A와 함께 세포의 인큐베이션에 의해 유도된 메틸화 저해 및 항증식성 활성의 역학과 일치되었다. 투약 주기 전체적으로 LCC 초과의 화합물 A 혈장 수준을 유지하는 것은 표적 저해 및 항종양 반응을 유도하는데 WSU-DLCL2 이종이식 모델이 필수적이었다. 그러나 다른 2개의 림프종 이종이식 모델(KARPAS-422 및 파이퍼)은 화합물 A 투여에 대해 극도로 민감하였고, LCC 초과의 혈장 수준을 유지하는 것은 필수적이지 않았다. 파이퍼 EZH2 A677G 돌연변이체 이종이식 종양은 매우 저용량 또는 짧은 투약 기간에 의해 영구적으로 사라졌는데, 이는 유전적으로 정의된 NHL의 이런 유형을 지니는 환자가 화합물 Adp 의한 유의한 치료 효과를 가진다는 것을 시사하였다.
MRT는 고도로 악성이고, 국소로 침습성이며, 빈번하게 전이성이고, 특히 치명적인 뇌, 신장 및 연조직의 극도로 공격적인 소아암이지만, 그들은 전형적으로 이배체이며 게놈 이상이 없다. 그러나, 그들은 SWI/SNF 염색질 리모델링 복합체의 코어 성분인 SMARCB1의 상실의 거의 완전한 침투를 특징으로 한다. SMARCB1의 이대립인자성 불활성화는 본질적으로 MRT에서 유일한 사건인데, 이는 이런 게놈 이상에 대한 구동자 역할을 시사한다. 유전적 연구를 통해, PRC2 및 SWI/SNF는 RB, 사이클린 D1 및 MYC 경로 주위로 유전자 발현을 길항적으로 조절한다는 것이 시사되었다. 여기서, 약학적 EZH2 저해는 SMARCB1 결실 MRT 세포주에서 항증식성 효과를 유도하고 마우스에서 MRT 이종이식을 영구적으로 근절하였다는 것을 입증하였다. 이는 이러한 암의 의존도를 확인하며, 이때 EZH2 그 자체는 PRC2 활성에 대해 유전적으로 변경되지 않는다.
화합물 A는 NHL의 유전적으로 정의된 서브세트에 대해 및 MRT에 대해 새로운 치료 양상을 나타낸다. 피부, PBMC 및 골수에서 H3K27Me3 수준에서의 용량-의존적 변화를 측정하는 능력은 인간 임상시험에서 비침습적 약력학적 바이오마커로서 이들 대리 조직으로부터의 신호 사용의 전조가 된다.
인간 림프종 세포주에서 화합물 A에 대한 메틸화 및 증식뿐만 아니라 LCC 값에 대한 IC 50 값
세포주 EZH2 상태 메틸화
IC 50 (n㏖/ℓ) a 		증식
IC 50 (μ㏖/ℓ) b 		LCC (μ㏖/ℓ) b
DOHH-2 야생형 ND 1.7 >10
파라쥐(Farage) 야생형 ND 0.099 >10
OCI-LY19 야생형 8 6.2 10　내지 25
톨레도 야생형 ND 7.6 >10
Karpas-422 Y641N 90 0.0018 0.12
파이퍼 A677G 2 0.00049 0.0005
RL Y641N 22 5.8 >25
SU-DHL-10 Y641F ND 0.0058 0.14
SU-DHL-6 Y641N 20 0.0047 0.21
WSU-DLCL2 Y641F 9 0.0086 0.17
a: 면역블롯에 의해 4일 동안 인큐베이션 후에 유래됨. 값은 아하늬 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
b: 11일 동안 인큐베이션 후에 유래됨. 각각의 실험에 대한 화합물 인큐베이션을 3회 수행하고, 값은 OCI-LY19, 파이퍼 및 WSU-DLCL2를 제외하고 모든 세포주에 대해 하나의 실험을 나타낸다. 남아있는 3개의 세포주에 대해, 값은 다음의 실험 숫자로부터의 평균을 나타낸다: OCI-LY19 n=9; 파이퍼 n=2 및 WSU-DLCL2 n=15.
연속적으로 또는 화합물 세척 후에 투약한 SU-DLCL2 인간 림프종 세포에 대한 화합물 A에 대한 LCC 값
WSU-DLCL2 세척 제11일 제14일
LCC(μM) LCC(μM)
세척 없음 0.17 0.11
4일 화합물 A; 11일 세척 0.36 0.42
7일 화합물 A; 7일 세척 0.19 0.075
값은 실험 내에서 인큐베이션 농도 당 3회 반복을 이용하는 2회 실험의 평균을 나타낸다.
SMARCB1 음성 MRT 세포주 및 SMARCB1 양성 대조군 세포주에 대한 화합물 A에 대한 IC 50 값
세포주 SMARCB1 상태 증식 IC 50 (μM), 제7일 증식 IC 50 (μM), 제14일
RD 야생형 9.2 5.2
SJCRH30 야생형 6.1 8.8
G401 돌연변이체 0.087 0.042
A204 돌연변이체 3.2 0.14
값은 실험 내에서 인큐베이션 농도 당 3회 반복을 이용하는 2회 실험의 평균을 나타낸다.
실시예 2: EZH2의 저해에 의해 유전적으로 변경된 악성횡문근종양에서의 지속적 종양 퇴행화합물 A는 EZH2의 강력하고 선택적인 저해제이다: 화합물 A를 반복적 의약 화학을 통해 개발하였다(도 10a). 화합물 A는 2.5±0.5nM의 저해상수(Ki) 값으로 야생형 EZH2를 함유하는 인간 PRC2의 활성을 저해하고, 모든 공지된 림프종 기능변화 돌연변이를 보유하는 EZH2 단백질에 대해 유사한 효능을 관찰하였다(표 5). 화합물은 정상상태 역학 연구에 의해 SAM-경쟁적 및 뉴클레오솜-비경쟁적이 된다는 것을 발견하였다(도 11). 라이신과 알기닌 HMT를 둘 다 포함하는 EZH2가 아닌 HMT의 패널에 대한 화합물 Adp 의한 저해를 또한 평가하였다. 화합물 A는 EZH1에 대해 35배 선택성 및 시험한 14가지의 다른 HMT에 대해 4500-배 초과의 선택성을 나타내었다(표 5).
화합물 A에 의한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 저해
효소 분석 IC 50 (nM) 1μM 화합물 A에서 저해% a
CARM1 >50,000b 5±3
DOT1L >50,000c 2±8
EHMT1 >50,000c 6±6
EHMT2 >50,000c 7±3
EZH1d,e 392±72f 98±1
EZH2 펩타이드 분석d,e 11±5f ND
EZH2 뉴클레오솜 분석d 16±12f 100±1
A677G EZH2d,e 2b ND
A687V EZH2d,e 2b ND
Y641F EZH2d,e 14±5f ND
Y641C EZH2d,e 16c ND
Y641H EZH2d,e 6c ND
Y641N EZH2d,e 38b ND
Y641S EZH2d,e 6c ND
rat EZH2d,e 4c ND
PRMT1 >50,000c 5±4
PRMT3 ND 2±2
PRMT5/MEP50 >50,000c 2±6
PRMT6 ND 3±3
PRMT8 >50,000c 7±3
SETD7 ND 4±3
SMYD2 >50,000c 1±2
SMYD3 ND 0±5
WHSC1 >100,000c 8±3
WHSC1L1 >100,000c 9±8
a: 값은 10μ㏖/ℓ 화합물 A에서 결정한 2회 실험의 평균 및 표준편차를 나타낸다.
b: 값은 실험 당 2회 반복을 이용하는 2회 실험의 평균을 나타낸다.
c: 값은 실험당 2회 반복을 이용하는 1회 실험을 나타낸다.
d: All EZH1 및 EZH2 단백질을 4개 PRC2 성분(EZH1/2, SUZ12, RBAP48, EED)과 관련하여 분석하였다.
e: 기질로서 H3K27 펩타이드를 이용하여 분석함.
f: 값은 반복의 평균 및 표준편차를 나타낸다(EZH1 n=4, EZH2 펩타이드 분석 n=4, EZH2 뉴클레오솜 분석 n=6, Y461F EZH2 n=3).
화합물 A는 SMARCB1 돌연변이체 MRT 세포의 선택적 세포자멸사 사멸을 야기하는 세포의 H3K27 메틸화를 특이적으로 저해한다: SMARCB1 결여 MRT 세포 및 SMARCB1 야생형 대조군 세포의 패널(면역블롯에 의해 확인함, 도 12a)을 4일 동안 화합물 A로 처리하였고, 이는 전체 H3K27Me3 수준에서 농도-의존적 감소를 초래하였다(도 10b 및 표 6). 야생형 또는 돌연변이체 세포 중 하나의 처리는 H3K27에 대한 메틸 마크만의 축소를 초래하였고, 다른 히스톤 메틸 마크는 영향이 없었다(도 12b). 화합물 A를 이용하는 SMARCB1-결실 MRT 세포주의 시험관내 처리로 nM 범위에서 IC50 값에 의한 강한 항증식성 효과를 유도한 반면; 대조군(야생형) 세포주는 최소로 영향받았다(도 10c 및 표 6). 항증식성 효과는 화합물 노출의 7일 후에 SMARCB1-결실 MRT 세포에서 명백하였지만, 최대 활성에 대한 노출의 14일을 필요로 하였다. G401 및 RD 세포에서 세포주기 진행 및 세포자멸사에 대한 14일 동안의 화합물 A(1μM)와 함께 인큐베이션의 효과를 또한 평가하였다. RD SMARCB1 야생형 세포의 화합물 A 인큐베이션은 DMSO 대조군에 비해 세포주기 또는 세포자멸사에서의 변화가 없었다(도 13a). 대조적으로, G401 SMARCB1-결실 세포는 G1기에서 세포 백분율의 증가를 나타내었고, 7일 후에 S기 및 G2/M기에서의 동시 감소를 나타내었다(도 13b). 7일을 통해 하위-G1 분획에서 명확한 증가가 없었는데, 이는 세포자멸사가 해당 시간까지 아직 유도되지 않았다는 것을 시사하였다. 이는 인큐베이션의 7일 후에만 세포독성을 나타내는 화합물의 존재에서 G401 세포의 성장 곡선과 일치한다(도 10c). 14일까지 G401 세포의 화합물 A 처리 후에, 하위-G1에서 세포뿐만 아니라 세포자멸사 세포의 분획을 제11일 내지 제14일에 시간 의존적 방식으로 증가시켰는데, 이는 화합물 A-매개 세포사가 세포자멸사의 유도를 통해 일어났다는 것을 나타낸다(도 13b).
세포주 SMARCB1 상태 메틸화 IC 50 (nM) a 제14일에 증식IC 50 (nM) b
G401 돌연변이체 2.7 135
A204 돌연변이체 1.4 590
G402 돌연변이체 1.7 144
KYM-1 돌연변이체 4.3 32
RD 야생형 5.6 6100, > 10000c
293 야생형 2.4 > 10000
SJCRH30 야생형 4.9 5100, >10000c
a: 4일 동안 인큐베이션, 히스톤 추출, 면역블롯 및 덴시토메트리 후에 유래. 값은 2개 실험으로부터의 평균을 나타낸다.
b: 각각의 실험에 대한 화합물 인큐베이션을 3회 수행하였고, 값은 모든 세포주에 대해 2회 실험의 평균을 나타낸다.
c: 2회 실험의 평균 계산은 가능하지 않다.
화합물 A는 신경분화 및 세포주기 저해의 유전자를 유도하는 한편, 헷지호그 경로 유전자, MYC 및 EZH2의 발현을 억제한다: SMARCB1 상실은 중요한 암 경로의 동시 후성적 동요(perturbation)를 통해 암 형성을 구동한다는 것이 시사되었다. 본 데이터는 이전에 기재한 신경분화에 중요한 유전자(CD133, DOCK4, PTPRK)의 감소된 발현, 세포주기 저해(CDKN2A) 및 종양억제(BIN1)뿐만 아니라 대조군 세포에 비해 SMARCB1-결실 G401 세포에서 헷지호그 경로 유전자 GLI1의 증가된 발현을 확인하였다(도 14a). 7일까지 동안 G401 세포의 화합물 A 처리는 모두 시간 의존적 방식에서 CD133, DOCK4 및 PTPRK 및 상향조절된 세포주기 저해제 CDKN1A 및 CDKN2A 및 종양 억제유전자 BIN1의 발현을 강하게 유도하였다(도 14b). 동시에, 헷지호그 경로 유전자, MYC 및 EZH2의 발현은 감소되었다. 특히, 14일 동안 화합물 A에 노출된 G402 SMARCB1-결실 세포를 뉴런-유사 형태로 추정하였다(도 14c). 대조적으로, RD 대조군 세포의 화합물 A 인큐베이션은 상기 언급한 유전자의 발현에 대해 최소 효과를 가졌다.
화합물 A는 SMARCB1 돌연변이체 MRT 이종이식을 근절한다 : 화합물 A의 경구 투약은 SMARCB1-결실 MRT 이종이식을 보유하는 마우스에서 전신 화합물 노출, 생체내 표적 저해 및 항종양 활성을 야기하였다. 피하 G401 이종이식을 보유하는 SCID 마우스에서 연구를 수행하였고, 여기서 동물에 화합물 A로 21일 동안 투약하였다. 그룹 당 마우스의 절반을 제21일에 안락사시켜 혈액 및 조직을 수집한 한편, 남아있는 동물을 추가 7일 동안 처리한 다음, 다른 32일 동안 투약 없이 두었다. 화합물 A는 체중에 대한 최소 효과에 의해 모든 용량에서 잘 용인되었다(도 15a). 21일 내지 28 동안 250 또는 500㎎/㎏ 1일 2회(BID)에서 투약은 빠르게 성장하는 G401 종양을 사실상 제거하였다(도 15b, 14c 및 16a). 투약 중단 후 32일 동안 재성장이 관찰되지 않았다. 125㎎/㎏에서 투약한 화합물 A은 투여 기간 동안 종양 정체를 유도하였고, 투약 기간 후 비히클에 비해 상당한 종양 성장 지연을 생성하였다. 제21일에 투약 전 5분에 또는 투약 후 3시간에 화합물 A 혈장 수준을 측정하는 것은 전신 노출에서의 명확한 용량-의존적 증가를 나타내었다(도 15d). 제21일에 각각의 그룹으로부터의 마우스의 서브세트로부터 채취한 종양은 H3K27me3의 강한 저해를 나타내었고, 이는 항종양 활성과 상관관계가 있었다(250㎎/㎏에서 최대 효과가 달성됨, 도 16b). 추가로, CD133, PTPRK, DOCK4 및 GLI1의 발현에서의 용량-의존적 변화를 G401 이종이식 종양에서 검출하였다(도 16c).본 데이터는 EZH2의 약학적 저해가 SMARCB1-결실 MRT 세포주에서 특이적으로 항증식성 효과를 유도하고, 마우스에서 MRT 이종이식을 영구적으로 근절하였다는 것을 입증한다. 이는 EZH2 그 자체가 이 내용에서 유전적으로 변경되지 않았다는 사실에도 불구하고 PRC2 활성에 대해 이러한 암의 의존도를 확인한다. 본 명세서에 제시한 데이터는 SMARCB1-결실 MRT와 관련하여, EZH2의 저해가 SMARCB1 대리로서 작용하고 신경분화 유전자, 세포주기 저해제 및 종양 억제유전자의 발현을 활성화하는 한편 GLI1, PTCH1, MYC 및 EZH2를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 몇몇 암 경로에 대한 화합물 A 매개 EZH2 저해 효과의 합은 MRT 모델에서 보이는 극적이고 영구한 항종양 활성에 대한 원인이다. 따라서, 화합물 A는 이들 치명적 유아 종양에 대해 새로운 치료 양상을 나타낸다.
더 나아가, SWI/SNF 복합체가 MRT 이외의 다른 암 유형에서 유전적으로 변경되기 때문에, EZH2는 또한 암 유형의 범위에서 종양 유지 및 생존에서 어떤 역할을 한다는 것을 생각할 수 있다. 비호지킨 림프종을 보유하는 EZH2 돌연변이체의 선택적 사멸에서 EZH2 저해제의 유효성을 입증하는 최근의 보고와 조합하여, 본 데이터는 유전적 변경이 - 표적-직접적 또는 간접적 - EZH2 효소 활성에 대해 증식성 의존도를 부여하는 다양한 혈액학적 및 고형 종양에서 치료적 개입의 효과적인 메커니즘이라는 것을 입증한다.
실시예 3: 재료 및 방법
세포 배양물: 세포주 293T, RD, SJCRH30, A204, G401, G402 및 KYM-1. 293T(CRL-11268), RD(CRL-136), SJCRH30(CRL-2061), A204(HTB-82), G401(CRL-1441) 및 G402(CRL-1440)를 ATCC로부터 얻었다. KYM-1(JCRB0627)을 JCRB로부터 얻었다. 293T 및 RD 세포를 DMEM+10% FBS 중에서 배양시켰다. SJCRH30 세포를 RPMI+10% FBS 중에서 배양시켰다. A204, G401 및 G402 세포를 맥코이즈(McCoys) 5a+10% FBS 중에서 배양시켰다. KYM-1 세포를 DMEM/Hamd의 F12+10% FBS 중에서 배양시켰다.
웨스턴 블롯 분석: 히스톤은 이전에 기재한 바와 같이 추출한 산이었다(Daigle et al., Blood. 2013 Aug 8;122(6):1017-25). 산 추출한 히스톤에 대한 웨스턴 블롯을 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다(Knutson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 7;110(19):7922-7). 전체 세포 용해물(Whole cell lysate: WCL)을 변형된 RIPA 완충제(10x RIPA 용해 완충제(밀리포어(Millipore) #20-188), 0.1% SDS(인비트로젠(Invitrogen) AM9823), 프로테아제 미니-정제(로슈(Roche) #1836153))를 사용하여 제조하였다. 세포를 펠렛화하고 나서, 빙랭 PBS로 세척하고, 빙랭 RIPA 완충제 중에서 재현탁시키고 나서, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 용해물을 10초 동안 3회 50% 전력에서 초음파 처리한 다음, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 용해물을 테이블탑 원심분리에서 4도로 15분 동안 최대 속도에서 원심분리시켰다. 정화한 용해물을 새로운 관에 대해 알리쿼트하고 나서, WCL에 대한 단백질 농도를 BCA 분석(피어스(Pierce))에 의해 결정하였다. 각각의 용해물의 10 마이크로그램을 10 내지 20% 트리스-글라이신 겔(바이오래드(Biorad)) 상에서 분획화하고, iBlot(나이트로셀룰로스 전달 스택을 사용하여 프로그램 3에 대해 7분)을 사용하여 옮기고 나서, 오디세이(Odyssey) 차단 완충제에서 다음의 항체를 이용하여 프로빙하였다: SNF5 (CST #8745), EZH2 (CST #5246), 및 베타-액틴 (CST #3700).
시험관내 세포 분석: 현탁 세포주에 대해 이전에 설명한 바와 같이 분석한 부착 세포주 증식 분석(KYM-1을 제외한 모든 세포주)을 위해(Daigle et al., Blood. 2013 Aug 8;122(6):1017-25), 각각의 세포주에 대한 플레이팅 빌도를 성장 곡선(ATP 생존도에 의해 측정함) 및 7일 시간 과정에 걸친 밀도에 기반하여 결정하였다. 화합물 처리 전날에, 세포를 96웰 플레이트에서 3회(제0일 내지 제7일 시간과정 동안) 또는 6-웰 플레이트(시간과정의 나머지 동안 제7일에 재플레이팅을 위해)에서 플레이팅하였다. 제0일에, 세포를 미처리, DMSO-처리 또는 10uM에서 출발하고 3- 또는 4-배 희석에서 감소하는 화합물 A로 처리하였다. 플레이트를 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표)(프로메가(Promega))를 사용하여 제0일, 제4일 및 제7일에 판독하였고, 화합물/배지를 제4일에 보충하였다. 제7일에, 6-웰 플레이트를 트립신처리하고 나서, 원심분리하고, Vi-Cell에 의한 계수 측정을 위해 새로운 배지애서 재현탁시켰다. 각각의 처리로부터의 세포를 96-웰 플레이트에서 3회 본래의 밀도로 재플레이팅하였다. 세포를 플레이트에 밤새 부착시키고 나서, 세포를 제0일에 처리하였다. 제7일, 제11일 및 제14일에, 플레이트를 셀타이터-글로(등록상표)를 사용하여 판독하고 화합물/배지를 제11일에 보충하였다. 3회의 평균을 사용하여 시간과정에 걸친 증식을 플롯팅하고, IC50 값을 계산하였다. 세포주기 및 세포자멸사에 대해, G401 및 RD 세포를 플레이트 당 1x106 세포 밀도에서 2회 15㎝ 접시에서 플레이팅하였다. 세포를 1μM에서 화합물 A와 함께 총 25㎖로 14일의 과정에 걸쳐 인큐베이션시켰고, 세포를 제4일, 제7일 및 제11일에 본래의 플레이팅 밀도로 다시 분할하였다. 세포 주기 분석 및 TUNEL 분석을 제조업자의 프로토콜에 따라 구아바(Guava)(등록상표) 유세포분석기를 사용하여 수행하였다.
유전자 발현 분석: G401 및 RD 세포를 각각 175,000개 세포/플라스크 및 117,000개 세포/플라스크에서 T-75 플라스크 내에 플레이팅하고 나서 밤새 부착시켰다. 제0일에, 세포를 DMSO 또는 1uM 화합물 A로 2회 처리하였다. 세포를 채취하였고 나서, 제2일, 제4일 및 제7일에 펠렛화하였으며, 배지 및 화합물을 제4일에 보충하였다. 21일 동안 투약한 G401 이종이식 동물(비히클, 125㎎/㎏, 및 250㎎/㎏(각각 6마리 동물) 및 500㎎/㎏(4마리 동물) 화합물 A 투약 그룹)을 유전자 발현 분석을 위해 사용하였다. 전체 mRNA를 RNeasy 미니키트(퀴아젠(Qiagen) #74106)을 사용하여 세포 펠렛 및 종양 조직으로부터 추출하고 나서, 고용량 cDNA 역전이 키트(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(AB) #4368813)에 의해 역전사시켰다. RT-PCR을 이하의 표에서의 텍맨 페스트 어드벤스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix)(AB #4444964) 및 텍맨 프라이머/프로브 세트를 사용하여 ViiA(상표명) 7 실시간 PCR 시스템즈(Real-Time PCR Systems)(AB)에 의해 수행하였다. 유전자 발현을 18S에 대해 정규화하고 나서(AB #Hs99999901_s1) 배수 변화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다. 생체내 샘플에 대해, 평균 Ct 값 +/- SD을 각각의 투약 그룹에 대해 결정하고 나서, 비히클 투약 그룹과 비교한 배수 변화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다.
ELISA: 히스톤을 이전에 설명한(Daigle et al) 종양으로부터 단리시키고 나서 코팅 완충제(0.05% BSA와 함께 PBS) 중에서 동일한 농도(H3에 대해 0.5ng/㎍ 및 H3K27Me3에 대해 4ng/㎍)로 제조하였다. 샘플 또는 표준(100㎕)를 2개의 96-웰 ELISA 플레이트(써모 랩시스템즈사(Thermo Labsystems), 이뮬론 4HBX #3885)에 대해 2회 첨가하였다. DMSO 또는 10μ㏖/ℓ 화합물 A로 4일 동안 처리한 G401 세포로부터 단리한 히스톤을 종양 히스톤 샘플과 동일한 히스톤 농도에서 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 바이오테크(Bio Tek) 플레이트 세척기 상에서 300㎕/웰 PBST(0.05% 트윈(Tween) 20과 함께 PBS; 10x PBST, KPL #51-14-02)를 이용하여 3회 세척하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 희석제(PBS + 2% BSA + 0.05% 트윈 20)로 차단시키고 나서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, PBST로 3회 세척하였다. 모든 항체를 희석제 중에서 희석시켰다. 100㎕/웰의 항-H3K27Me3(CST #9733, 50% 글라이세롤 저장액 1:1000) 또는 항-전체 H3(Abcam #ab1791, 50% 글라이세롤 저장액 1:10,000)을 각각의 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시키고 나서, PBST로 3회 세척하였다. 100㎕/웰의 항-Rb-IgG-HRP(셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology), 7074)를 H3K27Me3 플레이트에 대해 1:2000으로 H3 플레이트에 대해 1:6000으로 첨가하고 나서, 실온에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 검출을 위해, 100㎕/웰의 TMB 기질(바이오에프엑스 래버러토리즈사(BioFx Laboratories), #TMBS)을 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 5분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 반응을 100 ㎕/웰 1N H2SO4로 중단시켰다. 450㎚에서 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
이종이식 연구: 이 연구에서 동물 처리, 돌봄과 관련한 모든 절차 및 처리를 국제실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care: AAALAC)의 평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation)의 가이드에 따라 상하이 켐파트너(Shanghai Chemparner)의 동물실험 관련 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인된 가이드라인에 따라 수행하였다. 생체내 연구에 대해, 마우스를 종양 발생에 대해 기본 배지와 매트리겔(맥코이즈(McCoy's) 5A : 매트리겔(Matrigel)=1:1)의 0.2㎖ 혼합물 중에서 G-401 종양 세포(5x106개/마우스)를 이용하여 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. 종양 효율 연구에 대해 종양 크기가 대략 157㎣로 도달되었을 때 처리를 시작하였다(n=16 마우스/그룹). 화합물 A 또는 비히클(수 중에서 0.5% NaCMC+0.1% 트윈-80)을 21일 또는 28일 동안 10㎕/g의 용량 용적에서 경구로 BID로 투여하였다. 동물 체중을 처음 1주 동안 매일, 이어서, 연구의 나머지 동안 1주 2회 측정하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 1주 2회 측정하고 나서, 용적을 ㎣로 표현하였다. PK/PD 분석을 위해, 가장 큰 종양 부담을 지니는 8마리 마우스를 투약의 21일 후에 종양 및 혈액 수집을 위해 안락사시켰다. 남아있는 마우스에 1주 이상 동안 투약을 지속하였고, 29일로부터 처리를 중단하고 나서, 마우스를 종양 성장 지연 연구에 등록하였다. 그들이 종양 용적 종점(2000㎣)에 도달되었을 때까지 또는 60일까지(어느 쪽이든 먼저 된 것) 개체로서 마우스를 관찰하였다.
약동학적 분석: 덱사메타손을 내부 표준으로서 사용하였다. 30㎕ 혈장 샘플의 알리쿼트를 30㎕ IS(덱사메타손, 1000ng/㎖) 및 150㎕ ACN으로 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반시키고 나서, 5분 동안 14000rpm에서 원심분리시켰다. 2㎕ 상청액의 알리쿼트를 LC-MS/MS 분석(Q-트랩 3200)을 위해 주사하였다. 10배 희석 혈장 샘플에 대해, 3㎕ 혈장 샘플의 알리쿼트에 27㎕ 블랭크 혈장을 첨가하였고, 희석 인자는 10이었으며, 이어서, 30㎕ IS(덱세메타손, 1000ng/㎖) 및 150㎕ ACN을 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반시키고 나서, 14000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 2㎕ 상청액의 알리쿼트를 LC-MS/MS 분석을 위해 주사하였다. 종양 샘플을 비드비터(Beadbeater)(등록상표) 상에서 30초 동안 3 x PBS (w/v)와 함께 균질화시켜 종양 세포분쇄액을 얻었다. 30 ㎕ 종양 세포분쇄액 샘플의 알리쿼트를 30㎕ IS(덱사메타손, 1000 ng/㎖) 및 150㎕ ACN과 함께 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반시키고 나서, 14000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 2㎕ 상청액의 알리쿼트를 LC-MS/MS 분석을 위해 주사하였다.
실시예 4: 일반적 실험 절차
NMR
달리 언급되지 않는 한, CDCl3을 사용하여 1H-NMR 스펙트럼을 취하였고, 배리언(Varian) 또는 옥스포드(Oxford) 기기 자석형(500㎒) 기기를 사용하여 400 또는 500㎒에서 기록하였다. 나타난 다중선은 다음과 같다 s=단일선, d = 2중선, t = 3중선, q = 4중선, 퀸트 = 5중선, sxt = 6중선, m = 다중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선; br은 넓은 신호를 나타냄.
LCMS 및 HPLC
시마즈(Shimadzu) LC-Q, 시마즈 LCMS-2010EV 또는 워터스 엑퀴티 초성능 LC(Waters Acquity Ultra Performance LC). HPLC: 150 x 4.5㎜ YMC ODS-M80 칼럼을 또는 1.0㎖/분에서 150 x 4.6㎜ YMC-Pack Pro C18 칼럼을 이용하는 시마즈(Shimadzu) SPD-20A에 의해 생성물을 분석하였다.
이동상은 MeCN:H2O=3:2(0.3% SDS 및 0.05% H3PO4를 함유), 수 중의 0.05% TFA, 아세토나이트릴 중의 0.05% TFA(구배 초기 20%, 이어서, 3분에 95%로 농축시키는 0.05% TFA/MeCN을 3.51 내지 4.50분에서 0.5분 동안 보유한 다음, 0.05%TFA/MeCN 농도 20%를 유지).
대안적으로, LCMS는 2가지 상이한 방법을 사용하였고; 하나는 가장 잘 사용하는 고 pH(METCR1600)이고, 다른 것은 더 표준인 화합물에 대한 것(METCR1416)이다.
수 중에서 0.1% 폼산- 이동상 "A" 아세토나이트릴 중의 0.1% 폼산 - 워터스 아틀란티스(Waters Atlantis) dC18, 2.1㎜ x 100㎜, 3㎛ 칼럼을 이용하는 이동상 "B", 유속= 0.6 ㎖/분 칼럼 온도 = 40℃; 시간(분) %B 0.00분 5% B. 5.0분 100% B, 5.4분 100% B 및 .42분 5%B
3.5분 방법은 아틀란티스 dC18, 2.1㎜ x 50㎜, 3㎛ 칼럼, 40C에서 유속 1㎖/분을 지칭한다. 이동상 A 폼산(aq.) 0.1% 이동상 B 폼산(MeCN) 0.1%, 주사 3 ㎕, 구배 0분(5% 유기), 2.5분(100% 유기), 2.7분(100% 유기), 2.71분(5% 유기), 3.5분(5% 유기)
7.0분 방법은 40C에서 아틀란티스 dC18, 2.1㎜ x 100㎜, 3㎛ 칼럼, 0.6㎖/분의 유속을 지칭한다. 이동상 A 폼산 (aq.) 0.1% 이동상 B 폼산(MeCN) 0.1%, 주사 3 ㎕, 구배 0분(5% 유기), 5분(100 % 유기), 5.4분(100 % 유기), 5.42분(5% 유기), 7분(5% 유기)
3.5와 7분 방법을 둘 다 LC-20AB 펌프 및 SPD-M20A PDA 검출기를 이용하는 MS18 시마즈 LCMS-2010EV 또는 MS19 시마즈 LCMS-2010EV 시스템 상에서 수행하였다.
생성물을 3100 질량 검출기를 지니는 워터스 자동정제 시스템을 사용하여 HPLC/MS에 의해 정제하였다.
HPLC 분석을 또한 1.4 ㎖/분의 유속으로 주위온도에서 YMC ODS-A, C18, (150x4.6 x5㎛) 칼럼을 사용하여 시마즈 LC-2010CHT 상에서 수행할 수 있다. 10㎕의 주사 용적을 이용하고 나서, UV/PDA를 통해 검출한다. 이동상 A는 수 중에서 0.05% TFA이고, 이동상 B는 8분에 초기 5% B 내지 95% B의 구배 프로그램을 이용하여 아세토나이트릴 중에서 0.05% TFA이고, 9.51 내지 12분 B. 농도 0.5%에서 1.5분 동안 유지하였다. 희석제는 이동상이다.
기타
자동 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 바이오티지 아이소레라(Biotage Isolera) 버전 4 상에서 수행하였다. 12 ㎖/분에서 실행하는 10g SNAP 카트리지 또는 25 ㎖/분에 실행하는 25g SNAP 카트리지 그리고 254㎚ 및 280㎚에서 검출함.
선택한 나이트릴 환원을 실험 절차에서 기재한 조건에 따라 탈레스나노 H-큐브(ThalesNano H-Cube)(등록상표) 상에서 수행할 수 있다.
다른 관련된 일반적 절차를 또한 국제 특허 출원 공개 WO12/118812호, 국제 특허 출원 PCT/US2012/033648호 및 국제 특허 출원 PCT/US2012/033662호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다.
실시예 5: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-5-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드의 합성
단계 1: 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산의 합성
진한 H2SO4(400㎖) 중의 2-메틸-3-나이트로벤조산(100g, 552m㏖)의 교반 용액에, 1,3-다이브로모-5,5-다이메틸-2,4-이미다졸리딘다이온(88g, 308m㏖)을 실온에서 부분적 방식으로 첨가하고, 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 나서, 침전된 고체를 여과시키고, 물로 세척 후, 진공 하에 건조시켜 고체로서 목적으로 하는 화합물(140g, 98%)을 얻었다. 단리된 화합물을 다음 단계로 직접 취하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
단계 2: 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트의 합성
DMF(2.8ℓ) 중에서 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산(285g, 1105m㏖)의 교반 용액에, 실온에서 탄산나트륨(468g, 4415m㏖)을 첨가한 후 요오드화메틸(626.6g, 4415m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 가열하였다. 완료 후(TLC에 의해 모니터링), 반응 혼합물을 여과시키고 나서(탄산나트륨을 제거) 에틸 아세테이트로 세척하였다(1ℓ X 3). 합한 여과액을 물로 세척하고(3L X 5) 나서, 수성상을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다(1L X 3). 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 고체로서 표제 화합물(290g, 97% 수율)을 얻었다. 단리된 화합물을 다음 단계로 직접 취하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
단계 3: 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트의 합성
에탄올(1.5ℓ) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트 (290g, 1058m㏖)의 교반 용액에 수성 염화 암모늄(283g, 5290m㏖, 1.5ℓ 물 중에 용해시킴)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 80℃에서 교반시키고, 그것에 철가루(472g, 8451m㏖)를 부분적 방식으로 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 가열하였다. TLC에 의해 결정한 것의 완료 시, 반응 혼합물을 셀라이트(celite)(등록상표)를 거쳐 보온여과시키고 나서, 셀라이트층을 메탄올(5ℓ)로 세척한 후에 DCM(5ℓ) 중의 30% MeOH로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축시키고 나서, 얻어진 잔사를 수성 중탄산나트륨 용액(2ℓ)으로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(5ℓ X 3). 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 고체로서 표제 화합물을 얻었다(220g, 85%). 화합물을 다음 단계로 직접 취하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).
단계 4: 메틸 5-브로모-2-메틸-3-((테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노) 벤조에이트의 합성
다이클로로에탄(300㎖) 중의 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트(15g, 61.5m㏖) 및 다이하이드로-2H-피란-4(3)-온(9.2g, 92m㏖)의 교반 용액에 아세트산(22g, 369m㏖)을 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 다음, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 트라이아세톡시보로하이드라이드나트륨(39g, 184m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반시켰다. TLC에 의해 결정한 바와 같은 반응의 완료 시, 수성 중탄산나트륨 용액을 pH 7 내지 8이 얻어질 때까지 반응 혼합물에 첨가하였다. 유기상을 분리시키고 나서, 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 에틸 아세테이트:헥산으로 용리하는 칼럼 크로마토그래피(100 내지 200 메쉬 실리카겔)에 의해 정제하여 고체로서 목적으로 하는 화합물(14g, 69%)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ7.01 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.00 (d, 1H, J=7.6 Hz), 3.84-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 1H), 3.43 (t, 2H, J=12 Hz), 2.14 (s, 3H), 1.81-1.84 (m, 2H), 1.47-1.55 (m, 2H).
단계 5: 메틸 5-브로모-3-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노)-2-메틸벤조에이트의 합성
다이클로로에탄(150㎖) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-((테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노) 벤조에이트(14g, 42.7m㏖)의 교반 용액에 아세트알데하이드(3.75g, 85.2m㏖) 및 아세트산(15.3g, 256m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 나서, 트라이아세톡시보로하이드라이드나트륨(27g, 128m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC에 의해 결정한 바와 같은 반응의 완료 시, 수성 중탄산나트륨 용액을, pH 7 내지 8이 얻어질 때까지 반응 혼합물에 첨가하였고, 유기층을 분리하고 나서, 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 에틸 아세테이트: 헥산으로 용리하는 칼럼 크로마토그래피(100 내지 200 메쉬 실리카겔)로 용리시킴으로써 정제하여 점성의 액체로서 목적으로 하는 화합물(14g, 93%)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J=6.8 Hz).
단계 6: 5-브로모-N-((4, 6-다이메틸-2-옥소-1, 2-다이하이드로피리딘-3-일) 메틸)-3-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노)-2-메틸벤즈아마이드의 합성
에탄올(100㎖) 중의 5-브로모-3-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노)-2-메틸벤조에이트(14g, 39.4m㏖)의 교반 용액에 수성 NaOH(2.36g, 25㎖ 물 중의 59.2m㏖)을 첨가하고 나서, 얻어진 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. TLC에 의해 결정한 바와 같은 반응의 완료 시, 용매를 감압 하에 제거하고 나서, 잔사를, pH 7이 얻어질 때까지 1N HCl로 산성화시킨 다음, 수성 시트르산 용액을 pH 5 내지 6이 얻어질 때까지 첨가하였다. 수층을 DCM 중의 10% MeOH로 추출하고 나서(200㎖ X 3), 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 각각의 산(14g, 100%)을 제공하였다.
이어서, 상기 산(14g, 40.9m㏖)을 DMSO(70㎖) 중에 용해시키고 나서, 3-(아미노 메틸)-4, 6-다이메틸피리딘-2(1H)-온(12.4g, 81.9m㏖)을 그것에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 다음, PYBOP(31.9g, 61.4m㏖)를 첨가하고 나서, 교반을 밤새 실온에서 계속하였다. TLC에 의해 결정한 바와 같은 반응의 완료 시, 반응 혼합물을 얼음물(700㎖)에 붓고 나서, 30분 동안 교반시키고, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고 나서, 물로 세척하고(500㎖) 공기 건조시켰다. 얻어진 고체를 아세토나이트릴과 함께 교반시키고(75㎖ X 2), 여과 후, 공기 건조시켰다. 얻어진 고체를 다시 DCM(100㎖) 중의 5% MeOH와 함께 교반시키고 나서, 여과 후, 진공 하에 완전히 건조시켜 고체로서 표제 화합물(14g, 74%)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ11.47 (s, 1H), 8.23 (t, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.23 (d, 2H, J=4.4 Hz), 3.81 (d, 2H, J=10.4 Hz), 3.20-3.26 (m, 2H), 3.00-3.07 (m, 1H), 2.91-2.96 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.58-1.60 (m, 2H), 1.45-1.50 (m, 2H), 0.78 (t, 3H, J=6.8 Hz).
단계 7: N-((4, 6-다이메틸-2-옥소-1, 2-다이하이드로피리딘-3-일) 메틸)-5-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1, 1'-바이페닐]-3-카복스아마이드의 합성
다이옥산/물 혼합물(70㎖/14㎖) 중의 5-브로모-N-((4, 6-다이메틸-2-옥소-1, 2-다이하이드로피리딘-3-일) 메틸)-3-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일) 아미노)-2-메틸벤즈아마이드(14g, 29.5m㏖)의 교반 용액에 4-(4-(4, 4, 5, 5-테트라메틸-1, 3, 2-다이옥사보롤란-2-일) 벤즈일) 몰폴린(13.4g, 44.2m㏖)을 첨가한 다음 Na2CO3(11.2g, 106.1m㏖)를 첨가하였다. 용액을 아르곤으로 15분 동안 퍼지한 다음, Pd(PPh3)4(3.40g, 2.94m㏖)를 첨가하고 나서, 용액을 다시 아르곤으로 추가 10분 동안 퍼지시켰다. 반응 혼합물을 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 완료 후(TLC에 의해 모니터링), 반응 혼합물을 물로 희석시키고 나서, 10% MeOH/DCM으로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 메탄올:DCM으로 용리하는 칼럼 크로마토그래피(100 내지 200 메쉬 실리카겔)에 의해 정제하여 고체로서 표제 화합물(12g, 71%)을 얻었다. 분석 데이터: LCMS: 573.35 (M + 1)+; HPLC: 99.5% (@ 254㎚) (R t ;3.999; 방법: 칼럼: YMC ODS-A 150㎜ x 4.6㎜ x 5μ 이동상: A; 수 중에서 0.05% TFA/ B; 아세토나이트릴 중에서 0.05% TFA; 주사 용적: 10㎕, 칼럼 온도: 30 ℃; 유속: 1.4㎖/분; 구배: 8분에 5% B 내지 95% B, 1.5분 동안 유지, 9.51 내지 12분 5% B); 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ11.46 (s, 1H), 8.19 (t, 1H), 7.57 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.36-7.39 (m, 3H), 7.21 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.28 (d, 2H, J=2.8 Hz), 3.82 (d, 2H, J=9.6 Hz), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.24 (t, 2H, J=10.8Hz), 3.07-3.09 (m, 2H), 3.01 (m, 1H), 2.36 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.64-1.67 (m, 2H), 1.51-1.53 (m, 2H), 0.83 (t, 3H, J=6.4 Hz).
단계 8: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-5-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드 트라이하이드로클로라이드의 합성
N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1, 2-다이하이드로피리딘-3-일) 메틸)-5-(에틸 (테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드(12g, 21.0m㏖)를 메탄올 HCl(200㎖) 중에 용해시키고 나서, 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 3시간의 교반 후에, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 얻어진 고체를 에터와 함께 교반시켜(100㎖ X 2) 고체로서 목적으로 하는 염(11g, 77%)을 얻었다. 트라이-HCl 염의 분석 데이터: LCMS: 573.40 (M + 1)+; HPLC: 99.1%(@ 254㎚) (R t ; 3.961; 방법: 칼럼: YMC ODS-A 150㎜ x 4.6㎜ x 5 μ 이동상: A; 수 중에서 0.05% TFA/ B; 아세토나이트릴 중에서 0.05% TFA; 주사 용적: 10㎕, 칼럼 온도: 30℃; 유속: 1.4㎖/분.; 구배: 8분에 5% B 내지 95% B, 1.5분 동안 보유, 9.51 내지 12분 5% B); 1H NMR (D2O 400 MHz) δ7.92 (bs, 1H,) 7.80 (s, 1H), 7.77 (d, 2H, J=8 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.09-4.11 (m, 4H), 3.95-3.97 (m, 2H), 3.77 (t, 3H, J=10.4 Hz), 3.44-3.47 (m, 3H), 3.24-3.32 (m, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.01 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.04 (t, 3H, J=6.8 Hz).
실시예 6: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-5-(((1r,4r)-4-(다이메틸아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드
단계 1: 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산
진한 H2SO4(400㎖) 중의 2-메틸-3-나이트로벤조산(100g, 552.48m㏖)의 교반 용액에, 1,3-다이브로모-5,5-다이메틸-2,4-이미다졸리딘다이온(87.98g, 307.70m㏖)을 실온에서 부분적 방식으로 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 나서, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척 후 진공 하에 건조시켜 회백색 고체로서 목적으로 하는 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산(140g, 97.90% 수율)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
단계 2: 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트
DMF(2.8ℓ) 중의 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산(285g, 1104.65m㏖)의 교반 용액에, 실온에서 탄산나트륨(468g, 4415.09m㏖)을 첨가한 다음 요오드화메틸(626.63g, 4415m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 여과시켜 현탁된 고체를 제거하였고, 이를 에틸 아세테이트로 잘 세척하였다(3 x 1ℓ). 합한 여과액을 물(5 x 3ℓ)로 잘 세척하고 나서, 수성상을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다(3 x 1ℓ). 합한 유기 추출물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 회백색 고체로서 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트(290g, 97% 수율)를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
단계 3: 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트
에탄올(1.5ℓ) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트 (290g, 1058.39m㏖)의 교반 용액에 수성 염화 암모늄(283g, 5290m㏖, 1.5ℓ 물 중에 용해시킴)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 교반시키고 나서, 80℃에서 가열 후 80℃에서 부분적으로 철가루(472g, 8451m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물 80℃에서 12시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트(등록상표)를 통해 보온 여과시키고, 셀라이틀(등록상표) 층을 메탄올(5ℓ)로 세척한 다음 DCM(5ℓ) 중의 30% MeOH로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축시키고 나서, 얻어진 잔사를 수성 중탄산염(2ℓ)으로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 x 5 L). 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 갈색 고체로서 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트(220g, 89.41% 수율)를 얻었다.
생성물의 일부(5g)를 뜨거운 에탄올(20㎖)중에 용해시키고 나서, 불용성 잔사를 여과시키고, 모액을 농축시켜 밝은 갈색 고체로서 HPLC 순도 93.81%의 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트 (3.5g, 70% 수율)를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).
단계 4: 메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸벤조에이트
다이클로로에탄(50㎖) 중의 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트(5g, 20.5m㏖) 및 tert-뷰틸(4-옥소사이클로헥실)카바메이트(5.69g, 26.7m㏖) 교반 용액에 아세트산(7.4g, 123m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 트라이아세톡시보로하이드라이드나트륨(13.1g, 61.7m㏖)을 0℃에서 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응을 수성 중탄산나트륨으로 퀀칭시키고 나서, 유기상을 분리시키고, 수성상을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 진공에서 농축시켰다. 조질의 생성물을 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(100 내지 200 메쉬 크기)에 의해 정제하여 3.5g의 더 극성의(트랜스) 이성질체인 메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸벤조에이트를 고체로서(38.46%) 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ7.21 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.41 (bs, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.60 (m, 1H), 3.45 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.15 (bs, 2H), 2.05 (bs, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.30 (m, 4H).
단계 5: 메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)-(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트
다이클로로에탄(550㎖) 중의 메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(55g, 0.124㏖) 및 아세트알데하이드(11g, 0.25㏖)의 교반 용액에, 아세트산(44.64g, 0.744㏖)를 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 이어서, 트라이아세톡시보로하이드라이드나트륨(79g, 0.372㏖)을 0℃에서 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응물을 수성 중탄산나트륨으로 퀀칭시키고 나서, 유기상을 분리시키고, 수성상을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 추출물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 진공에서 농축시켰다. 조질의 화합물을 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(100-200 메쉬 크기)에 의해 정제하여 44g의 메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)-(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(75.2%)를 고체로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ7.55 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.15 (bs, 1H), 3.05 (q, 2H), 2.60 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.75 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.80 (t, 3H).
단계 6: tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-브로모-3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸페닐)(에틸)아미노)사이클로헥실)카바메이트
수성 NaOH(3.5g, 10㎖ H2O 중의 0.08㏖)를 EtOH(100㎖) 중의메틸 5-브로모-3-(((1r,4r)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)-(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(25g, 0.053㏖) 용액에 첨가하고 나서, 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 이어서, 에탄올을 감압 하에 제거하고 나서, 묽은 HCl을 이용하여 pH 8로 시트르산을 이용하여 pH 6으로 산성화한다. 혼합물을 DCM 중의 10% 메탄올로 추출하였다(3 x 200㎖). 합한 유기층을 건조시키고 나서, 농축하여 각각의 산(24.2g, 99.0%)을 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ13.13 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 6.68 (d, 1H), 3.14 (bs, 1H), 3.03 (q, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.80-1.65 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.77 (t, 3H).
산(24g, 0.053㏖)을 DMSO(100㎖) 중에 용해시키고 나서, 3-(아미노메틸)-4,6-다이메틸피리딘-2(1H)-온(16g, 0.106㏖) 및 트라이에틸아민(5.3g, 0.053㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 후에, PyBop(41g, 0.079m㏖)를 첨가하고, 이어서, 교반을 밤새 실온에서 계속하였다. 반응 혼합물을 얼음물(1ℓ)에 부었다. 얻어진 침전물을 여과에 의해 수집하고 나서, 물로 잘 세척하고(2 x 1ℓ) 건조시켰다. 얻어진 생성물을 아세토나이트릴(3 x 200㎖) 및 DCM(100㎖)으로 세척에 의해 추가로 정제하여 tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-브로모-3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸페닐)(에틸)아미노)사이클로헥실)-카바메이트(24g, 77%)를 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ11.47 (s, 1H), 8.24 (t, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.67 (d, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.24 (d, 2H), 3.13 (bs, 1H), 3.01 (q, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.18 (s, 3H), 2.10 (s, 6H), 1.80-1.65 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.77 (t, 3H).
단계 7: tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-일)(에틸)아미노)사이클로헥실)카바메이트
다이옥산/물 혼합물(160㎖ + 40㎖) 중의 tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-브로모-3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸페닐)(에틸)아미노)사이클로헥실)-카바메이트(24g, 0.041㏖) 및 4-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤즈일)몰폴린(18g, 0.061㏖)의 교반 용액에, Na2CO3(15g, 0.15㏖)을 첨가하고 나서, 용액을 아르곤으로 15분 동안 퍼지시켰다. 이어서, Pd(PPh3)4(4.7g, 0.041㏖)를 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 다시 아르곤으로 10분 동안 퍼지시켰다. 반응 혼합물을 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 10% MeOH/DCM(500㎖)로 희석시키고 나서, 여과시켰다. 여과액을 농축시키고 나서, 물(500㎖)로 희석시키고, DCM 중의 10% MeOH로 추출하였다(3 x 500㎖). 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조질의 생성물을 DCM 중의 7% MeOH로 용리하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(100 내지 200 메쉬)에 의해 정제하여 tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-일)(에틸)아미노)사이클로헥실)카바메이트(20g, 71.43%)를 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ11.46 (s, 1H), 8.20 (t, 1H), 7.56 (d, 2H), 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 1H), 6.66 (d, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.28 (d, 2H), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.20-3.05 (m, 3H), 2.62 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.20 (s, 6H), 2.10 (s, 3H), 1.75 (m, 4H), 1.42 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.82 (t, 3H).
단계 8: 5-(((1r,4r)-4-아미노사이클로헥실)(에틸)아미노)-N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드
0℃에서 DCM(200㎖) 중의 tert-뷰틸 ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-일)(에틸)아미노)사이클로헥실)카바메이트(20g, 0.03㏖)의 교반 용액에, TFA(75㎖)를 첨가하고 나서, 반응물을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 농축건조시키고 나서, 수성 포화 중탄산 용액(300㎖)으로 잔사를 pH 8까지 염기화하였다. 혼합물을 DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다(4 x 200 m). 합한 추출물을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하여 5-(((1r,4r)-4-아미노사이클로헥실)(에틸)아미노)-N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드(15.5g, 91%)를 얻었고, 다음 반응에서 사용하였다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ8.18 (bs, 1H), 7.57 (d, 2H), 7.38 (m, 3H), 7.20 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.29 (d, 2H), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.31 (bs, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.23 (m, 2H), 0.83 (t, 3H).
단계 9: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-5-(((1r,4r)-4-(다이메틸아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드
다이클로로메탄(150㎖) 중의 5-(((1r,4r)-4-아미노사이클로헥실)(에틸)아미노)-N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-4-메틸-4'-(몰폴리노메틸)-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드(14g, 0.023㏖)의 교반 용액에 0℃에서 수성 35% 폼알데하이드 용액(2.4g, 0.080㏖)을 첨가하였다. 20분 동안 교반시킨 후에, Na(OAc)3BH (12.2g, 0.057㏖)를 첨가하고 나서, 2시간 동안 0℃에서 교반을 지속하였다. 이어서, 물(100㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 혼합물을 DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다(3 x 200㎖). 합한 추출물을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조질의 생성물을 DCM 중의 6 내지 7% MeOH로 용리하는 염기성 알루미나 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(10g, 63.6%)을 얻었다. LCMS: 614.65 (M + 1)+; HPLC: 98.88% (@ 210-370㎚) (R t ;3.724; 방법: 칼럼: YMC ODS-A 150㎜ x 4.6㎜ x 5μ 이동상: A; 수중에서 0.05% TFA/ B; 아세토나이트릴 중의 0.05% TFA; 주사 용적: 10 ㎕, 칼럼 온도: 30℃; 유속: 1.4㎖/분; 구배: 8분에 5% B 내지 95% B, 1.5분 동안 유지, 9.51 내지 12분 5% B); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ11.45 (s, 1H), 8.17 (t, 1H), 7.56 (d, 2H, J=8 Hz), 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.29 (d, 2H, J=4.4 Hz), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.09 (q, 2H), 2.66 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.11 (s, 9H), 1.79 (m, 4H), 1.36 (m, 2H), 1.11 (m, 2H), 0.82 (t, 3H, J=6.4&6.8 Hz).
실시예 7: 생분석 프로토콜 및 일반적 방법
야생형 및 돌연변이체 PRC2 효소 분석에 대한 프로토콜
일반적 물질. S-아데노실메티오닌(SAM), S-아데노실호모시스테인(SAH), 비신, KCl, 트윈(트윈)20, 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 소 피부 젤라틴(BSG)을 가능한 가장 고수준의 순도에서 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 다이티오트레이톨(DTT)을 EMD사로부터 구입하였다. 3H-SAM을 80 Ci/m㏖의 특이적 활성을 지니는 아메리칸 라디오라벨드 케미컬즈사(American Radiolabeled Chemicals)로부터 구입하였다. 384-웰 스트렙타비딘 플래쉬플레이트(Flashplates)를 퍼킨엘머사(PerkinElmer)로부터 구입하였다.
기질. 미변형 라이신 27(H3K27me0) 또는 다이메틸화된 라이신 27(H3K27me2) 중 하나를 함유하는 대표적인 인간 히스톤 H3 잔기 21 내지 44의 펩타이드를 21st 센추리 바이오케미컬스(Century Biochemicals)에 의해 C-말단 G(K-바이오틴) 링커-친화도 태그 모티프 및 C-말단 아마이드 캡을 이용하여 합성하였다. 펩타이드를 95% 초과의 순도로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제하고 나서, 액체 크로마토그래피 질량분석법(LC-MS)에 의해 확인하였다. 서열을 이하에 나타낸다.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(바이오틴)-아마이드(서열번호 7)
H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(바이오틴)-아마이드(서열번호 8)
닭 적혈구 올리고뉴클레오솜을 확립된 절차에 따라 닭 혈액으로부터 정제하였다.
재조합체 PRC2 복합체. 인간 PRC2 복합체를 바큘로바이러스 발현시스템을 사용하여 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda: sf9)에서 과발현시킨 4-성분 효소 복합체로서 정제하였다. 발현된 서브유닛은 야생형 EZH2 작제물, EED(NM_003797), Suz12(NM_015355) 및 RbAp48(NM_005610)로부터 생성된 야생형 EZH2(NM_004456) 또는 EZH2 Y641F, N, H, S 또는 C 돌연변이체였다. EED 서브유닛은 sf9 세포 용해물로부터의 전체 4-성분 복합체를 정제하기 위해 사용한 N-말단의 FLAG 태그를 함유하였다. 복합체의 순도는 SDS-PAGE 및 애질런트 바이오어날라이저(Agilent Bioanalyzer) 분석에 의해 결정되는 바와 같이 95%를 충족시키거나 또는 초과한다. 소 혈청 알부민(BSA) 표준에 대해 브래드포드(Bradford) 분석을 사용하여 효소 저장액 농도(일반적으로 0.3 내지 1.0㎎/㎖)를 결정하였다.
펩타이드 기질에 대한 PRC2 효소 분석을 위한 일반적 절차. 분석을 모두 20mM 비신(pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG 및 0.002% 트윈20로 이루어진 완충제 중에서 수행하고 나서, 사용일에 제조하였다. 100% DMSO(1㎕) 중의 화합물을 384-채널 피펫 헤드(써모사(Thermo))를 구비한 플레이트메이트(Platemate) 2 X 3를 사용하여 폴리프로필렌 384-웰 V-자 바닥 플레이트(그라이너사(Greiner)) 내로 스팟팅하였다. DMSO(1㎕)를 최대 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 A 내지 H에 첨가하고 나서, PRC2의 공지된 생성물 및 저해제인 SAH(1㎕)를 최소 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 I 내지 P에 첨가하였다. 야생형 PRC2 효소 및 H3K27me0 펩타이드 또는 임의의 Y641 돌연변이체 효소 및 H3K27me2 펩타이드를 함유하는 칵테일(40㎕)을 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi)(써모사)에 의해 첨가하였다. 화합물을 25℃에서 30분 동안 PRC2와 함께 인큐베이션시킨 다음, 비-방사성 및 3H-SAM의 혼합물을 함유하는 칵테일(10㎕)을 첨가하여 반응을 개시하였다(최종 용적 = 51㎕). 모든 경우에, 최종 농도는 다음과 같았다: 야생형 또는 돌연변이체 PRC2 효소는 4nM이고, 최소 신호 제어 웰에서 SAH는 1mM이며, DMSO 농도는 1%였다. 성분의 나머지의 최종 농도를 이하의 표 7에 나타낸다. 600μM의 최종 농도로 비-방사성 SAM(10㎕)의 첨가에 의해 분석을 중단하였고, 3H-SAM을, 펩타이드 기질 내에 그것의 포함이 더 이상 검출되지 않는 수준까지 희석시켰다. 이어서, 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 내 50㎕의 반응물을 384-웰 플래쉬플레이트에 옮기고 나서, 바이오티닐화된 펩타이드를 적어도 1시간 동안 스트렙타비딘 표면에 결합시킨 후에 바이오테크(Biotek) ELx405 플레이트 세척기에서 0.1% 트윈(트윈)20으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 퍼킨엘머 탑카운트(TopCount) 플레이트 판독기에서 판독하여 플래쉬플래이트 표면에 결합된 3H-표지 펩타이드의 양을 측정하고, 분당 붕해(disintegrations per minute: dpm)로서 측정하며, 또는 대안적으로 분당 계수(counts per minute: cpm)로서 지칭하였다.
EZH2 정체성(야생형 또는 Y641 돌연변이체 EZH2)에 기반한 각각의 분석 변화에 대한 성분의 최종 농도
PRC2 효소
(EZH2 정체성에 의해 정의됨)		 펩타이드(nM) 비-방사성 SAM(nM) 3H-SAM (nM)
야생형 185 1800 150
Y641F 200 850 150
Y641N 200 850 150
Y641H 200 1750 250
Y641S 200 1300 200
Y641C 200 3750 250
올리고뉴클레오솜 기질에 대한 야생형 PRC2 효소 분석에 대한 일반적 절차. 분석을 20mM 비신(pH = 7.6), 0.5mM DTT, 0.005% BSG, 100mM KCl 및 0.002% 트윈20으로 이루어진 완충제 중에서 수행하였고, 사용일에 제조하였다. 100% DMSO(1㎕) 중의 화합물을 384-채널 피펫 헤드(써모사)를 구비한 플레이트메이트 2 X 3를 사용하여 폴리프로필렌 384-웰 V-자 바닥 플레이트(그라이너사) 내로 스팟팅하였다. DMSO(1㎕)를 최대 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 A 내지 H에 첨가하고 나서, PRC2의 공지된 생성물 및 저해제인 SAH(1㎕)를 최소 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 I 내지 P에 첨가하였다. 야생형 PRC2 효소 및 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜을 함유하는 칵테일(40㎕)을 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi)(써모사)에 의해 첨가하였다. 화합물을 25℃에서 30분 동안 PRC2와 함께 인큐베이션시킨 다음, 비-방사성 및 3H-SAM의 혼합물을 함유하는 칵테일(10㎕)을 첨가하여 반응을 개시하였다(최종 용적 = 51㎕). 최종 농도는 다음과 같았다: 야생형 PRC2 효소는 4nM이고, 비-방사성 SAM은 430nM이며, 3H-SAM은 120 nM이고, 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜은 120nM이며, 최소 신호 제어 웰 내 SAH는 1mM이고, DMSO 농도는 1%였다. 600μM의 최종 농도로 비-방사성 SAM(10㎕)의 첨가에 의해 분석을 중단하였고, 3H-SAM을, 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜 기질 내에 그것의 포함이 더 이상 검출되지 않는 수준까지 희석시켰다. 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 중의 50㎕의 반응물을 384-웰 플래쉬플레이트에 옮기고, 닭 적혈구 뉴클레오솜을 플레이트의 표면에 고정시킨 다음, 바이오테크 ELx405 플레이트 세척기에서 0.1% 트윈20으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 퍼킨엘머 탑카운트 플레이트 판독기에서 판독하여 플래쉬플레이트 표면에 결합된 3H-표지 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜의 양을 측정하고, 분당 붕해(dpm)로서 측정하며, 또는 대안적으로 분당 계수(counts per minute: cpm)로서 지칭하였다.
저해% 계산
여기서, dpm = 분당 붕해, cmpd = 분석 웰에서의 신호이고, min 및 max는 각각 최소 및 최대 신호 제어이다.
4-변수 IC 50 적합도
상부 및 하부가 정상적으로 유동되는 경우이지만, 3-변수 적합도에서 각각 100 또는 0에서 고정될 수 있다. 힐 계수(Hill Coefficient)는 정상적으로 유동되지만 또한 3-변수 적합도에서 1로 고정될 수 있다. Y는 저해%이고, X는 화합물 농도이다.
펩타이드 기질(예를 들어, EZH2 야생형 및 Y641F)에 대한 PRC2 효소 분석에 대한 IC50 값을 이하의 표 8에 제시한다.
WSU-DLCL2 메틸화 분석
WSU-DLCL2 현탁 세포를 DSMZ(독일 브라운슈바이크에 소재한 독일 미생물 및 세포 배양물의 수집기관(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))로부터 구입하였다. RPMI/글루타맥스(Glutamax) 배지, 페니실린-스트렙토마이신, 열-불활성화 태아 소 혈청 및 D-PBS를 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)로부터 구입하였다. 추출 완충제 및 중화 완충제(5X)를 미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 액티브 모티프사(Active Motif)로부터 구입하였다. 토끼 항-히스톤 H3 항체를 미국 매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 Abcam사로부터 구입하였다. 토끼 항-H3K27me3 및 HRP-컨쥬게이트 항-토끼-IgG를 미국 매사추세츠주 댄버에 소재한 셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였다. TMB "초민감(Super Sensitive)" 기질을 미국 메릴랜드주 오잉 밀스에 소재한 바이오에프엑스 래버러토리즈사(BioFX Laboratories)로부터 구입하였다. IgG-유리 소 혈청 알부민을 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브에 소재한 잭슨 이뮤노리서치사(Jackson ImmunoResearch)로부터 구입하였다. 트윈과 함께 PBS(10X PBST)를 미국 메릴랜드주 게이더스버그에 소재한 KPL사로부터 구입하였다. 황산을 미국 텍사스주 알링턴에 소재한 리카 케미컬사(Ricca Chemical)로부터 구입하였다. 이뮬론(Immulon) ELISA 플레이트를 미국 뉴욕주 로체스터에 소재한 써모사로부터 구입하였다. V-자 바닥 세포 배양 플레이트를 미국 뉴욕주 코닝에 소재한 코닝사(Corning Inc.)로부터 구입하였다. V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트를 미국 노스캐롤라이나주 먼로에 소재한 그라이너 바이오-원사(Greiner Bio-One)으로부터 구입하였다.
WSU-DLCL2 현탁 세포를 성장 배지(10% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 100단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640)에서 유지하고 나서 37℃에서 5% CO2하에 배양시켰다. 분석 조건 하에서, 세포를 플레이트 진탕기 상에서 37℃에서 5% CO2 하에 분석 배지(20% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640)에서 배양시켰다.
WSU-DLCL2 세포를 200㎕/웰을 지니는 96-웰 V-자 바닥 세포 배양 플레이트에 대해 50,000개 세포/㎖의 농도에서 분석 배지 중에 파종하였다. 96 웰 공급물 플레이트로부터의 화합물(1㎕)을 V-자 바닥 세포 플레이트에 직접 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 역가-플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 4일 후에, 플레이트를 5분 동안 241 x g에서 교반시키고 나서, 세포 펠렛을 건드리는 일 없이 세포 플레이트의 각 웰로부터 배지를 부드럽게 흡입하였다. 펠렛을 200㎕ DPBS 중에서 재현탁시키고 나서, 플레이트를 241 x g에서 5분 동안 다시 교반시켰다. 상청액을 흡입하고 나서, 차가운(4℃) 추출 완충제(100㎕)를 웰 마다 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 오비탈 진탕기 상에서 4℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3427 x g x 10분에 교반시켰다. 상청액(80㎕/웰)을 96 웰 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 그것의 각각의 웰에 옮겼다. 중화 완충제 5X(20㎕/웰)를 상청액을 함유하는 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하였다. 조질의 히스톤 제제(CHP)를 함유하는 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 조질의 히스톤 제제를 100㎕ 코팅 완충제(1X PBS + BSA 0.05% w/v)를 함유하는 이중 96웰 ELISA 플레이트 내로 각각의 웰에 첨가하였다(2㎕/웰). 플레이트를 밀봉하고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 300㎕/웰 1X PBST로 3회 세척하였다. 웰을 300㎕/웰 ELISA 희석제((PBS (1X) BSA(2% w/v) 및 트윈20(0.05% v/v))으로 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 1X PBST로 3회 세척하였다. 히스톤 H3 검출 플레이트에 대해, 100㎕/웰에 ELISA희석제 중에서 1:10,000으로 희석시킨 항-히스톤-H3 항체(Abcam, ab1791)를 첨가하였다. H3K27 트라이메틸화 검출 플레이트에 대해, 100㎕/웰에 ELISA 희석제 중에서 1:2000으로 희석시킨 항-H3K27me3을 첨가하였다. 플레이트를 90분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 300㎕ 1X PBST/웰로 3회 세척하였다. 히스톤 H3 검출을 위해, ELISA 희석제 중에서 1:6000으로 희석시킨 100㎕의 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체를 웰마다 첨가하였다. H3K27me3 검출을 위해, ELISA 희석제 중에서 1:4000으로 희석시킨 100㎕의 HRP 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체를 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1X PBST 300㎕/웰로 4회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 웰마다 첨가하였다. 히스톤 H3 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. H3K27me3 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 반응을 황산 1N(100㎕/웰)로 중단시켰다. 각 플레이트에 대한 흡광도를 450㎚에서 판독하였다.
우선, 각 웰에 대한 비를 다음의 식에 의해 결정하였다:
각각의 플레이트는 DMSO만 처리(최소 저해)한 8개의 대조군 웰뿐만 아니라 최대 저해(배경 웰)에 대한 8개의 대조군 웰을 포함하였다.
각각의 대조군 유형에 대한 비 값의 평균을 계산하고 플레이트 내 각각의 시험 웰에 대한 저해%를 결정하기 위해 사용하였다. 시험 화합물을 25μM에서 시작해서 총 10개의 시험 농도에 대해 DMSO 중에서 3배로 단계 희석시켰다. 저해%를 결정하고, 화합물의 농도 당 이중 웰을 사용하여 IC50 곡선을 만들었다. 이 분석에 대한 IC50 값을 이하의 표 3A 및 표 3B에 제시한다.
세포 증식 분석
WSU-DLCL2 현탁 세포를 DSMZ(독일 브라운슈바이크에 소재한 독일 미생물 및 세포 배양물의 수집기관)로부터 구입하였다. RPMI/글루타맥스 배지, 페니실린-스트렙토마이신, 열 불활성화 소태아 혈청을 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 라이프 테크놀로지즈사로부터 구입하였다. V-자 바닥 폴리프로필렌 384-웰 플레이트를 미국 노스캐롤라이나주 먼로에 소재한 그라이너 바이오-원사로부터 구입하였다. 세포 배양 384-웰 백색 불투명 플레이트를 미국 매사추세츠주 윌섬에 소재한 퍼킨엘머로부터 구입하였다. 셀-타이터 글로(Cell-Titer Glo)(등록상표)를 미국 위스콘신주로부터에 소재한 프로메가사(Promega Corporation)로부터 구입하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 플레이트 판독기를 미국 캘리포니아주 써니베일에 소재한 몰레큘러 디바이스 엘엘씨(Molecular Devices LLC)로부터 구입하였다.
WSU-DLCL2 현탁 세포를 성장 배지(10% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청으로 보충한 RPMI 1640)에서 유지하고 나서 37℃에서 5% CO2 하에 배양시켰다. 분석 조건 하에서, 세포를 분석 배지(20% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청로 보충한 RPMI 1640 및 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신)에서 37℃에서 5% CO2하에 인큐베이션시켰다.
WSU-DLCL2 세포주의 증식에 대한 화합물 효과의 평가를 위해, 대수적으로 성장하는 세포를 분석 매질의 최종 용적 50㎕ 중에서 1250 세포/㎖의 밀도로 384-웰 백색 불투명 플레이트에서 플레이팅하였다. 10mM(분석에서 화합물의 최종적 최고 농도는 20μM이고 DMSO는 0.2%였음)에서 시작해서 DMSO 중에서 3회 9-지점 3배 단계 희석을 수행함으로써 화합물 공급 플레이트를 준비하였다. 화합물 저장 플레이트로부터의 100nℓ 알리쿼트를 세포 플레이트에서 그것의 각각의 웰에 첨가하였다. 100% 저해 대조군은 스타우로스포린의 200nM 최종 농도로 처리한 세포로 이루어지고, 0% 저해 대조군은 DMSO 처리 세포로 이루어진다. 화합물의 첨가 후에, 분석 플레이트를 6일 동안 37℃, 5% CO2, 상대 습도 > 90%에서 6일 동안 인큐베이션시켰다. 세포 배양물에 존재하는 ATP의 정량화에 의해 세포 생존도를 측정하였고, 35㎕의 셀 타이터 글로(등록상표)시약을 세포 플레이트에 첨가하였다. 스펙트라맥스 M5에서 발광을 판독하였다. 정규화된 용량 반응 곡선의 4-변수 적합도를 사용하여 50%만큼 세포 생존도를 저해하는 농도를 결정하였다.

Claims (34)

  1. 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법으로서, 치료 또는 완화가 필요한 대상체에게 EZH2 저해제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 뇌 및 중추신경계 암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 갖는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SWI/SNF-연관 암은 상기 SWI/SNF 복합체 또는 상기 SWI/SNF 복합체의 하나 이상의 성분의 감소된 발현 또는 기능상실을 특징으로 하는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 수모세포종, 악성횡문근양종양 및 비정형 유기형/간상 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 성분은 SNF5, ATRX 및 ARID1A로 이루어진 군으로부터 선택된, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 기능상실은 점 돌연변이, 결실 및/또는 삽입으로부터 초래되는 기능상실 돌연변이에 의해 야기되는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 SNF5의 결실을 갖는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 서열번호 5의 아미노산 위치 688에서 야생형 잔기 라이신(K)의 아스파라긴(N)으로의 치환(K688N), 및 서열번호 5의 아미노산 위치 366에서 야생형 잔기 메티오닌(M)의 아이소류신(I)으로의 치환(M366I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 ATRX의 돌연변이를 갖는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 서열번호 11의 아미노산 위치 884에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 넌센스 돌연변이(C884*), 아미노산 위치 966에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 라이신(K)으로의 치환(E966K), 서열번호 11의 아미노산 위치 1411에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q1411*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1720에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 틀 이동 돌연변이(frame shift mutation)(F1720fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G) 후의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1874에서 야생형 잔기 시스테인(C)에서의 틀 이동 돌연변이(C1874fs), 아미노산 위치 1957에서 야생형 잔기 아스파트산(D)의 글루탐산(E)으로의 치환(D1957E), 서열번호 11의 아미노산 위치 1430에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1430*), 서열번호 11의 아미노산 위치 1721에서 야생형 잔기 알기닌(R)에서의 틀 이동 돌연변이(R1721fs), 아미노산 위치 1255에서 야생형 잔기 글라이신(G)의 글루탐산(E)으로의 치환(G1255E), 서열번호 11의 아미노산 위치 284에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G284fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1722에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1722*), 서열번호 11의 아미노산 위치 274에서 야생형 잔기 메티오닌(M)에서의 틀 이동 돌연변이(M274fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1847에서 야생형 잔기 글라이신(G)에서의 틀 이동 돌연변이(G1847fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 559에서 야생형 잔기 P에서의 틀 이동 돌연변이(P559fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1276에서 야생형 잔기 알기닌(R)의 넌센스 돌연변이(R1276*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2176에서 야생형 잔기 글루타민(Q)에서의 틀 이동 돌연변이(Q2176fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 203에서 야생형 잔기 히스티딘(H)에서의 틀 이동 돌연변이(H203fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 591에서 야생형 잔기 알라닌(A)에서의 틀 이동 돌연변이(A591fs), 서열번호 11의 아미노산 위치 1322에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 넌센스 돌연변이(Q1322*), 서열번호 11의 아미노산 위치 2264에서 야생형 잔기 세린(S)의 넌센스 돌연변이(S2264*), 서열번호 11의 아미노산 위치 586에서 야생형 잔기 글루타민 (Q)의 넌센스 돌연변이(Q586*), 서열번호 11의 아미노산 위치 548에서의 틀 이동 돌연변이(Q548fs), 및 서열번호 11의 아미노산 위치 756에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)에서의 틀 이동 돌연변이(N756fs)로 이루어진 군으로부터 선택된 ARID1A의 돌연변이를 갖는, 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키기 위한 방법.
  9. 치료 또는 완화가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법으로서,
    a. 대상체로부터 얻은 샘플에서 신경분화 유전자, 세포주기 저해 유전자 및 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
    b. 단계 a에서의 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및
    c) 단계 b에서 선택된 대상체에게 EZH2 저해제의 유효량을 투여함으로써 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화시키는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  10. 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법으로서,
    a. 대상체로부터 얻은 샘플에서 헷지호그 경로 유전자, myc 경로 유전자 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
    b. 단계 (a)에서 적어도 하나의 유전자의 증가된 발현 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및
    c. 단계 (b)에서 선택한 대상체에게 본 발명의 화합물의 유효량을 투여함으로써 대상체에서 암 증상을 치료 또는 완화하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 및 비정형 유기형 간상 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 및 비정형 유기형 간상 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 신경분화 유전자는 CD133, DOCK4 또는 PTPRK인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 세포주기 저해 유전자는 CKDN1A 또는 CDKN2A인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 종양 억제 유전자는 BIN1인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 헷지호그 경로 유전자는 GLI1 또는 PTCH1인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 myc 경로 유전자는 MYC인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 유전자는 EZH2인, 치료가 필요한 대상체에서 SWI/SNF-연관 암의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법.
  19. 세포를 EZH2 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경분화, 세포주기 저해 또는 종양억제의 유도 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는 CD133, DOCK4,PTPRK, CKDN1A,CDKN2A 및 BIN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는데 충분한 양인, 신경분화, 세포주기 저해 또는 종양억제의 유도 방법.
  21. 세포를 EZH2 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경분화, 세포주기 저해 또는 종양억제의 유도 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는 GLI1 및/또는 PTCH1의 발현을 감소시키는데 충분한 양인, 헷지호그 신호처리의 저해 방법.
  23. 세포를 EZH2 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현의 유도 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는 신경분화, 세포주기 저해 및/또는 종양억제를 유도하는데 충분한 양인, 유전자 발현의 유도 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 유전자는 CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CKDN2A 및 BIN1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 발현의 유도 방법.
  26. 세포를 EZH2 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현의 저해 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는 헷지호그 신호처리를 저해하는데 충분한 양인, 유전자 발현의 저해 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 유전자는 GLI1 또는 PTCH1인, 유전자 발현의 저해 방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 SNF5, ARID1A, ATRX, 및/또는 상기 SWI/SNF 복합체의 성분의 기능상실을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 기능상실은 SNF5의 결실에 의해 야기되는 방법.
  31. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암은 수모세포종, 악성횡문근양종양 및 비정형 유기형 간상 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는,
    (A) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EZH2 저해제는,
    또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
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