CN105111180A - 从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然产物提取领域，具体公开一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：皂刺粉末采用低醇冷浸提取浓缩，得到的低醇浸膏萃取，并将剩余水相浓缩，得上料样品；上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，并将馏分浓缩，得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法分离纯化得到馏分段1-30；将馏分段2采用硅胶柱色谱法分离纯化，得到化合物Ⅰ；馏分段13-15析出固体得到化合物Ⅱ；馏分段9析出固体经重结晶得到化合物Ⅲ。本发明采用低醇冷浸提取，结合色谱法以及特定比例的溶剂和参数，能够保证皂角刺中含氧化合物如醚类、酮类和内酯类等不稳定活性成分被有效的提取分离出来，不会造成化学键断裂或结构的变化。

Description

从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取分离技术领域，主要涉及一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法。
背景技术
皂刺，又名皂角刺（Spinagleditsiae）是双子叶豆科皂角属植物皂荚（GleditsiasinensisLam.）的干燥棘刺。多年生灌木，为我国民间传统的中药材，药书《本草纲目》记载皂角刺具有消肿解毒、化脓杀虫的功效，广泛分布在我国江苏、湖北、河南、河北、四川及东北等地区，一直以来皂角刺在中国、日本和韩国等东南亚地区，广泛用于治疗中风、头疼、哮喘和疥疮等各种疾病。现代药理研究发现皂角刺还具有一定的抗菌、抗癌的功效。据文献报道皂角刺中主要化学成分为黄酮、皂苷、酚类、三萜、氨基酸、木质素及糖类等。尽管如此，皂角刺药用物质基础的研究仍然有待深入的研究，尤其随着现代分离手段和分析测试技术的快速发展，一些微量的活性物质和成份仍在不断地被探索和揭示。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，该方法能够保证皂角刺中的醚和内酯等化学不稳定活性成分被有效的提取分离出来，不会发生化学键断裂或结构的变化。
本发明所采用的技术方案是：一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为50-65%的乙醇溶液中，室温下浸泡3-5d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作2-3次，合并提取液，备用；然后将提取液在0-4℃条件下静置18-26h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量7-10倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样、梯度洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ；
所述化合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构式依次为：
。
进一步优化，步骤三所述的大孔树脂柱色谱法依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱。
进一步优化，步骤四所述的硅胶柱色谱法上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱。
进一步优化，步骤五的硅胶柱色谱法中，拌样硅胶粒径为100-200目，装柱硅胶粒径为200-300目。
进一步优化，步骤七过滤得到的固体采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶。
与现有技术相比，本发明至少具有下述优点及有益效果：
本发明提供的方法首次从皂角刺中提取出新的环烯醚萜化合物即化合物Ⅰ，并首次发现并提取了化合物Ⅱ和Ⅲ，基于化学结构，这三种成分属于醚类、内酯类和氧苷类，都具有相对的化学不稳定性，尤其是在空气中就可能分解。本发明采用50-65%的低醇在室温提取的方法，能够保证皂角刺中含氧化合物如醚类、酮类和内酯类化合物不发生分解。本发明用低醇冷浸提取，结合色谱法以及其中特定比例的溶剂和参数，使所分离得到的皂角刺中的环烯醚萜类和香豆素内酯结构等不稳定活性成分被有效的提取分离出来，不会因提取方法的影响发生化学键断裂或结构的变化。本发明研究聚焦在皂角刺低醇提取物的有效成分的分离与纯化，为将来系统筛选并深入研究皂角刺中化学成分的生物活性提供极具科学理论的研究基础和重要开发前景。
具体实施方式
一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为50-65%的乙醇溶液中，室温下浸泡3-5d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作2-3次，合并提取液，备用；然后将提取液在0-4℃条件下静置18-26h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量7-10倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，其中拌样硅胶粒径为100-200目，装柱硅胶粒径为200-300目，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ；
所述化合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构式依次为：
。
本发明分离得到的化合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构鉴定
本发明分离的3个化合物经过2DNMR分析和化学分析鉴定，并对比相关参考文献进行结构鉴定和表征，上述3个化合物的NMR数据详细归属分别如下：
化合物Ⅰ：黄色胶状透明物。1H-NMR(400MHz,DMSO)数据显示：:0.83（d,6H）,0.87(d,6H),1.03-1.05(m,mH),2.02(s,3H),2.04(s,1H,H-5),2.52(m,1H,H-6),2.14(m,1H,H-9).其中13C-NMR（DEPT）(100MHz,DMSO)数据归属如表1所示，该化合物被推断为7,8-[双二环单贴]-4-羧-1,6-二羟环烯醚单萜，是首次从皂角刺中分离得到的新的环烯醚萜类化合物（数据归属参考文献QuangDN,HashimotoT,TanakaM.etal.Phytochmistry,2002,60,505.）。
表1.化合物Ⅰ的1HNMR和13CNMR数据归属
化合物Ⅱ：淡黄色粉末（DMSO）。其1H-NMR(400MHz,DMSO)和13C-NMR(100MHz,DMSO)数据归属如表2所示，以下数据与文献（ZhouLG,LiD,GouJ,eta1.AntibacterialphenoliccompoundsfromthespinesofGleditsiasinensisLam.[J].Naturalproductresearch,2007,21:283-291）报道基本一致，故鉴定化合物为8-O-葡萄糖基-5,4′,7-三羟基黄酮，该化合物为活性黄酮苷化合物，也是首次从皂角刺植物中提取的化合物。
表2.化合物Ⅱ的1HNMR和13CNMR数据鉴定归属*
化合物Ⅲ：浅黄色固体（MeOH）。1H-NMR(400MHz,MeOD):7.86(1H,d,J=9.44,H-3),6.20(1H,d,J=9.44,H-4),7.11(1H,s,H-5),6.77(1H,s,H-3’),3.89(3H,s,-OCH3),3.85(1H,s,-OH);13C-NMR(100MHz,MeOD)161.1(C-2),112.9(C-3),147.8(C-4),116.6(C-5),110.1(C-6),151.2(C-7),145.9(C-8),152.1(C-9),105.2(C-10),148.0(C-2’),112.0(C-3’),56.4(-OCH3)。以上数据与文献（HarkerS,RazdanTK,WaightE.Setal.Steroids,chromoneandcoumarinsfromangelicaofficinalis,Phytochemistry,1984,23(2):419-426.）中报道的基本一致，故鉴定化合物Ⅲ为2’-羟基-8-甲氧基呋喃香豆素，也是首次从皂角刺植物中提取的化合物。
为使本发明的内容更明显易懂，以下结合具体实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：
一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为50%的乙醇溶液中，室温下浸泡3d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作2次，合并提取液，备用；然后将提取液在0℃条件下静置18h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量7倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，其中拌样硅胶粒径为100目，装柱硅胶粒径为200目，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ。
实施例2：
一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为65%的乙醇溶液中，室温下浸泡5d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作3次，合并提取液，备用；然后将提取液在4℃条件下静置26h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量10倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，其中拌样硅胶粒径为200目，装柱硅胶粒径为300目，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ。
实施例3：
一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为60%的乙醇溶液中，室温下浸泡4d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作3次，合并提取液，备用；然后将提取液在0-4℃条件下静置22h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量9倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，其中拌样硅胶粒径为100目，装柱硅胶粒径为200目，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ。

Claims (6)

1.一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、取皂刺原材料，在室温下阴干后粉碎，得到皂刺粉末，备用；
步骤二、将步骤一得到的皂刺粉末加入到体积百分比为50-65%的乙醇溶液中，室温下浸泡3-5d，浸泡结束后分离得到提取液，再重复浸泡和分离操作2-3次，合并提取液，备用；然后将提取液在0-4℃条件下静置18-26h，静置结束后过滤，并将滤液减压浓缩，得到低醇浸膏，备用；
步骤三、向步骤二得到的低醇浸膏中加入其重量7-10倍的水，搅拌使低醇浸膏溶解完全，得到混合溶液，备用；然后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到剩余水相，再将剩余水相减压浓缩，得到上料样品，备用；将上料样品采用大孔树脂柱色谱法进行分离，上样后采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积百分比为50-60%乙醇溶液的馏分，并将该馏分浓缩，得到浓缩浸膏，备用；
步骤四、将步骤三得到的浓缩浸膏采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样、梯度洗脱，洗脱得到的馏分经TLC检测、合并，得到馏分段1-30，备用；
步骤五、将步骤四得到的馏分段2采用硅胶柱色谱法进行分离纯化，上样后依次用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1和1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱剂的体积比为10:1的馏分段，浓缩得到黄色胶状透明物，即为化合物Ⅰ；
步骤六、步骤四得到的馏分段13-15，均有固体析出，合并、过滤，得到的固体进一步采用凝胶色谱法进行等度洗脱纯化，纯化的流动相为体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇溶液，流速为6-7滴/min，得到的馏分经减压浓缩，得到淡黄色粉末，即化合物Ⅱ；
步骤七、步骤四得到的馏分段9有固体析出，过滤后进行重结晶，得到浅黄色固体，即化合物Ⅲ；
所述化合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构式依次为：
。
2.如权利要求1所述的一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：步骤三所述的大孔树脂柱色谱法依次采用体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液进行梯度洗脱。
3.如权利要求1所述的一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：步骤四所述的硅胶柱色谱法上样后依次用体积比为1:0、10:1、9:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5和0:1的乙酸乙酯-甲醇溶液以及体积比为7:3的甲醇水溶液进行洗脱。
4.如权利要求1所述的一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：步骤五的硅胶柱色谱法中，拌样硅胶粒径为100-200目，装柱硅胶粒径为200-300目。
5.如权利要求1所述的一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：步骤七过滤得到的固体采用氯仿和甲醇溶剂进行重结晶。
6.如权利要求1所述的一种从低醇皂刺中提取新环烯醚萜化合物和其他化合物的方法，其特征在于：步骤二所述的皂刺粉末加入到体积百分比为60%的乙醇溶液中。
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