CN105125482B - 葛根素注射液及质控方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葛根素注射液及质控方法。本发明葛根素注射液其每1ml中包含：葛根素10‑100mg、丙二醇400～600mg、和加至平衡体积的注射用水。本发明使用HPLC法检测所述葛根素注射液中有关物质，具有优异的方法学性能。

Description

葛根素注射液及质控方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种葛根素注射液，还涉及该葛根素注射液的质控方法，本发明方法可以有利地控制葛根素注射液。

背景技术

葛为多年生豆科缠绕藤本植物，侧蔓和须根多，但块根深生，呈纺锤形或长棒形，表皮为淡黄色，有皱褶，是主要食用和药用部分。葛根为野葛Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi或粉葛P.thomsomi Benth的干燥根。葛根作为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品，历代以来本草均有记载，味甘、辛、性平，具有解肌退热、生津、透疹、温阳止泻、提高机体免疫力等功能。目前，葛根广泛用于改善心脑血管、治疗感冒、糖尿病、腹泻等中药复方制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。葛根含有异黄酮类、三萜类、芳香类等活性成分。其中异黄酮类化合物是葛根的主要化学成分，而葛根素(Puerarin)是葛属植物的特有成分，亦为主要有效成分。葛根素的药理作用十分广泛，具有降血脂，抗炎，抗心律失常、对心肌缺血的保护作用、扩张冠状动脉血管、肾保护、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肝缺血再灌注损伤、抗酒精中枢抑制、调控骨代谢、降血糖、利尿、降低血压、防治高血压头晕、头痛、颈项疼痛等作用。葛根素的化学结构式如下式所示：

随着葛根素的药理作用的研究深入，葛根素的分离纯化也越来越受到人们的重视。目前葛根素纯化方法主要有：大孔吸附树脂法、柱层析、酸水解有机溶剂萃取法及金属离子络合法等。

现有的葛根素注射液多用丙二醇作为助溶剂，以期获得物理、化学稳定性满足临床要求的制剂产品。然而，在进行葛根素注射液质量控制时，不明原因引发的检测结果波动仍然需要克服。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种葛根素注射液，以及提供一种葛根素注射液的质控方法，期待这种方法能够有效地进行葛根素的质量控制。

因此，本发明的第一方面，提供了一种葛根素注射液，其中包括葛根素、丙二醇和注射用水。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其每1ml中包含：葛根素10-100mg、丙二醇400～600mg、和加至平衡体积的注射用水。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其每1ml中包含：葛根素25-75mg、丙二醇450～550mg、和加至平衡体积的注射用水。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其每1ml中包含：葛根素25-50mg、丙二醇450～550mg、和加至平衡体积的注射用水。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其中还任选地包括药用辅料。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其中所述药用辅料是选自下列的一种或多种：增溶剂、抗氧剂、酸碱调节剂、溶剂、渗透压调节剂等。当添加它们时，这些药用辅料通常地以其常规添加浓度加入注射液中。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其中所述药用辅料是选自下列的一种或多种：亚硫酸氢钠(例如其在注射液中的浓度为0-2mg/ml，例如0.1-2mg/ml)、氯化钠(例如其在注射液中的浓度为0-15mg/ml，例如5-15mg/ml)、碳酸钠(例如其在注射液中的浓度为0-10mg/ml，例如5-10mg/ml)、吐温(例如吐温80，例如其在注射液中的浓度为0-5mg/ml，例如1-5mg/ml)、乙醇(例如其在注射液中的浓度为0-200mg/ml，例如50-150mg/ml)、氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸，例如其在注射液中的浓度为0-2mg/ml，例如0.1-1mg/ml)等。

根据本发明第一方面的葛根素注射液，其pH在3.0～6.0范围内，优选其pH在3.5～5.5范围内。

进一步地，本发明第二方面提供了检测葛根素注射液例如本发明第一方面任一实施方案所述葛根素注射液的方法，特别是提供了使用HPLC法检测葛根素注射液中有关物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取注射液适量，用溶剂[甲醇-0.1％有机酸溶液(25：75)]稀释制成每1ml中约含葛根素0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含葛根素5ug的溶液，作为对照溶液；另取葛根素和咖啡因对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含葛根素50ug和咖啡因150ug的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)照中国药典2010年版二部附录VD所载高效液相色谱法的规范试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为250mm×4.6mm×5um；检测波长为250mn；

(3)以0.1％有机酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；取系统适用性试验溶液10ul，注入液相色谱仪，葛根素峰的保留时间约为14分钟，葛根素峰与咖啡因峰的分离度应大于4.0，理论板数按葛根素峰计算不低于5000；

(4)取葛根素对照品20mg，置20ml顶空瓶中，加水10ml，水浴加热使溶解，密封，于121℃高压蒸汽破坏20分钟，放冷，量取5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，取10ul，注入液相色谱仪，在主峰后应有两个明显的色谱峰，相对于葛根素峰的相对保留时间分别约为2.0和2.2，二者分别记为杂质I和杂质II；

(5)取对照溶液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按下式计算供试品溶液色谱图中单个杂质色谱峰含量：

在相对保留时间分别约为2.0和2.2处的杂质I和杂质II色谱峰的色谱含量亦按上式计算。

根据本发明第二方面的方法，其中用于配制溶剂和流动相的所述有机酸选自枸橼酸、酒石酸、苹果酸、马来酸，优选的有机酸是酒石酸。

根据本发明第二方面的方法，其中杂质I和杂质II二者的分离度大于1.5，优选的分离度大于1.8，优选的分离度大于2.0。众所周知，分离度，以R表示，是指相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度，R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》对于一般的品种均规定R应大于1.5甚至应大于2，但是对于难以分离的情形可能会适当降低标准。

杂质I和杂质II是葛根素的两种明显且重要杂质，并且随着注射液贮藏时间的延长它们会有不同程度的增加。对它们进行监控是极其有必要的。然而由于两种物质在色谱图中的分离度较小，这常常会为产品的质量监控带来不利影响。在本发明中，已经出人意料地发现，使用特殊的有机酸可以获得杂质I和杂质II色谱峰优异分离效果，具体地说：使用下文实施例7的方法测定实施例1-6所得全部注射液以及葛根素原料药中杂质I和杂质II含量，并以杂质I和杂质II之间的分离度R作为分析方法的评价指标；实施例7步骤(1)和(3)所述有机酸为酒石酸时，测得实施例1-6全部注射液和葛根素原料药的R值均在2.1～2.6范围内；实施例7步骤(1)和(3)所述有机酸为枸橼酸时，测得实施例1-5全部注射液的R值均在1.2～1.4范围内，实施例6全部注射液和葛根素原料药的R值均在1.7～2.0范围内；实施例7步骤(1)和(3)所述有机酸为苹果酸或马来酸时，测得实施例1-5全部注射液的R值均在1.1～1.4范围内，实施例6全部注射液和葛根素原料药的R值均在1.7～1.9范围内；这表明，当使用枸橼酸或苹果酸或马来酸时虽然测定不含丙二醇的注射液或原料药可以实现R大于1.5的常规要求，但是却难以实现对含有丙二醇的注射液优异分析效能的要求；出人意料的是，当使用酒石酸作为溶剂或流动相中的有机酸时，对各种试样特别是含有丙二醇的注射液均能实现优异的分离分析效果。另外，采用实施例7步骤(1)和(3)所述有机酸为酒石酸，对实施例1-5全部注射液以及所用原料药葛根素进行有关物质检测，结果显示五个注射液和原料药中的杂质I含量均在0.21～0.24％范围内，杂质II含量均在0.18～0.23％范围内，各注射液中杂质I和杂质II含量与原料药均无明显差异。

在本发明上述方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，如未另外说明，使用到的试剂和原料均是从市场上购得。

在本发明中，如未另外说明，使用到的丙二醇是指1,2-丙二醇。

葛根素是由豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一种黄酮苷。葛根素对肝脏系统的影响：葛根素含有皂苷类化合物，对肝组织免疫损害具有保护作用，C-29位羟基和C-5”含氧基团可增强保肝活性。葛根素通过胃吸收可保护肝损伤，诱导活化肝星状细胞凋亡，有效逆转化学诱导的肝纤维化，对四氯化碳诱导的急性肝损伤也具有保护作用，同时具有多方面的生理活性。葛根素对心血管系统的影响：葛根中的总黄酮能增加脑及冠状动脉的血流量。葛根素对动物和人体的脑循环以及外周循环有明显的促进作用。葛根总黄酮在改善高血压及冠心病患者的脑血管张力、弹性和博动性供应等方面均有温和的促进作用。葛根素不仅改善人体的正常脑微循环，而且对微循环障碍也有明显的改善作用，主要表现为局部微血管血流和运动的幅度增加。葛根素对突发性耳聋患者的甲皱微循环也有改善作用，能加快微血管血流速度，清除血管袢淤血，提高患者的听力。葛根素对缺氧心肌具有保护作用，葛根素能明显降低缺血心肌的耗氧量，保护心脏免受缺血再港灌注所致的超微结构损伤。

动物试验表明：(1)对平滑肌的影响：葛根中的多种总黄酮化合物有舒张平滑肌的作用，而收缩成分则可能为胆碱、乙酰胆碱和卡塞因R等物质；(2)对体温的影响：兔耳静脉注射过期伤寒菌苗人工发热，口服20％葛根煎剂或20％乙醇浸剂后，体温降低，浸剂作用尤为明显；(3)对心血管系统的影响：葛根对正常和高血压的动物有一定的降压作用。葛根总黄酮和葛根素有明显的扩张冠状动脉作用，可使正常和痉挛状态的冠状动脉扩张，于静脉注射30mg/kg后，冠脉血流量可增加40％，血管阻力降低29％。葛根素还可抑制凝血酶诱导的血小板中5-HT释放。

毒理方面：(1)葛根的酒浸膏、水溶性提取物、总黄酮和卡塞因R静脉注射的LD50(小鼠)分别为2.1±1.0，1.044、1.6～2.1和0.0375g/kg，静脉注射1g/kg葛根素不致小鼠死亡，小鼠腹腔注射0.8g/kg黄豆甙元无中毒症状；(2)小鼠每天口服酒浸膏10和20g/kg共3天，或一次口服黄豆甙元1和5g/kg，未见中毒症状。每天口服酒浸膏1g/kg或黄豆甙元25mg、50mg和100mg/kg连续2个月，狗每天口服酒浸膏2g/kg，连续14天，或黄豆甙元25和50mg/kg，连续2个月，不影响动物的行为，血常规、肝、肾功能及心、肝、脾、肺、肾等实质器官也无改变。

药代动力学方面，动物实验表明，随着给药剂量的增加(35→75→370mg/kg)，药物的消除半衰期明显降低(11.8→10.4→4.7小时)。体内分布以肝、肾、心脏和血浆中较多，睾丸、肌肉、脾脏次之，并可通过血-脑脊液屏障进入中枢。本品消除较快，在体内不易蓄积。随着给药剂量的增加，药物的消除半衰期(Ti/2&szlig；)依次降低为(11.80,10.37,4.6hr)，分布半衰期依次增加为(0.53,0.64,0.67hr)，可通过血脑屏障，血浆蛋白结合率达24.60％。分别从尿。大便、胆汁中排泄。在体内分布广，消除快，不易积蓄。毒性低，无明显副作用。小鼠静脉注射葛根素，LD为634.3mg/kg，腹腔注射LD为1412.2mg/kg。大鼠腹腔注射葛根素150,100,50mg/kg连续5周，无积蓄性毒性，对心、肝、肺、脾、肾、肾上腺及肠等脏器无明显毒性。犬静脉注射葛根素，每日50,30,15mg/kg连续5周，再观察70天，对大小便常规、血常规、SGPT,BUN、血糖均无明显影响。健康成年SD大鼠实验，剂量为50,150mg/kg，对雌性大鼠胚胎及雄性大鼠生殖细胞均无致畸作用。致突变试验表明，葛根素没有潜在的致癌和致突变危险性。

本发明的积极进步效果在于：本发明的方法可以有效的用于葛根素注射液特别是包含丙二醇的葛根素注射液的分析和质量监控，方法效能明显比现有技术高，具有良好的市场应用前景。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明方案。下面在配制葛根素注射液时使用同一批次的葛根素原料药。在下面配制葛根素注射液时，以每1ml的量列明处方，但是在实际投料时，每一批次物料量为5000ml的量。

实施例1：配制葛根素注射液

配方：

葛根素50mg，

丙二醇500mg，

注射用水，适量，加至1ml。

制备方法：将葛根素加至丙二醇中，加入约200mg水，超声波使葛根素溶解，加水至全量，即得。所得注射液经测定，pH在3.5～5.5范围内。

实施例2：配制葛根素注射液

配方：

葛根素25mg，

丙二醇450mg，

注射用水，适量，加至1ml。

制备方法：将葛根素加至丙二醇中，加入约100mg水，超声波使葛根素溶解，加水至全量，即得。所得注射液经测定，pH在3.5～5.5范围内。

实施例3：配制葛根素注射液

配方：

葛根素25mg，

丙二醇550mg，

注射用水，适量，加至1ml。

制备方法：将葛根素加至丙二醇中，加入约100mg水，超声波使葛根素溶解，加水至全量，即得。所得注射液经测定，pH在3.5～5.5范围内。

实施例4：配制葛根素注射液

配方：

葛根素25mg，

丙二醇500mg，

亚硫酸氢钠1mg，

氯化钠10mg，

碳酸钠7.5mg，

注射用水，适量，加至1ml。

制备方法：将葛根素加至丙二醇中，加入约200mg水，超声波使葛根素溶解，加入其它物料使溶解，加水至全量，必要时用1M盐酸或1氢氧化钠调节溶液的，即得pH在3.5～5.5范围内。

实施例5：配制葛根素注射液

配方：

葛根素50mg,

谷氨酸0.5mg,

丙二醇0.5ml,

吐温-802mg,

95％乙醇0.1ml,

注射用水，适量，加至1ml。

制备方法：将葛根素加至丙二醇中，加入约200mg水，超声波使葛根素溶解，加入其它物料使溶解，加水至全量，必要时用1M盐酸或1氢氧化钠调节溶液的，即得pH在3.5～5.5范围内。

实施例6：配制葛根素注射液

参照实施例1-5的配方和制法，不同的仅是不添加丙二醇而用水代替，必要时对终溶液过滤，制得五种注射液，分别记为#61、#62、#63、#64、#65，这五个样品由于未加丙二醇，不能达到完全溶解的程度或者在凉暗处放置5天后即有沉淀出现，因此不加丙二醇是不可取的。

实施例7：葛根素注射液中有关物质的分析方法

使用HPLC法检测葛根素注射液中有关物质，特别是杂质I和杂质II的含量，该方法包括以下步骤：

(1)取注射液适量，用溶剂[甲醇-0.1％有机酸溶液(25：75)]稀释制成每1ml中约含葛根素0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含葛根素5ug的溶液，作为对照溶液；另取葛根素和咖啡因对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含葛根素50ug和咖啡因150ug的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)照中国药典2010年版二部附录VD所载高效液相色谱法的规范试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为250mm×4.6mm×5um；检测波长为250mn；

(3)以0.1％有机酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；取系统适用性试验溶液10ul，注入液相色谱仪，葛根素峰的保留时间约为14分钟，葛根素峰与咖啡因峰的分离度应大于4.0，理论板数按葛根素峰计算不低于5000；

(4)取葛根素对照品20mg，置20ml顶空瓶中，加水10ml，水浴加热使溶解，密封，于121℃高压蒸汽破坏20分钟，放冷，量取5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，取10ul，注入液相色谱仪，在主峰后应有两个明显的色谱峰，相对于葛根素峰的相对保留时间分别约为2.0和2.2，二者分别记为杂质I和杂质II；

(5)取对照溶液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按下式计算供试品溶液色谱图中单个杂质色谱峰含量：

在相对保留时间分别约为2.0和2.2处的杂质I和杂质II色谱峰的色谱含量亦按上式计算。

Claims (6)

1.使用HPLC法检测葛根素注射液中有关物质的方法，所述葛根素注射液包括葛根素50mg、谷氨酸0.5mg、丙二醇0.5ml、吐温-80 2mg、95%乙醇0.1ml、注射用水适量加至1ml；该方法包括以下步骤：

(1)取注射液适量，用溶剂[甲醇-0.1%有机酸溶液(25：75)]稀释制成每1ml中含葛根素0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中含葛根素5ug的溶液，作为对照溶液；另取葛根素和咖啡因对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含葛根素50ug和咖啡因150ug的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)照中国药典2010年版二部附录VD所载高效液相色谱法的规范试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为250mm×4.6mm×5um；检测波长为250mn；

(3)以0.1%有机酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；取系统适用性试验溶液10ul，注入液相色谱仪，葛根素峰的保留时间为14分钟，葛根素峰与咖啡因峰的分离度应大于4.0，理论板数按葛根素峰计算不低于5000；

(4)取葛根素对照品20mg，置20ml顶空瓶中，加水10ml，水浴加热使溶解，密封，于121°C高压蒸汽破坏20分钟，放冷，量取5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，取10ul，注入液相色谱仪，在主峰后应有两个明显的色谱峰，相对于葛根素峰的相对保留时间分别为2.0和2.2，二者分别记为杂质I和杂质II；

(5)取对照溶液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按下式计算供试品溶液色谱图中单个杂质色谱峰含量：

；

在相对保留时间分别为2.0和2.2处的杂质I和杂质II色谱峰的色谱含量亦按上式计算，

其中，步骤(1)中所述溶剂是甲醇-0.1%有机酸溶液以体积比25：75制得的混合液，步骤(1)和步骤(3)中所述有机酸是酒石酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述葛根素注射液的pH在3.0~6.0范围内。

3.根据权利要求1的方法，其中所述葛根素注射液的pH在3.5~5.5范围内。

4.根据权利要求1的方法，其中杂质I和杂质II二者的分离度大于1.5。

5.根据权利要求1的方法，其中杂质I和杂质II二者的分离度大于1.8。

6.根据权利要求1的方法，其中杂质I和杂质II二者的分离度大于2.0。