JP6441238B2 - 濃度を決定するための方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光物質を含む媒体に励起波長の励起放射を照射し、蛍光物質を励起して蛍光波長の蛍光放射を放出させ、蛍光放射の強度を測定し、この強度から媒体中の蛍光物質の濃度を求める、媒体中の蛍光物質の濃度を決定するための方法に関する。

更に本発明は、励起波長の励起放射を放出するための少なくとも１個の第１の放射源と、励起放射によって励起された、蛍光波長を有する蛍光放射の強度を測定するための第１のセンサと、蛍光放射の強度から蛍光物質の濃度を求めるための計算ユニットとを備えている、媒体中の蛍光物質の濃度を決定するための装置に関する。

先行技術により、励起放射を用いて蛍光物質を的確に励起して蛍光放射させる、媒体中の蛍光物質の存在を決定するための方法が知られている。測定結果に応じて蛍光物質の存在を推定するために、蛍光放射の強度を測定する。しかしながら蛍光測定そのものは一般に信頼できる定量的測定方法と見なされていない。なぜなら例外的な場合しか蛍光放射の強度から蛍光物質の濃度を推定できないからである。免疫学では例えば抗体に蛍光化学基を付与して、抗体が結合する場所が蛍光に基づいて認識できるようになっている。これにより抗原濃度は一部定量的にも決定できる。

いずれにせよ実践において、濃度決定の所望された精度は蛍光を測定することによっては通常達成されないことが観察された。一方で測定チャンバのジオメトリが測定精度に与える影響が観察された。公知の方法では条件が経時的に変化する場合も満足のゆく結果は得られなかった。この問題はこれまで解決できなかった。

（原文に記載なし）

従って、本発明の課題は、蛍光物質の濃度を高い精度で決定することを可能にする、冒頭に記載した種類の方法及び装置を提供することである。特に、測定チャンバのジオメトリが測定精度に及ぼす影響を低減もしくは排除することが追求される。更に、濃度の決定は条件が経時的に変化する場合も精密に行われるべきである。

上記の課題は本発明により、更に励起放射の透過部分の強度を測定して、蛍光物質の濃度を励起放射の透過部分の強度と蛍光放射の強度から求める。

それゆえ従来のように蛍光を測定するだけでなく、有利には更に蛍光物質を含む試料中の励起光の吸収も測定された蛍光放射の強度に影響し得ることを考慮する。吸収が濃度の決定にどの位強く影響するかは、特に光が試料中を進む長さに依存する。従って吸収の影響は特に測定チャンバのジオメトリに依存している。これらの効果は従来使用された蛍光測定では考慮されなかったので、測定された蛍光強度そのものから試料中の蛍光物質の濃度を推定することはできない。これに対して本発明による方法は蛍光物質の濃度を決定するための高精度の定量的方法として使用できる。一方で、蛍光物質の濃度を決定するための方法を実施する際に吸収が蛍光に比例して上昇することが判明した。これは蛍光測定に必要な励起光は試料媒体中への進入深さが増すに連れて減弱され、その結果として蛍光信号の減少を招くことを意味する。更に、実践において未知の試料では蛍光又は蛍光を誘起する物質の濃度と因果関係にない試料中で励起光の吸収が頻繁に発生する。それゆえ総じて純粋な蛍光測定の場合にはシステム固有の誤差が生じ、蛍光測定からの情報によっては修正できない。本発明によりこの誤差は、測定体積中を通過する際の励起放射の吸収を推定させる励起放射の透過部分を測定することによって排除される。次に蛍光物質の濃度の決定が蛍光と励起放射の透過の両方に基づいて行なわれる。この方法は、試料の濁りもしくは他の理由で、例えば媒体を貫通する励起放射を減弱させるために反応試薬を添加することにより励起放射の吸収が増加し、その結果として蛍光信号の減少を招く場合に特に有利である。純粋な蛍光測定において信号の変化は少量の蛍光と区別できず、濃度の決定に不正確なもしくは誤った結果が含まれるであろう。これに対して吸収と蛍光を同時に測定することは、一方で励起放射の透過部分を試料中の励起放射の吸収に基づく非直線性及び誤測定の修正に援用できるという利点がある。このことは例えば試料を収容する測定チャンバの種々のジオメトリを考慮しなければならない場合に有利である。更に例えば反応試薬、特に基質を調量して入れた後で吸収と蛍光との関係から、添加された反応試薬の定性的状態について判定を下すことができる。本発明のその他の利点は、測定過程が長く続いた場合に濃度の変化を試料の透過性の変動から高い精度で区別できることにある。この場合特に蛍光強度と励起光の透過強度が同時に蛍光物質を含む媒体の同一の体積要素で測定されると好都合である。このことはとりわけ試料が不均質であるか、或いはその状態が経時的に急激に変化する場合に有利である。しかしながら試料が安定して均質である上に十分な量存在している場合は、代替として蛍光と励起光の透過を同じ装置で時間的に相前後して、或いは（たとえ同時であっても）別々の測定装置で測定できる。

特に好適な構成によると、蛍光物質を含む媒体に更に蛍光波長を有する蛍光吸収放射を照射して、蛍光吸収放射の透過部分の強度を測定し、励起放射の透過部分の強度と、蛍光放射の強度と、蛍光吸収放射の透過部分の強度から蛍光物質の濃度を求める。それゆえこの構成では蛍光波長で照射した際の試料の透過もしくは吸収を、蛍光物質の濃度を決定するための別の入力値として援用できる。この場合、蛍光吸収放射の透過部分の測定は励起放射を遮断して行われ、蛍光波長で照射した際の試料の透過を励起光で励起された蛍光に依存しないで決定できるようになっている。従ってこの構成では蛍光物質の濃度は、一方では蛍光放射と、他方では励起放射の透過及び蛍光吸収放射から構成された３重測定値によって決定される。この場合、励起放射もしくは蛍光吸収放射が蛍光物質を含む媒体を通る透過が、補正値として蛍光信号に重ねられる。

より正確な測定結果を得るために、更に励起波長を有する散乱光の強度を測定して励起光の透過部分の強度と、蛍光放射の強度と、散乱光の強度から、場合によっては（即ち測定されたならば）蛍光吸収放射の透過部分の強度からも蛍光物質の濃度を求めるようになっていると好都合である。散乱放射の測定は特に第３の光線センサによって実現される。この光線センサは好ましくは励起波長に対して敏感であり、もしくはその前段に中心波長λ_exを有する相応のバンドパスフィルタが置かれている。

高精度の濃度測定のために、蛍光物質の濃度を励起放射の透過部分の強度と、蛍光放射の強度と、及び場合によっては（即ち測定されたならば）蛍光吸収放射の透過部分の強度及び／又は散乱光の強度との関係で示す特性マップから蛍光物質の濃度を求めるようになっていることが好都合である。特性マップは経験的に得ることできる。代替として蛍光物質の濃度を決定するための入力値を互いに関連付ける計算モデルも使用できる。

更に特定の応用にとって、特性マップが蛍光物質の濃度を追加的に媒体のｐＨ値及び／又は温度との関係で示し、それによって相応に高次元の特性マップが得られると好都合である。

この場合、特に特性マップが、蛍光物質の濃度を求める前段に置かれた測定方法において決定され、そこでは蛍光物質の所定の検定濃度に対してそれぞれ蛍光放射の強度と、励起放射の透過部分の強度と、場合によっては蛍光吸収放射の透過部分の強度及び／又は散乱光の強度が測定されると好都合である。それにより有利には蛍光物質の濃度と入力値の間の測定構成に特有の一義的関係を求めることができ、この関係は蛍光物質の未知の濃度を決定する際に援用される。解像度を高めるために、特性マップの測定点がそれ自体公知のやり方で近似曲線によって内挿されると好都合である。散乱光を考慮する場合は、等しい吸収と変動する散乱に対して複数回の測定を行うことができる。そのような測定方法もしくは検定方法の代替として、濃度と個々の測定値の関係は数学的関連によっても得ることができる。

測定における精度を改善するために、励起放射の透過部分の強度を測定する前に、励起放射の透過部分は蛍光物質を含む媒体を通過した後で転向されると好都合である。これにより蛍光物質を含む媒体を照射する方向で励起光の透過を測定する際に発生し得る妨害効果を回避できる点が有利である。

冒頭に記載した種類の装置は、励起放射の透過部分を測定するための第２のセンサが設けられており、計算ユニットは蛍光物質の濃度を励起放射の透過部分の強度及び蛍光放射の強度に依存して求めるために備えられていることを特徴とする。

これにより先に説明した方法と同じ利点及び技術的効果が達成され得るため、上記の記述の参照を求める。ここで計算ユニットは特性マップを記憶した記憶装置を有することが好ましい。特性マップは蛍光物質の濃度と励起放射の透過部分の強度、蛍光放射の強度、更に好ましくは蛍光吸収放射の透過部分の強度との関係を含んでいる。

濃度決定の精度を更に改善するために、蛍光物質を含む媒体に蛍光波長を有する蛍光吸収放射を照射するための第２の放射源が設けられていると好都合である。第２の放射源は第１の放射源に依存せずに投入もしくは遮断可能であり、第２の放射源が投入されて第１の放射源が遮断された状態で媒体を通過する際に蛍光吸収放射の透過部分の強度、即ち蛍光波長を有する放射の吸収を決定できるようになっている。

蛍光吸収放射の透過部分の強度を測定するための第１のセンサが備えられていることが好ましい。代替として蛍光吸収放射の透過部分を測定するために、固有の第３のセンサが設けられてよい。第１のセンサは、蛍光物質の濃度を決定するための（励起放射の透過と並んで）別の入力値として蛍光強度と蛍光吸収放射の強度を得る計算ユニットと接続されている。

更に、散乱光の強度を測定するための第３のセンサが設けられていると好適である。第３のセンサは、蛍光物質の濃度を決定するための別の入力値として散乱光の強度を得る計算ユニットと接続されている。

好適な構成に従い第１の放射源及び／又は第２の放射源にそれぞれ第１の放射源もしくは第２の放射源を較正するための基準センサが割り当てられている。好適な構成において基準センサは、例えば部分透過鏡を用いて励起光の一定のパーセンテージを励起光の光路から分岐させて基準センサに送ることにより、励起光の強度を絶えず測定する。この基準信号は常時測定された（透過及び蛍光）信号と比較される。それゆえ測定信号は常に同時点に基準センサによって測定された励起光の強度が基準とされる。それによって有利には、励起光の強度が変動した場合に測定結果に影響を及ぼさないことが確保される。

好適な応用において、蛍光物質を含む媒体を収容するための測定チャンバ、特にキュベットが設けられる。蛍光物質を含む媒体が液相試料として存在することが好ましい。代替として気相媒体において蛍光物質の濃度を決定できる。幾つかの構成において、複数の測定チャンバが設けられており、それぞれが種々の蛍光波長もしくは励起波長に同調されていて、種々の蛍光物質の濃度を同じ装置で決定できるようになっていると好都合である。この場合、それぞれの波長に同調された特性マップが、好ましくは上述した測定方法を用いて使用されると好都合である。

別の好適な構成に従い、第１の放射源は、複数の励起波長、特に概ね連続的な励起スペクトルを有する励起放射を放出するために備えられている。このために励起波長もしくは蛍光波長の少なくとも概ね連続的な波長領域に対する濃度の特性マップが使用されることが好適であり、それによって方法は少なくとも概ね連続的な波長領域における蛍光物質の濃度の決定に拡張され得る。この目的のために上述した測定方法は多数の励起波長もしくは蛍光波長に対して狭い周波数間隔で実施でき、そうすることによって興味のある波長領域に対する特性マップが得られる。この場合、個々の概ね離散的な蛍光波長もしくは励起波長を調べる際に好んで設けられているように、単色励起放射を放出するための第１の放射源（又は単色蛍光吸収放射を放出するための第２の放射源）を備える必要がない。その代わり複数の励起波長、特に概ね連続的な励起スペクトルを有する励起放射を放出するための第１の放射源が備えられている。この構成では第１のセンサ又は第２のセンサとして、場合によっては基準センサとしてそれぞれ１個の分光計が設けられていることが好適である。更にこの構成では、蛍光吸収放射を放出するための第２の放射源が、場合によっては更に散乱光の強度のためのセンサが省かれると好都合である。なぜならこれらによって提示可能な情報は既に吸収スペクトルもしくは蛍光スペクトルに含まれているからである。

測定精度を損ねる妨害効果を回避するために、測定チャンバと第２のセンサとの間に、励起放射の透過部分を転向させるための転向鏡が配置されていると好都合である。

転向鏡は励起光の透過部分を概ね９０°転向させることが好ましい。これにより励起光の透過を測定する際に精度が著しく改善されることが有利である。

励起放射を分岐させるために、転向鏡としてビームスプリッタ、特に周波数選択的ビームスプリッタが設けられていると特に好都合である。周波数選択的ビームスプリッタは、蛍光波長の放射を反射せずに透過させるロングパスフィルタとして（即ち周波数空間ではローパスフィルタ）として構成されていることが好ましい。この構成により特に、第２のセンサによって反射された蛍光波長の放射が測定チャンバを通って戻らず、その結果第１のセンサに到達することが達成され得る。同時にこれにより、蛍光波長の放射が測定チャンバを出て第２のセンサに到達することが妨げられる。このことは特に透過放射と蛍光放射の強度は数等異なることがあるので重要である。それゆえ第１のセンサ（蛍光センサ）は第２のセンサ（透過センサ）よりはるかに敏感であり得る。更に転向鏡に蛍光吸収放射を放出するための第２の放射源が割り当てられていることが好ましい。更にこの場合、ビームスプリッタが周波数選択的であると好都合である。周波数選択的ビームスプリッタの限界波長が励起波長と蛍光波長との間にあることが好ましい。これにより特に、励起放射の透過部分は概ね全体が第２のセンサに到達することが達成され得る。

以下に本発明を図面に示された好適な実施形態に基づいて詳しく説明する。しかしながら本発明はこれらの実施形態に限られるものではない。

媒体中の蛍光物質の濃度を決定するための本発明による装置の図である。 蛍光物質の濃度を決定するための装置の代替的構成の図である。 蛍光物質の濃度を決定するための装置の別の構成の図である。 蛍光物質の濃度を決定するための装置の別の構成の図である。 蛍光物質の濃度を決定するための計算ユニットの概略図である。 励起された蛍光もしくは励起放射の透過と媒体の透過性との関連を図示するためのグラフであり、一定の検定濃度に対する様々な測定曲線が示されている。 蛍光物質の濃度を蛍光及び励起放射の透過に依存して決定するための特性マップを示すグラフである。 蛍光物質の濃度の増加ではなく励起放射の透過の上昇に起因する蛍光信号の上昇を図示するためのグラフである。

図１は、測定チャンバ２内に収容されている媒体中の蛍光物質の濃度ｃを決定するための装置１を示す。図示された構成では測定チャンバ２としてキュベットが設けられており、その中に蛍光物質を含む液相試料が収容されている。装置１は励起波長λ_exの励起放射を放出するための第１の放射源３を有する。更に、励起放射によって励起された蛍光放射（略：蛍光）の強度Ｉ_fluorを測定するための第１のセンサが設けられている。蛍光放射は励起波長λ_exと比べてより大きい蛍光波長λ_emを有する。一般に知られているように、蛍光光は常にその励起光より大きい波長、即ちより低い周波数（もしくはエネルギー）を有する。

図１から更に明らかなように、励起放射の透過部分の強度Ｉ_trans,ex（略：励起放射の透過）を測定する第２のセンサ５も設けられている。励起放射の透過は、試料を通過する際の励起放射の吸収に間接的に比例しており、蛍光放射の強度Ｉ_fluorの測定と同時に測定される。

更に、蛍光物質の濃度ｃを求めるのに用いる計算ユニット６（図５参照）が設けられている。図示された構成では、濃度ｃは単に蛍光に依存するだけでなく、更に励起放射の透過にも依存して決定される。これにより濃度測定の精度は、蛍光測定そのものがおよそ定量的な濃度の決定を可能にできたとして、専ら蛍光信号を援用する慣用的な方法に比べて著しく高められる。

更に図１から明らかなように、試料に蛍光波長を有する放射（以下、蛍光吸収放射と呼ぶ）を照射するための第２の放射源７も設けられている。蛍光吸収放射の透過部分（略：透過）の強度Ｉ_trans,emは、第１の放射源３がは遮断されている間に第１のセンサ３を使って測定される。

更に図１から明らかなように、第１の放射源３には基準センサ９が割り当てられ、第２の放射源７には基準センサ１０が割り当てられており、これらの基準センサによって第１の放射源３もしくは第２の放射源７が較正可能である。このために励起光の一定の比較的僅かなパーセンテージを、部分透過鏡２５を用いて励起放射の光路から分岐させて基準センサ９に送り、励起放射の強度を連続的に検出するようになっている。励起放射の透過及び蛍光は（場合によっては散乱光の強度も。図３参照）、常時基準信号と比較されて、測定信号の検定が行なわれる。これに対応して第２の放射源７には別の部分透過鏡２６が設けられており、これにより蛍光吸収放射の（比較的僅かな）割合が基準センサ１０に誘導される。それによって蛍光吸収放射に関する較正を行うことができる。

更に図１から明らかなように、図示された構成では装置１は更に、測定チャンバ２と第２のセンサ５との間に配置された転向鏡１１を有する。これにより励起放射の透過部分は測定チャンバ２を出た後で照射方向に対して相対的に転向される。この場合、転向鏡１１は励起放射の透過部分を、測定チャンバ２を通過する際の励起放射の方向に対して相対的に概ね９０°転向させる。図示された構成では転向鏡１１としてビームスプリッタが設けられている。このビームスプリッタは励起波長と蛍光波長の間の限界波長によって周波数選択的に構成されており、蛍光波長の放射は反射せず透過するようになっている。これにより一方では、第２のセンサ５によって反射された蛍光波長の放射は測定チャンバを通って第１のセンサ４に到達し、測定チャンバ２から出た蛍光波長の放射は第２のセンサ５に到達する。

図示された構成では、基準センサ１０、第２の放射源７及び第２のセンサ５の前段にそれぞれ１個の（随意の）バンドパスフィルタ１２が置かれている。基準センサ１０では蛍光吸収放射の強度に対する基準値が得られ、蛍光吸収放射の強度に変動が生じた場合に考慮できるようになっている。

更に図１から明らかなように第１の放射源３と測定チャンバ２との間には別の転向鏡１３が設けられており、ここで励起放射は概ね９０°転向されて測定チャンバ２に入射される。転向鏡１３は転向鏡１１に対応して周波数選択的ビームスプリッタとして構成されており、その限界波長は励起波長λ_exと蛍光波長λ_emの間にある。第１のセンサ４は転向鏡１３の測定チャンバ２と反対に向けられた側に測定チャンバ２の照射方向と平行に配置されている。更に第１のセンサ４の前段に、基準センサ９及び第１の放射源３と同様に、随意にそれぞれ１個のバンドパスフィルタ１４が置かれている。バンドパスフィルタ１２、１４の随意的な使用は、特にセンサ又は放射源の特性に依存して行うことができる。

図２は、蛍光物質の濃度ｃを決定するための装置１の代替的構成を示しており、以下では図１との相違点のみ詳述する。

図２に従い第１の放射源３と測定チャンバ２との間に部分透過鏡１５が配置されており、それにより励起放射のそれぞれ１部分が測定チャンバ２に入射され、もしくは基準センサ９に供給される。基準センサ９では励起放射の強度に対する基準信号が連続的に検出される。随意に第１の放射源３の前段に励起波長に同調されたフィルタ１６が置かれてよい。励起波長λ_exに対する別のフィルタ１６は、励起放射の透過を検出するための第２のセンサ５の前段に置かれている。対応しているが蛍光波長λ_emに同調されたフィルタ１７が、蛍光吸収放射を放出するための第２の放射源７と、蛍光吸収放射もしくは蛍光の透過を検出するための第１のセンサ４に割り当てられている。

図２に従い第２の放射源７と測定チャンバ２との間に別の部分透過鏡１８が配置されており、これにより蛍光吸収放射のそれぞれ１部分が測定チャンバ２に入射され、もしくは基準センサ１０に供給される。基準センサ１０では蛍光吸収放射の強度に対する基準信号が連続的に検出され、この基準信号が蛍光吸収放射の透過（及びそこから試料中の蛍光放射の吸収）を正確に決定することを可能にする。

図２に従い、蛍光は励起放射の入射方向に対して特に９０°の角度で測定される。この場合、図１と異なり測定チャンバ２と第１のセンサ４との間の光路もしくは測定チャンバ２と第２のセンサ５との間の光路にビームスプリッタは設けられていない。

図３から明らかなように、この構成では更に第３のセンサ２７を使って励起波長λ_exを有する散乱放射の強度Ｉ_streu,exが測定されて、蛍光物質の濃度を決定するために援用される。第３のセンサ２７の前段に（随意に）バンドパスフィルタ１２が置かれている。それ以外の点では図３に従う配置は図１に示された構成に対応している。ここで言うまでもなく、図２に従う構成でも散乱光の強度を検出するための第３のセンサ２７が存在してよい。

図４に従い、広い連続的な励起スペクトルを有する第１の放射源３が使用される。第１のセンサ４、第２のセンサ５及び基準センサ９はここでは分光計２８、２８’、２８’ ’として構成されている。この構成では蛍光吸収放射を放出するための第２の放射源７と、散乱光の強度に対する第３のセンサ２７は省くことできる。

図５から明らかなように、計算ユニット６は蛍光、励起放射の透過、及びそれぞれ随意に蛍光吸収放射の透過と散乱光の強度を入力値として得る。計算ユニット６は、入力値から蛍光物質の濃度ｃを決定するための特性マップを記憶した記憶装置８を有する。計算ユニット６は求められている蛍光物質の濃度ｃを計算ユニット６の出力値として提供する。

上述したように、蛍光物質の濃度は計算ユニット６を使い、記憶装置８に保存された特性マップによって互いに関連付けられている測定値から決定される。特性マップは濃度の決定の前段に置かれた測定方法において決定できる。この測定方法について以下に説明する。

図６に従い、測定方法もしくは検定方法の第１のステップにおいて、蛍光物質の定義された濃度ｃｌ、ｃ２に対して若干の測定曲線１９がプロットされる。この場合、一方では蛍光（測定曲線１９’）が、他方では励起放射の透過（測定曲線１９’ ’）が試料の透過性Ｄに依存して決定される。試料の透過性Ｄは、例えば不透明な物質を調量して加えることにより段階的に変化させることができる。それによってそれぞれ一定の蛍光物質の濃度において試料の透過性もしくは不透明性に依存して蛍光（測定曲線１９’）もしくは透過（測定曲線１９’ ’）に対する測定曲線１９が生じる。

図７から明らかなように、次のステップでは蛍光が励起放射の透過に対してプロットされる（測定曲線２０）。この場合、各測定曲線２０は特定の検定濃度ｃｌ〜ｃ３に対応している。従って２次元空間の曲線群が生じる。構成に応じて追加的に蛍光吸収放射の透過又は散乱光の強度も試料の透過性に依存して測定できる。この場合、図７の２次元グラフの代わりに３次元空間における面群が得られる（図示されていない）。ここで（構成に応じて２次元又は３次元）グラフ内の各点は特定の蛍光物質の濃度に対応しており、測定値と濃度ｃとの一義的関係が得られるようになっている。

代替として散乱光と蛍光吸収放射のいずれも考慮することができ、それにより４次元状態マトリックスが得られる、そこでは４個のパラメータ（即ち蛍光、励起放射の透過、蛍光吸収放射の透過及び散乱放射）の各々の組合せに一義的に蛍光物質の濃度ｃが割り当てられている。

測定曲線２０の数に応じて濃度決定の精度を高めることができる。更に、２重測定値を（もしくは構成に応じて３重測定値又は４重測定値も）求められている濃度ｃに直接換算できるようにするために、数学的もしくは数量的内挿を行うこともできる。

この方法の利点は、例えば測定過程における蛍光（信号２１）の経時的推移が概略的に示されている図８から明らかである。液相試料を調べ、時点２２で緩衝剤を添加する。その後で蛍光物質を発生させる基質を調量添加する（矢印２３）。基質を調量して入れた後で基質の固有蛍光に基づき蛍光−信号が最初に飛躍的に上昇する。その後引き続いて蛍光の上昇が見られ、これは蛍光物質の濃度が上昇しているかのような印象を与える。しかしながら励起放射の透過（信号２４）を測定すると、緩衝剤を入れた際に透過は最初に飛躍的に減少することが確認される。なぜなら試料中の緩衝剤により光はほとんど第２のセンサ５に到達しなくなるからである。続いて試料の透過性が時間に連れて増して、励起放射の透過が上昇する。それとともに蛍光に対する励起信号の強度も、従って蛍光信号も上昇する。従って誤って考えられた蛍光の上昇は蛍光物質の濃度変化に基づくものではなく、励起放射の透過に基づいている。

上述した方法は、種々異なる蛍光物質の濃度の決定に援用できる。

ここである物質の蛍光強度はｐＨ値にも、測定時点の温度にも依存していることがある。上述の発明は定義されたｐＨ値又は定義された温度がなくとも、蛍光測定の精度の改善を可能にする。しかしながら試料中の物質の濃度を決定できるためには、測定される試料は較正時と等しいｐＨ値及び等しい温度を有するべきである。このことは所定の量の緩衝剤を添加し、測定装置の温度を正確に制御することによって確保される。代替として特性マップにｐＨ値及び／又は温度のパラメータを加えて拡張することができ、そうすることによって相応に高次元の特性マップが得られる。そのような特性マップは４次元（専ら励起放射の透過部分の強度Ｉ_trans,exと蛍光放射の強度Ｉ_fluorを考慮する場合）又は５次元もしくは６次元（追加的に蛍光吸収放射の透過部分の強度Ｉ_trans,em及び／又は散乱光の強度Ｉ_streu,exを考慮する場合₎を有する。

以下に上述した方法の例として、水域におけるフルオレセインナトリウムの濃度を決定する。

フルオレセインナトリウムを蛍光トレーサとして地下水流の調査に使用する。フルオレセインナトリウムに対する最適な励起波長は４９１ｎｍであり、蛍光放射の最大波長は５１６ｎｍである。試料中のフルオレセイン濃度を決定するために、上述したように特性マップを作成することによって、最初に測定装置を検定する。このためにそれぞれ定義されたフルオレセイン濃度と、緩衝液によって調整された一定のｐＨ値、例えばｐＨ７を有する基準溶液を順次測定する。これらの基準液を一定の温度、例えば２５°Ｃで測定する。較正の過程で各基準液に不透明な物質、例えばホルマジンを濃度を高めながら連続的に添加して繰り返し測定する。フルオレセイン濃度は一定で、同時にホルマジン濃度を高めながら、蛍光強度、透過強度、場合によっては散乱光強度と蛍光吸収放射の強度に対する測定数値のそれぞれの組合せを記録する。この過程を種々のフルオレセイン濃度について繰り返すと、十分な厚みのある特性マップが生じ、それにより対象とする全濃度範囲を内挿又は数学的計算によって十分表現することが可能となる。

較正が終了したら、測定装置は使用可能となる。このとき測定装置に任意の試料を入れ、ｐＨ値を調整するために所定の量の緩衝剤を添加して、蛍光、透過、場合によっては散乱光及び蛍光吸収放射に対する強度値を求める。これらの測定データレコードを使って特性マップから実際のフルオレセイン濃度を決定する。

Claims (18)

1. 媒体中の蛍光物質の濃度（ｃ）を決定するための方法であって、蛍光物質を含む媒体に励起波長（λ_ex）の励起放射を照射し、蛍光物質を励起して蛍光波長（λ_em）の蛍光放射を放出させ、蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）を測定し、この強度から媒体中の蛍光物質の濃度（ｃ）を求める方法において、
   更に励起光の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）を測定して、励起放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）と蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）から蛍光物質の濃度（ｃ）を求め、
   蛍光物質を含む媒体に更に蛍光波長（λ _em ）を有する蛍光吸収放射を照射し、蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）を測定して、励起放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,ex ）と、蛍光放射の強度（Ｉ _fluor ）と、蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）から蛍光物質の濃度（ｃ）を求め、
   前記蛍光放射の強度（Ｉ _fluor ）と前記蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）は、同じセンサによって測定されることを特徴とする、媒体中の蛍光物質の濃度（ｃ）を決定するための方法。
2. 更に、励起波長（λ_ex）を有する散乱光（Ｉ_streu,ex）の強度を測定して、励起放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）と、蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）と、散乱光の強度（Ｉ_streu,ex）と、蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,em）とから蛍光物質の濃度（ｃ）を求めることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 蛍光物質の濃度（ｃ）を励起光の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）と蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）と蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,em ）との関係で示す特性マップから蛍光物質の濃度（ｃ）を求めることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 蛍光物質の濃度（ｃ）を励起光の透過部分の強度（Ｉ _trans,ex ）と蛍光放射の強度（Ｉ _fluor ）と蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）と散乱光の強度（Ｉ _streu,ex ）との関係で示す特性マップから蛍光物質の濃度（ｃ）を求めることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
5. 前記特性マップは、蛍光物質の濃度（ｃ）を求める前段に置かれた測定方法において決定され、そこでは蛍光物質の所定の検定濃度（ｃｌ−ｃ３）に対してそれぞれ蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）、励起放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）、及び、蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,em ）が測定されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
6. 前記特性マップは、蛍光物質の濃度（ｃ）を求める前段に置かれた測定方法において決定され、そこでは蛍光物質の所定の検定濃度（ｃｌ−ｃ３）に対してそれぞれ蛍光放射の強度（Ｉ _fluor ）、励起放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,ex ）、蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）及び散乱光の強度（Ｉ _streu,ex ）が測定されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
7. 前記特性マップは、蛍光物質の濃度（ｃ）を追加的に媒体のｐＨ値及び／又は温度との関係で示すことを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 励起放射の透過部分の強度（_Itrans,ex）を測定する前に、励起放射の透過部分は蛍光物質を含む媒体を通過した後で転向されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 媒体中の蛍光物質の濃度（ｃ）を決定するための装置（１）であって、励起波長（λ_ex）の励起光を放出するための少なくとも１個の第１の放射源（３）と、励起放射によって励起された、蛍光波長（λ_em）を有する蛍光放射の強度を測定するための第１のセンサ（４）と、蛍光放射の強度から蛍光物質の濃度を求めるための計算ユニット（６）とを備え、励起放射の透過部分を測定するための第２のセンサ（５）が設けられており、計算ユニット（６）は蛍光物質の濃度（ｃ）を励起放射の透過部分の強度（Ｉ_trans,ex）及び蛍光放射の強度（Ｉ_fluor）に依存して求めるために備えられており、
   蛍光物質を含む媒体に蛍光波長（λ _em ）を有する蛍光吸収放射を照射するための第２の放射源（７）が設けられており、
   第１のセンサ（４）は蛍光吸収放射の透過部分の強度（Ｉ _trans,em ）を測定するために備えられている、媒体中の蛍光物質の濃度（ｃ）を決定するための装置（１）。
10. 散乱光の強度を測定するための第３のセンサ（２７）が設けられていることを特徴とする、請求項９に記載の装置（１）。
11. 第１の放射源（３）に前記第１の放射源（３）を較正するための第１の基準センサ（９）が割り当てられており、かつ／又は、第２の放射源（７）に前記第２の放射源（７）を較正するための第２の基準センサ（１０）が割り当てられていることを特徴とする、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の装置（１）。
12. 蛍光物質を含む媒体を収容するための測定チャンバ（２）が設けられていることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置（１）。
13. 測定チャンバ（２）と第２のセンサ（５）との間に、励起放射の透過部分を転向させるための転向鏡（１１）が配置されていることを特徴とする、請求項１２に記載の装置（１）。
14. 転向鏡（１１）は、励起放射の透過部分を概ね９０°で転向させることを特徴とする、請求項１３に記載の装置（１）。
15. 前記転向鏡（１１）としてビームスプリッタが設けられていることを特徴とする、請求項１４に記載の装置（１）。
16. 前記ビームスプリッタは周波数選択的ビームスプリッタであることを特徴とする、請求項１５に記載の装置（１）。
17. 第１の放射源（３）は、複数の励起波長（λ_ex ）を有する励起放射を放出するために備えられており、第１のセンサ（４）として及び第２のセンサ（５）として、それぞれ１個の分光計（２８’、２８’’）が設けられていることを特徴とする、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の装置（１）。
18. 前記第１の放射源（３）は、概ね連続的な励起スペクトルを有する励起放射を放出するために備えられていることを特徴とする、請求項１７に記載の装置（１）。

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