CN105074434A - 用于确定介质中的荧光物质浓度的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于确定介质中的荧光物质的浓度(c)的方法和设备(1)，其中，将具有激发波长(λex)的激发辐射辐射通过具有荧光物质的介质，使荧光物质以这样的方式激发，使得荧光物质发射具有荧光波长(λem)的荧光辐射，其中对荧光的强度(Ifluor)进行测量，介质中的荧光物质的浓度(c)根据荧光辐射的强度确定，其中，另外对激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)进行测量，其中荧光物质的浓度(c)根据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)以及荧光的强度(Ifluor)确定。
Description
技术领域
本发明涉及用于确定介质中的荧光物质的浓度的方法，其中，将具有激发波长的激发辐射辐射通过具有荧光物质的介质，从而使荧光物质以这样的方式被激发，使得荧光物质发射具有荧光波长的荧光辐射，其中对荧光辐射的强度进行测量，而介质中的荧光物质的浓度根据测量的荧光辐射的强度而确定。
另外，本发明还涉及用于确定介质中的荧光物质的浓度的设备，该设备至少包括：第一辐射源，其用于发射具有激发波长的激发辐射；第一传感器，其用于测量由激发辐射激发并具有荧光波长的荧光辐射的强度；以及计算单元，其用于依据荧光辐射的强度来确定荧光物质的浓度。
背景技术
在现有技术中已知用于确定介质中的荧光物质的存在的方法，其中，对荧光物质进行特定激发，以通过激发辐射来发射荧光辐射。对荧光辐射的强度进行测量，以便依据测量结果来推导出荧光物质的存在。但是，因为仅在很少的情况下才可以由荧光辐射的强度推导出荧光物质的浓度，所以一般不认为这样的荧光测量是可靠的定量测量方法。例如在免疫学中，抗体设置有荧光化学基团，因此可以借助于荧光来识别抗体结合的位点。以这种方式还能够进行对抗原的浓度的部分定量确定。
无论如何，实践观察显示，通常无法在通过对荧光进行测量而进行浓度的确定中获得所需的精度。例如，已经观察到，测量室的几何形状对测量精度有影响。在变化的时间条件下，也无法通过已知方法获得令人满意的结果。目前，该问题尚未得到解决。
发明内容
因此，本发明的目标为，创建之前所提及类型的能够对荧光物质的浓度进行高度精确确定的方法和设备。具体而言，需要降低和/或消除测量室的几何形状对于测量精度的影响。另外，即使在变化的时间条件下，也应当能够精确地进行浓度的确定。
为实现根据本发明的目标，对激发辐射的透射部分的强度也进行测量，而荧光物质的浓度根据激发辐射的透射部分的强度以及荧光辐射的强度来确定。
有益地，不仅如同之前的情况测量荧光，而且还考虑到，在具有荧光物质的样本中的激发光的吸收也对测量到的荧光辐射的强度有影响。吸收对于浓度的确定的影响力度会特别地取决于光在样本中传播的距离。因此，吸收的影响主要取决于测量室的几何形状。因为在之前所使用的测量荧光的方法中并没有考虑到这些影响，所以这样不能根据测量到的荧光强度来推导样本中荧光物质的浓度。相反，根据本发明的方法可以用作确定荧光物质的浓度的高度精确的定量方法。已经观察到，在用于确定荧光物质的浓度的方法中，吸收与荧光成比例地增加。这意味着，对荧光进行测量所需的激发光越多地穿透样本介质，其减弱越大，因此得到的荧光信号衰减。另外，在未知样本中事实上经常出现与荧光或引起荧光的物质的浓度没有因果联系的在样本中激发光的吸收。结果，单独对荧光进行测量包含了系统中固有的误差，而该误差不能通过来自荧光的测量的信息而校正。根据本发明，该误差通过对激发辐射的透射部分进行测量而消除，所述激发辐射的透射部分给出了关于激发辐射在穿过测量体积时的吸收的信息。于是，荧光物质的浓度基于荧光以及激发辐射的透射而得到确定。如果样本的浑浊和/或其他原因引起的(例如，添加反应化学成分引起的)激发辐射的吸收增加，导致穿透介质的激发辐射减弱并随后导致荧光信号衰减，则该方法会尤其有益。当单独测量荧光时，不能从较低的荧光中区分出信号的变化，因此在确定浓度时获得了不精确和/或不正确的结果。与此不同的是，同时对吸收和荧光进行测量的益处在于，激发辐射的透射部分可以用于修正由激发辐射在样本中的吸收引起的非线性和不正确的测量。这在例如需要考虑容纳样本的测量室的不同的几何形状时是有益的。另外，在添加反应化学成分(尤其是基质)之后，可以根据吸收与荧光之间的关系而表明关于所添加的反应化学成分的定性状态。本发明的另一益处在于，在较长的测量过程中，可以高精度地区分浓度的变化和样本的透光率的变化。在此尤其优选的是，在具有荧光物质的介质的相同的体积单元同时对荧光的强度和激发辐射的透射的强度进行测量。如果样本是非均匀的或其状态随时间快速改变，则这会是尤其有益的。然而，对于稳定且均匀的样本(这样的样本同样大量存在)，可以在同一的设备或者在分开的测量设备中(还是在同一时间)中一个接着另一个地对荧光与激发辐射的透射进行交替测量。
根据特别地优选的实施方案，将具有荧光波长的荧光吸收辐射辐射通过具有荧光物质的介质，对荧光吸收辐射的透射部分的强度进行测量，并根据激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度以及荧光吸收辐射的透射部分的强度来确定荧光物质的浓度。在该实施方案中，在荧光波长穿过样本时样本的透射和/或吸收因而用作了用于确定荧光物质的浓度的进一步的输入参数。在此，对荧光吸收辐射的透射部分的测量在激发辐射关闭的情况下进行，所以在荧光波长穿过样本时样本的透射可以根据由激发辐射激发的荧光而独立确定。因此，在该实施方案中，荧光物质的浓度根据由荧光辐射和激发辐射的透射以及荧光吸收辐射构成的三元组的测量值确定。在此，激发辐射和/或荧光吸收辐射穿过具有荧光物质的介质时的透射作为校正值而增加至荧光信号。
为了获得更精确的测量结果，优选为对具有激发波长的散射光的强度也进行测量，并且荧光物质的浓度根据激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度、散射光的强度，以及(如果可用的话，即如果测量了的话)荧光吸收辐射的透射部分的强度来确定。对散射辐射的测量特别地通过第三辐射传感器进行，第三传感器优选为对激发波长敏感，并且/或在第三传感器的上游设置了具有中心波长λex的合适的带通滤波器。
为了浓度的高度精确测量，荧光物质的浓度优选为根据一组特征曲线而确定：该特征曲线的组指示根据激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度以及(如果可用的话的，即，如果测量了的话的)荧光吸收辐射的透射部分的强度和/或散射光的强度的荧光物质的浓度。该特征曲线的组可以经验性地获得。或者，可以使用将用于确定荧光物质的浓度的输入参数彼此关联的计算模型。
另外，对于某些应用场合有利的是，特征曲线的组还指示根据介质的pH和/或温度的荧光物质的浓度，因而获得相应地更高维度的一组特征曲线。
在此尤其有利的是，特征曲线的组是通过在确定荧光物质的浓度之前进行的测量方法而确定的，在该测量方法中，对于若干给定的荧光物质的校准浓度中的每一个，而对测量荧光辐射的强度、激发辐射的透射部分的强度以及(如果可用的话)荧光吸收辐射的透射部分的强度和/或散射光的强度进行测量。有益地，这能够确定荧光物质的浓度与的输入参数之间的明确的关系，所述关系对于测量设置是特定的，所述测量设置用于确定未知的荧光物质浓度。为提高分辨率，有利的是，以本身已知的方式，通过近似曲线来对特征曲线的组的测量点进行插值。如果考虑到散射光，则对于相同的吸收和变化的散射的进行数次测量流程。作为对这样的测量和/或校准方法的替选，也可以通过数学关系而获得浓度与单个测量参数之间的关系。
为了提高测量精度，有利的是，在测量激发辐射的透射部分的强度之前，在穿过具有荧光物质的介质之后对激发辐射的透射部分重定向。这样，可以以有益的方式避免当在辐射穿过具有荧光物质的介质的方向上对激发辐射的透射进行测量时可能出现的干扰。
之前提及类型的设备的特征在于，设置了用于测量激发辐射的透射部分的强度的第二传感器，并且具有设定用于根据激发辐射的透射部分的强度和荧光辐射的强度来确定荧光物质的浓度的计算单元。
该设备提供与之前讨论的方法相同的益处和技术效果，因此引用上述表述。优选地，计算单元具有存储了特征曲线的组的存储器，所述特征曲线的组包括荧光物质的浓度与激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度之间的关系，并且优选地包括荧光物质浓度与荧光吸收辐射的透射部分的强度之间的关系。
为了进一步提高浓度确定的精度，有利的是，设置用于使具有荧光波长的荧光吸收辐射穿过具有荧光物质的介质的第二辐射源。第二辐射源可以独立于第一辐射源地打开和/或关闭，从而可以在第二辐射源打开且第一辐射源关闭的状态下，确定荧光吸收辐射的透射部分的强度，即具有荧光波长的辐射在穿过介质时的吸收。
优选地，第一传感器设置为用于对荧光吸收辐射的透射部分的强度进行测量。或者，可以设置专用的第三传感器以用于对荧光吸收辐射的透射部分进行测量。第一传感器连接到计算单元，计算单元接收荧光的强度和荧光吸收辐射的强度作为(除了激发辐射的透射之外的)进一步的输入参数，以用于确定荧光物质的浓度。
另外，优选为，设置第三传感器以用于对散射光的强度进行测量。第三传感器连接到计算单元，计算单元接收散射光的强度作为进一步的输入参数，以用于确定荧光物质的浓度。
根据本发明的优选实施方案，用于对第一和第二辐射源分别进行校准的参考传感器关联于第一辐射源和/或第二辐射源。在优选实施方案中，例如通过借助于部分透光镜使一致百分比的激发光耦合出激发光的光路并且传至参考传感器，参考传感器对激发辐射的强度进行连续测量。在任意时刻，将该参考信号与测量(透射和荧光)信号进行比较。这样，测量信号始终相关于由参考传感器同时测量的激发光的强度。以有益地方式，这保证了激发光强度中的可能的波动不会对测量结果有所影响。
在优选的应用中，设置了测量室，特别是容纳槽，而用于容纳具有荧光物质的介质。优选地，具有荧光物质的介质呈现为液体样本。或者，可以在气态介质中确定荧光物质的浓度。在一些实施方案中，设置多个测量室是有利的，每个测量室适用于不同的荧光和/或激发波长，从而可以使用同一的设备来确定不同荧光物质的浓度。这里有利的是使用适用于各自波长的特征曲线的组，优选为借助于上述测量方法。
根据另一优选实施方案，将第一辐射源设置为用于发射具有多个激发波长的激发辐射，特别是具有大体上连续的激发谱的激发辐射。优选地，为此使用用于至少大体上连续的激发和/或荧光波长的波长范围的浓度的特征曲线的组，使得该方法可以扩展到在至少大体上连续的波长范围内的荧光物质的浓度的确定。为此目的，可以对于各个激发和/或荧光波长以窄频率间隔进行上述测量方法，从而获得用于所关心的波长范围的特征曲线的组。在该情况下，不需要如同在对单一的、大致分立的荧光和/或激发波长进行检测时所优选的那样将第一辐射源设置为发射单色激发辐射(或将第二辐射源设置为发射单色荧光吸收辐射)。而是，将第一辐射源设置为发射具有多个激发波长的激发辐射，特别是具有大体上连续的激发谱的激发辐射。在该实施方案中，第一和第二传感器以及(如果可用的话)参考传感器分别优选地设置为光谱分析仪。另外，在该实施方案中有利的是，省略用于发射荧光吸收辐射的第二辐射源和(如果可用的话)用于散射光的强度的传感器，因为通过它们所表示的信息已经包括在吸收和/或荧光谱中了。
为了避免使测量精度降低的干扰，在测量室与第二传感器之间设置用于使激发辐射的发射部分偏转的偏转镜是有利的。
优选地，偏转镜使激发辐射的透射部分偏转大体上90°。有益地，这可以大幅提高在测量激发辐射的透射时的精度。
为了将激发辐射耦合出去，将分束器(特别是频率选择分束器)设置为偏转镜是尤其有利的。优选地，该频率选择分束器设计为长通(即，在频率空间中的低通)，其不反射具有荧光波长的辐射而是使其通过。具体而言，该实施方案使得具有荧光波长且被第二传感器反射的辐射能够不通过测量室并随后回到第一传感器。同时，这可以防止具有荧光波长的辐射从测量室行进到第二传感器。因为透射辐射与荧光辐射的强度可以相差数个量级，所以这样做这是尤其重要的。第一传感器(荧光传感器)从而可以实质上比第二传感器(透射传感器)更敏感。优选地，用于发射荧光吸收辐射的第二辐射源也关联了偏转镜。在此同样是有利的是，分束器是频率选择的。优选地，频率选择分束器的阈值波长在激发波长与荧光波长之间。这特别地使得激发辐射的透射部分能够大体上完整地进入第二传感器。
附图说明
将在下文中通过在附图中示出的优选示例性实施方案对本发明进行更详细的讨论，但是本发明不限于这些实施方案。在附图中：
图1是根据本发明的用于确定介质中的荧光物质的浓度的设备的视图；
图2是用于确定荧光物质的浓度的设备的替选实施方案的视图；
图3是用于确定荧光物质的浓度的设备的另一实施方案的视图；
图4是用于确定荧光物质的浓度的设备的另一实施方案的视图；
图5是用于确定荧光物质的浓度的计算单元的示意图；
图6是示出激发的荧光和/或激发辐射的透射与介质的透光性之间的联系的图，其中示出了对于一致的校准浓度的不同的测量曲线；
图7是具有用于依据荧光和激发辐射的透射来确定荧光物质的浓度的一组特征曲线的示图；
图8是示出不归因于荧光物质的浓度的增加而归因于激发辐射的透射的增加的荧光信号增加的图。
具体实施方式
图1显示了用于确定容纳在测量室2中的介质中的荧光物质的浓度的设备1。在所示的实施方案中，将容纳槽设置为测量室2，具有荧光物质的液体样本容纳在其中。设备1包括第一辐射源3，第一辐射源3用于发射具有激发波长λex的激发辐射。另外，设置了第一传感器4，以用于测量由激发辐射激发的荧光辐射的强度Ifluor(简称：荧光)，荧光辐射具有相比于激发波长λex更大的荧光波长λem。如同本领域所公知的，荧光总具有比其激发光更大的波长，即更低的频率(和/或能量)。
如同图1进一步显示的，还设置了第二传感器5，以用于测量激发辐射的透射部分的强度Itrans,ex(简称：激发辐射的透射)。在对荧光辐射Ifluor的强度进行测量的同时对激发辐射的透射进行测量，激发辐射的透射与激发辐射穿过样本时的吸收间接地成比例。
另外，设置了计算单元6(参见图5)，以用于确定荧光物质的浓度c。在所示实施方案中，浓度c不仅依据荧光而且依据激发辐射的透射而确定。从而，首先，考虑到这样的荧光测量使浓度能够定量确定，则浓度测量的精度可以相对于仅考虑荧光信号的常规方法而显著提高。
如同图1进一步显示的，还设置了第二辐射源7，以用于使具有荧光波长的辐射(下文中称为荧光吸收辐射)穿过样本。在第一辐射源3关闭时，通过第一传感器3对荧光吸收辐射的透射部分的强度Itrans,em(简称：透射)进行测量。
如同图1进一步显示的，参考传感器9关联于第一辐射源3，而参考传感器10关联于第二辐射源7，从而分别使第一辐射源3和第二辐射源7能够校准。为此，一致的且相对低的百分比的激发光通过部分透光镜25而耦合出激发光的光路，并传到参考传感器9，以便连续地捕获激发辐射的强度。在任何时刻，激发辐射的透射和荧光(以及散射光的强度，如果可用的话，参见图3)参考于参考信号，以执行对测量信号的校准。相应地，对第二辐射源7设置了第二部分透光镜26，其用于将荧光吸收辐射的(相对较小的)一部分重新定向到参考传感器10中。这使得能够对于荧光吸收辐射而进行校准。
如同图1进一步显示的，所示实施方案中的设备1还具有偏转镜11，偏转镜11设置在测量室2与第二传感器5之间。从而，激发辐射的透射部分在离开测量室2后相对于穿过测量室的方向偏转。如此，偏转镜11导致激发辐射的透射部分相对于激发辐射穿过测量室2时的方向偏转大体上90°。在所示实施方案中，将分束器设置为偏转镜11，该分束器形成为具有在激发波长和荧光波长之间的阈值波长的频率选择，使得具有荧光波长的辐射不会被反射而是可以穿过。这防止了具有荧光波长并由第二传感器5反射的辐射穿过测量室到达第一传感器4，并防止了具有荧光波长的辐射由测量室2到达第二传感器5。
在所示的实施方案中，在参考传感器10、第二辐射源7和第二传感器5的每个的上游设置了(可选的)带通滤波器12。在参考传感器10，获得了荧光吸收辐射的强度的参考值，以便能够将荧光吸收辐射的强度中的可能的波动考虑在内。
如同图1进一步显示的，在第一辐射源3与测量室2之间设置了另外的偏转镜13，偏转镜13用于通过使激发辐射偏转大体上90°而将激发辐射耦合至测量室2。根据偏转镜11，将偏转镜13设计为具有在激发波长λex与荧光波长λem之间的阈值波长的频率选择分束器。第一传感器4设置为平行于穿过测量室2的方向，在偏转镜13面向远离测量室2的一侧。另外，在第一传感器4、参考传感器9和第一辐射源3的每个的上游设置了可选的带通滤波器14。带通滤波器12、14的可选使用特别地取决于传感器或辐射源的特性。
图2显示了用于确定荧光物质的浓度c的设备1的替选实施方案，下面仅对于与图1的差别进行描述。
根据图2，在第一辐射源3与测量室2之间设置了部分透光镜15，部分透光镜15用于将激发辐射的一部分耦合至测量室2中并/或将激发辐射的一部分传到参考传感器9。在参考传感器9，连续捕获对于激发辐射的强度的参考信号。可选地，在第一辐射源3的上游可以设置适用于激发波长的滤波器16。在用于捕捉激发辐射的透射的第二传感器5的上游设置了针对激发辐射λex的另外的滤波器16。类似的滤波器17(然而适用于荧光波长λem)关联于用于发射荧光吸收辐射的第二辐射源7和用于捕获荧光吸收辐射的透射和/或荧光的第一传感器4。
根据图2，在第二辐射源7与测量室2之间设置了另外的部分透光镜18，部分透光镜18用于将荧光吸收辐射的一部分耦合至测量室2中并/或将荧光吸收辐射的一部分传到参考传感器10。在参考传感器10，连续捕获用于荧光吸收辐射的强度的参考信号，而能够准确确定荧光吸收辐射的透射(并且据此确定荧光辐射在样本中的吸收)。
根据图2，特别地在相对于激发辐射的辐射方向成90°的角度测量荧光。与图1相反，在测量室2与第一传感器4之间的光路中和/或测量室2与第二传感器5之间的光路中没有设置分束器。
如同图3显示的，在该实施方案中，还通过第三传感器27而测量了具有激发波长λex的散射辐射的强度Istreu,ex，并将散射辐射的强度用于确定荧光物质的浓度。在第三传感器27的上游设置(可选的)带通滤波器12。此外，根据图3的设置与图1所示的实施方案的完全一致，而用于捕捉散射光的强度的第三传感器27当然也可以设置在根据图2的实施方案中。
根据图4，使用了具有宽的连续激发谱的第一辐射源3。这里，第一传感器4、第二传感器5和参考传感器9设计为光谱分析仪28、28'、28”。在该实施方案中，可以省略用于发射荧光吸收辐射的第二辐射源7和针对散射光的强度的第三传感器27。
如同图5显示的，计算单元6具有作为输入参数的荧光，激发辐射的透射，以及可选的荧光吸收辐射的透射和散射光的强度两者或之一。计算单元6具有存储器8，其中存储了用于根据输入参数来确定荧光物质的浓度c的一组特征曲线。作为计算单元6的输出参数，计算单元6给出所需的荧光物质的浓度c。
如同已经提及的，荧光物质的浓度由计算单元6根据测量参数确定，测量参数通过存储在存储器8中的一组特征曲线而关联。该特征曲线组可以在确定浓度之前进行的测量方法中确定，将在下文对所述测量方法进行描述。
根据图6，在对于限定的荧光物质浓度c1、c2的测量和/或校准的方法的第一步骤中，确定各个的测量曲线19，其中根据样本的透光性D确定荧光(测量曲线19')和激发辐射的透射(测量曲线19”)。样本的透光率D可以通过例如添加不透明物质而递增变化。这样，依据具有一致的荧光物质的浓度的样本的透光性和/或不透明性创建对于荧光(测量曲线19’)和/或透射(测量曲线19”)的测量曲线19。
如同图7显示的，下一步骤包括对荧光相对于激发辐射的透射进行绘图(测量曲线20)，其中每个测量曲线20代表某个校准浓度c1至c3。这样，在二维空间形成了一族曲线。取决于实施方式，还可以对依据样本的透光性的荧光吸收辐射的透射或散射光的强度进行测量。在该情况下，获得了三维空间中的一族面(未显示)，而不是图7的二维图。图(二维或三维的，取决于实施方式)中的每个点代表某个荧光物质浓度，从而获得测量参数与浓度c之间的明确的关系。
或者，可以将散射光和荧光吸收辐射两者都考虑在内，从而形成四维矩阵的状态，在该矩阵中，明确的荧光物质浓度c关联于四个参数(即，荧光、激发辐射的透射、荧光吸收辐射的透射以及散射辐射)的任意组合。
浓度的确定的精度可以依据测量曲线20的数量而提高。另外，还可以进行数学和/或数值插值，从而使测量值的二元组(和/或测量值的三元组或测量值的四元组，取决于实施方式)能够直接转换为想要知道的浓度c。
该方法的益处可以从图8中的示例性方式中显现，图8中示意性示出了在测量期间的荧光随时间的变化(信号21)。检测在液体样本上进行，在时间点22将缓冲物添加到液体样本中。之后添加基质，从而形成荧光物质(箭头23)。在添加了基质后，荧光信号由于基质的固有荧光而开始突然上升。之后，可以观察到荧光进一步随时间的增长，暗示荧光物质的浓度的上升。然而，对激发辐射的透射的测量(信号24)表明，一经引入缓冲物，因为样本中的缓冲物使得几乎没有光到达第二传感器5，所以透射开始突然下降。在此之后，样本的透光性随时间再次增加，因而激发辐射的透射增加。与此同时，用于荧光的激发信号的强度增加，并且因而荧光信号也增加。因此，所设想的荧光的上升并不基于荧光物质的浓度的改变，而是基于激发辐射的透射的增加。
上述方法可以用于确定不同类型的荧光物质的浓度。
这里，物质的荧光的强度会取决于测量时的pH和温度。即使在没有限定的pH或没有限定的温度的情况下，所述的发明也能够提高荧光测量的精度。然而，为了能够确定样本中的物质的浓度，测量的样本在校准期间应当具有相同的pH和相同的温度。这通过添加限定的量的缓冲物以及测量装置的准确温度控制而得到保证。或者，可以将特征曲线的组扩展为包括参数pH和/或温度，从而获得具有相应更大数量的维度的特征曲线的组。这样的特征曲线组具有四个维度(当仅考虑激发辐射的透射部分的强度Itrans,ex和荧光辐射的强度Ifluor时)或五个或六个维度(当还考虑荧光吸收辐射的透射部分的强度Itrans,em和/或散射光的强度Istreu,ex时)。
作为上述方法的示例，下文描述了对于水体中的荧光素钠的浓度的确定。
荧光素钠用作用来检测地下水流的荧光示踪剂。荧光素钠的理想激发波长是491nm；最大荧光辐射是516nm。为了确定样本中的荧光素浓度，首先，测量装置通过建立如上所述的一组特征曲线而进行校准。为此，对参考溶液一个接一个地进行测定，其中的每个参考溶液具有限定的荧光素浓度和通过缓冲剂溶液设定的一致的pH值，例如pH7。这些参考溶液在一致的温度(例如25℃)下进行测定。在校准过程中，在连续添加增加诸如福尔马肼的不透明物质的浓度的同时，对每个参考溶液进行反复测量。在一致的荧光素浓度和并行增加的福尔马肼的浓度下，对荧光的强度、透射的强度以及(如果可用的话)散射光的强度和荧光吸收辐射的强度的测量值的各自的组合进行记录。对于不同的荧光素浓度重复该过程，以便获得足够致密的特征曲线的组，从而能够充分地绘出通过插值或数学计算而覆盖的整个浓度范围。
在完成校准之后，测量装置已准备好使用。现在，将设置有限定的量的用于设定pH值的缓冲剂的任意样本置于测量装置中，以确定荧光、透射以及(如果可用的话)散射光和荧光吸收辐射的强度的值。使用该测量数据的组，荧光素的实际浓度根据特征曲线的组而确定。
Claims (17)
1.一种用于确定介质中的荧光物质的浓度(c)的方法，其中将具有激发波长(λex)的激发辐射辐射通过具有荧光物质的介质，使荧光物质以这样的方式激发，使得荧光物质发射具有荧光波长(λem)的荧光辐射，其中对荧光辐射的强度(Ifluor)进行测量，介质中的荧光物质的浓度(c)根据荧光辐射的强度确定，所述方法的特征在于，另外对激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)进行测量，其中荧光物质的浓度(c)根据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)以及荧光辐射的强度(Ifluor)确定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，另外将具有荧光波长(λem)的荧光吸收辐射辐射通过具有荧光物质的介质，对荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)进行测量，而根据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)、荧光辐射的强度(Ifluor)以及荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)来确定荧光物质的浓度(c)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，对具有激发波长(λex)的散射光的强度(Istreu,ex)也进行测量，而荧光物质的浓度(c)根据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)、荧光辐射的强度(Ifluor)和散射光的强度(Istreu,ex)以及在荧光吸收辐射的透射部分的强度可用时的荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)确定。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其特征在于，荧光物质的浓度(c)根据特征曲线的组确定，所述特征曲线的组指示依据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)、荧光辐射的强度(Ifluor)以及在荧光吸收辐射的透射部分的强度可用时的荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)和/或在散射光的强度可用时的散射光的强度(Istreu,ex)的荧光物质的浓度(c)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特征曲线的组还指示依据介质的pH值和/或温度的荧光物质的浓度(c)。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述特征曲线的组是通过在确定荧光物质的浓度(c)之前进行的测量方法确定的，在所述测量方法中，对于若干给定的荧光物质的校准浓度(c1-c3)中的每一个，对荧光辐射的强度(Ifluor)、激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)以及在荧光吸收辐射的透射部分的强度可用时的荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)和/或在散射光的强度可用时的散射光的强度(Istreu,ex)进行测量。
7.根据权利要求1至6中的任意一项所述的方法，其特征在于，在测量激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)之前，使激发辐射的透射部分在穿过具有荧光物质的介质之后重新定向。
8.一种用于确定介质中的荧光物质的浓度(c)的设备(1)，至少包括：第一辐射源(3)，其用于发射具有激发波长(λex)的激发辐射；第一传感器(4)，其用于测量由激发辐射激发且具有荧光波长(λem)的荧光辐射的强度；以及计算单元(6)，其用于根据荧光辐射的强度确定荧光物质的浓度，所述设备(1)的特征在于，设置了第二传感器(5)，第二传感器(5)用于测量激发辐射的透射部分的强度，而计算单元(6)设置为用于根据激发辐射的透射部分的强度(Itrans,ex)和荧光辐射的强度(Ifluor)来确定荧光物质的浓度(c)。
9.根据权利要求8所述的设备(1)，其特征在于，设置了第二辐射源(7)，第二辐射源(7)用于使具有荧光波长(λem)的荧光吸收辐射穿过具有荧光物质的介质。
10.根据权利要求9所述的设备(1)，其特征在于，将第一传感器(4)设置为用于测量荧光吸收辐射的透射部分的强度(Itrans,em)。
11.根据权利要求8至10中的任意一项所述的设备(1)，其特征在于，设置了用于测量散射光的强度的第三传感器(27)。
12.根据权利要求8至11中的任意一项所述的设备(1)，其特征在于，将参考传感器(9、10)关联于第一辐射源(3)和/或第二辐射源(7)，所述参考传感器(9、10)分别用于校准第一辐射源(3)和第二辐射源(7)。
13.根据权利要求8至12中的任意一项所述的设备(1)，其特征在于，设置了特别地为容纳槽的测量室(2)，所述测量室(2)用于容纳具有荧光物质的介质。
14.根据权利要求13所述的设备(1)，其特征在于，在测量室(2)与第二传感器(5)之间设置了偏转镜(11)，所述偏转镜(11)用于使激发辐射的透射部分偏转。
15.根据权利要求14所述的设备(1)，其特征在于，偏转镜(11)使激发辐射的透射部分以大体上90°发生偏转。
16.根据权利要求15所述的设备(1)，其特征在于，将分束器设置为偏转镜(11)，所述分束器特别地是频率选择分束器。
17.根据权利要求8至16中的任意一项所述的设备(1)，其特征在于，将第一辐射源(3)设置为用于发射具有多个激发波长(λex)的激发辐射，所述激发辐射特别地具有大体上连续的激发谱，其中将第一传感器(4)和第二传感器(5)以及在参考传感器可用时的参考传感器(9)分别设置为频谱分析仪(28、28'、28”)。
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| DE102019122096A1 (de) * | 2019-08-16 | 2021-02-18 | Endress+Hauser Conducta Gmbh+Co. Kg | Optochemischer Sensor und Verfahren |
| CN114252416B (zh) * | 2020-09-21 | 2024-05-31 | 湖北富博化工有限责任公司 | 一种亚硝酸根的荧光测定方法 |
| CN113670866B (zh) * | 2021-07-08 | 2022-06-14 | 上海交通大学 | 一种电芬顿过程溶解性有机物在线定量的分析方法及系统 |
| DE102022107746A1 (de) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Lytegate GmbH | Verfahren und Messanordnung zur Untersuchung organischen Materials |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6394136A (ja) * | 1986-10-08 | 1988-04-25 | Hitachi Ltd | 蛍光分析方法及び装置 |
| CN101019018A (zh) * | 2004-09-06 | 2007-08-15 | 浜松光子学株式会社 | 荧光显微镜及荧光相关光谱分析装置 |
| CN101351688A (zh) * | 2005-12-29 | 2009-01-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 测定介质中化合物的同一性或不同性和浓度的方法 |
| WO2009079629A2 (en) * | 2007-12-18 | 2009-06-25 | Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California | A cardiac output monitor probe and calibrator |
| US20100282982A1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-11-11 | Krohne Optosens Gmbh | Device for measuring the fluorescence of a medium |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4162851A (en) * | 1978-03-29 | 1979-07-31 | Akiyoshi Wada | Simultaneous photometering method and assembly for multi-dimensional measurements concerning biologically related materials |
| JPH04303746A (ja) * | 1991-03-29 | 1992-10-27 | Shimadzu Corp | 蛍光測定装置 |
| CA2119134A1 (en) * | 1991-10-01 | 1993-04-15 | Herbert L. Berman | Rapid assay for gold and instrumentation useful therefor |
| US5489977A (en) * | 1993-08-11 | 1996-02-06 | Texaco Inc. | Photomeric means for monitoring solids and fluorescent material in waste water using a falling stream water sampler |
| AU5907998A (en) * | 1997-02-28 | 1998-09-18 | Joseph R Lakowicz | Measuring analytes with metal-ligand complex probes |
| JP2000356635A (ja) * | 1999-06-15 | 2000-12-26 | Meidensha Corp | クロロフィルａ濃度測定方法及びその装置 |
| JP2001033388A (ja) * | 1999-07-23 | 2001-02-09 | Meidensha Corp | クロロフィルａ濃度測定方法及びその装置 |
| JP3842492B2 (ja) * | 1999-09-13 | 2006-11-08 | 株式会社東芝 | 藻類濃度測定システム |
| US7217937B2 (en) * | 2003-11-21 | 2007-05-15 | Brightwell Technologies | Automatic identification of suspended particles |
| US8901513B2 (en) * | 2011-03-08 | 2014-12-02 | Horiba Instruments, Incorporated | System and method for fluorescence and absorbance analysis |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6394136A (ja) * | 1986-10-08 | 1988-04-25 | Hitachi Ltd | 蛍光分析方法及び装置 |
| CN101019018A (zh) * | 2004-09-06 | 2007-08-15 | 浜松光子学株式会社 | 荧光显微镜及荧光相关光谱分析装置 |
| CN101351688A (zh) * | 2005-12-29 | 2009-01-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 测定介质中化合物的同一性或不同性和浓度的方法 |
| WO2009079629A2 (en) * | 2007-12-18 | 2009-06-25 | Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California | A cardiac output monitor probe and calibrator |
| US20100282982A1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-11-11 | Krohne Optosens Gmbh | Device for measuring the fluorescence of a medium |
| EP2249145A3 (de) * | 2009-05-07 | 2013-01-09 | KROHNE Optosens GmbH | Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz eines Mediums |
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