CN105072891B - 改进的内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及至少一种禾本科植物类内生真菌菌株，其在与黑麦属的至少一个物种结合时赋予黑麦属植物至少一定程度的害虫防护。具体地，本发明涉及选自由以下组成的组中的禾本科植物类内生真菌的分离菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合，涉及一种感染了内生真菌的黑麦属植物，其中，黑麦属不是内生菌的天然宿主，涉及一种制作稳定的宿主植物/禾本科植物类内生真菌组合的方法，涉及一种对宿主黑麦属植物赋予至少一定程度的害虫防护的方法，以及涉及一种感染了禾本科植物类内生真菌的黑麦属种子。
Description
技术领域
本发明通常涉及一种与黑麦玉米(ryecorn)(黑麦(Secale cereale))形成稳定共生体(共生关系，symbiotic association)的禾本科植物类(内生植物，epichloae)内生菌。
背景技术
黑麦(Secale cereale)(俗称黑麦(Rye))在全球范围内生长，通常用于生产粮食(谷物)。粮食主要用于制作面粉、面包和用于直接消费，尤其是在具有黑麦面包消费历史的那些国家中。黑麦的营养部分可以被用作稻草，或转换成青贮饲料，用作动物饲料，包括用于就地放牧。
如上所述，黑麦主要为粮食而生长。因此，在培养过程中需要有效的害虫防护，以确保生产足量的质量合格的粮食。黑麦通常被认为是秋季农作物，其中种子一般在秋季播种。与其它谷物或田地作物的轮种可以用来减少存在于土壤中或在作物碎屑中发展的害虫和/或真菌病害的积聚。
黑麦的主要害虫包括但不限于：蚜虫；牧草虫；金针虫和蛴螬；长脚蝇的蛆(大蚊属)；麦种蝇(灰地种蝇)；潜叶虫(潜蝇属)；瑞典杆蝇(黑麦秆蝇)；地鳖(甲壳虫(Zabrustenebrioides))；鞍瘿蚊(Haplodiplosis marginata)；谷类叶甲虫(黑角负泥虫，O.gallaeciana)；线虫；以及蛞蝓。
用于黑麦的害虫防治(害虫控制)的已知方法包括以下做法中的一些或全部：利用抗害虫品种，优化种植时间并播种健康种子，有效的轮种，破坏，和/或掩埋或移除作物碎片(茬)。可能需要的其它害虫防治方法包括对植物和/或种子使用各种杀虫剂。有时，对于害虫防治可能需要同时施加两种或更多种活性物质。
然而，由于与经常用于这些目的的化学品相关的已知问题，许多杀虫剂的使用可能会造成问题。许多杀虫剂是有毒的，并且可能对处理的农作物的人类和动物消费者造成危害(Casida和Quistad，1998)。特别是，有毒杀虫剂在人类和动物体内的积累可能对个体导致严重的健康问题，尤其是在早期发展期间。例如，杀虫剂暴露已经与呼吸系统疾病、发育癌症有关联，并显示出对智力能力的发展具有持续影响，Zejda等人，(1993)。
可能难以在变化的环境状况方面控制杀虫剂的使用，从而导致有毒化合物的不期望扩散，例如，由于喷雾的漂移或由于土壤淋溶作用。另外，由于许多原因，包括不适当的做法和处理，害虫可能发展为杀虫剂抗药性的，这可能造成对作物(粮食)产量的真正威胁。因此，对不使用所应用的杀虫剂的害虫防治措施存在需要。
本发明的目的是提供至少一种禾本科植物类内生真菌菌株，其在与黑麦属(Secale spp.)中的至少一个物种结合时赋予黑麦属植物至少一定程度的害虫防护，和/或向公众提供一种有用的选择。
在本说明书中，在参考专利说明书、其它外部文件、或其它来源的信息的情况下，这通常是为了给讨论本发明的特征提供背景的目的。除非另有具体说明，否则参考这样的外部文件不应被解释为承认这些文件或这些信息的来源在任何权限内是现有技术或构成本领域中公知常识的一部分。
发明内容
在第一方面，本发明涉及选自由以下组成的组中的禾本科植物类(epichloae)内生真菌(真菌内生菌，fungal endophyte)的分离菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合。优选地，本发明涉及菌株AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074和AR3078，优选地AR3046、AR3050或AR3068。
在一个实施方式中，分离的菌株在生物学上是纯的。
在第二方面，本发明涉及一种感染了内生真菌(真菌内生菌)的黑麦属植物(Secale spp.plant)，其中，黑麦属不是内生菌的天然宿主，并且其中，植物和内生菌形成允许植物经历正常的生命周期的稳定共生体(symbiotic association)。
在一个实施方式中，内生菌通过垂直传播(vertical transmission)从第一代黑麦属传播给第二代黑麦属。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
在一个实施方式中，内生菌是一种从披碱草属(Elymus spp.)中分离的内生菌。优选地，内生菌从批木芙蓉(Elymus mutabilis)中分离。优选地，内生菌是一种禾本科植物类内生菌(epichloae endophyte)。优选地，禾本科植物类内生菌是选自由以下组成的组中的禾本科植物类内生菌菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)，或者它们的组合。优选地，本发明涉及内生菌菌株AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074和AR3078，优选地AR3046、AR3050或AR3068。
在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属没有显示出内生菌感染的外部症状。
在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属显示出正常的形态表型。
在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属产生黑麦草碱生物碱和/或波胺。
在一个实施方式中，与未感染内生真菌的黑麦属相比，感染了内生真菌的黑麦属具有对一种或多种害虫增加的抗性、或对植物病害增加的抗性、或者两者。
在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属具有对一种或多种害虫增加的抗性，其中，一种或多种害虫选自由以下组成的组：(1)以谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)、麦无网长管蚜(Metopoliphium dirhodum)、麦属(Sitobion spp.)、麦长管蚜(Sitobion avenae)、莓蚜(草莓豁网蚜，Sitobion fragariae)、麦双尾蚜(俄罗斯小麦蚜虫，Diuraphis noxis)为代表的蚜虫(蚜科)物种；(2)以黑麦秆蝇(Oscinella frit)、麦杆蝇(Oscinella pusilla)、黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)、角潜蝇属(Cerodontha spp.)、角潜蝇芦苇(Cerodonthaaustralis)、角潜蝇螳螂(Cerodontha angustipennis)、潜蝇茧蜂(Formia fumigata)、苹果麦秆蝇(Meromyze americana)、金边龙蛇兰鞍瘿蚊(Haplodiplosis marginata)、稻秆潜蝇(Chlorops pumilionis)、大蚊属(Tipula spp.)、豌豆侧蝇(豌豆潜叶蝇，Chromatomyiafuscula)、麦茎蜂(Cephus pygmaeus)、豌豆侧蝇(Chromatomyia fuscula)、麦黄吸浆虫(Contarinia tritici)为代表的草和谷物苍蝇(潜蝇科；花蝇科、黄潜蝇科、茎蜂科和瘿蚊科)的物种；(3)以谷泥蓟马(Limothrips cerealium)、齿角刺鬃蓟马(Limothripsdenticornis)、芒缺翅蓟马(Aptinothrips rufus)、禾生枝孢稻蓟马(Stenothripsgraminum)为代表的牧草虫(蓟马科)物种；(4)以东亚飞蝗(Locusta migratoria)、澳洲蝗(Phaulacridium marginale)、卵翅蝗(Phaulacridium.Vittatum)、蚱蜢属(Melanoplusspp.)、眉纹蟋蟀(澳洲黑蟋蟀，Teleogryllus commodus)为代表的蚱蜢和蟋蟀(蝗科和蟋蟀科)物种；(5)以麦小长蝽(Nyssius huttoni)、麦长椿(Blissus leucopertusleucopertus)为代表的虫子(长椿科)物种；(6)以尖隐味象属(Sphenophorus spp.)为代表的象虫(象鼻虫)(象甲科)物种；(7)以美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)、斜纹夜蛾属(Spodoptera spp.)、东方粘虫(Mythimna separata)；南方粘虫(Persectania aversa)；翦老虎(Agrostis ipsilon)为代表的粘虫和糖蛾(夜蛾科)物种；(8)以黑角负泥虫(Oulemamelanopus)为代表的叶甲(叶甲科)物种；(9)以日本金龟子(Popillia japonica)、草地蛴螬(Costelytra zealandica)、庭园丽金龟属(Phyllopertha spp.)、欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis)、锚纹麦穗金龟甲(Anisoplia segetum)为代表的蛴螬(whitegrub)(金龟子科(Scarabaeidae))物种；(10)以球棉粉蚧(Phenacoccus hordei)、早熟禾粉蚧(Balanococcus poae)、Ripersella rumicis、小麦胭硕蚧(Porphyrophora tritici)为代表的粉蚧(mealybug)(粉蚧科(Pseudococcidae)和介壳虫科(Coccidae)物种；(11)以宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)、金针虫属(Limonius spp.)为代表的金针虫(wireworms)(叩甲科(Elateridae))物种；(12)以玉米距步甲(Zabrus tenebrioides)为代表的甲虫(beetles)(步甲科(Carabidae))物种；(13)以麦圆蜘蛛属(Penthaleus spp.)、红腿土螨(红足地螨，Halotydeus destructor)、瘿螨属(Aceria spp.)为代表的螨类(mites)(瘿螨科和叶爪螨科)物种；(14)以米象(Sitophilus oryzae)、谷象(Sitophilus granarius)、麦蛾(Sitotroga cerealella)、谷蠹(Rhyzopertha dominica)、扁谷盗属(Cryptolestesspp.)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、杂拟谷盗(Tribolium confusum)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)、烟草甲(Lasioderma erricorne)为代表的贮藏物害虫(stored productpests)(象甲科(Curculionidae)、锯谷盗科(Silvanidae)、螟蛾科(Pyralidae)、麦蛾科(Gelechiidae)、拟步甲科(Tenebrionidae)、长蠹科(Bostrichidae))物种；(15)以长沫蝉(Philaenus spumarius)为代表的沫蝉(froghopper)(沫蝉总科)物种；(16)以根腐线虫(root lesion nematode)(根腐线虫属(Pratylenchus spp.)，特别是索恩根腐线虫(P.thornei)、刻痕短体线虫(P.crenatus)、落选短体线虫(P.neglectus)和穿刺短体线虫(P.penetrans))、禾谷孢囊线虫(cereal cyst nematode)(异皮线虫属(胞囊线虫属，Heterodera spp.)和斑皮线虫属(Punctodera spp.)，特别是小麦孢囊线虫(H.avenae)、麦类胞囊线虫(地中海胞囊线虫，H.latipons)、大麦孢囊线虫(H.hordecalis)、菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)、稀少孢囊线虫(H.mani)、双膜孔孢囊线虫(H.bifenestra)、巴基斯坦孢囊线虫(H.pakistanensis)和刻点斑皮线虫(P.punctata))、根结线虫(root knotnematode)(根结线虫属(Meloidogyne spp.),尤其是奇特伍德根结线虫(M.chitwoodi)、纳西根结线虫(禾谷类根结线虫，M.naasi)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、小头根结线虫(M.microtyla)、奥特森尼根结线虫(M.ottersoni)、禾谷根结线虫(禾草根结线虫，M.graminicola)、禾本科根结线虫(M.graminis)、菊野根结线虫(M.kikuyensis)和大米草根结线虫(M.spartinae))，茎线虫病(stem nematode)(茎线虫属(Ditylenchus spp.)，特别是D.dipsicai和D.radicicola)；小麦粒线虫(seed gall nematode)(小麦粒瘿线虫(Anguina tritici))为代表的线虫物种；(16)蛞蝓(slugs)(网纹野蛞蝓(Derocerasreticulatum)和蛞蝓属(Arion spp.)，特别是花园蛞蝓(A.hortensis agg.)和微纺锤形蛞蝓(A.subfuscus))物种。在一个实施方式中，害虫是线虫，优选是根腐线虫(短体线虫属(Pratylenchusspp.))，或潜叶蝇，角潜蝇(Cerodontha australis)(双翅目：潜蝇科)，也被称为麦鞘角潜蝇。
在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属具有对植物疾病增加的抗性，其中植物疾病由选自由以下组成的组中的植物病原体引起：大麦黄矮病毒(Leteovirus)、小麦土传花叶病毒(真菌传杆状病毒(Furovirus))和小麦线条花叶病毒(小麦花叶病毒属(Tritimovirus))，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、草坪炭疽菌(禾生炭疽菌，Colletotrichum graminicola)、苹果炭疽菌(Glomerella graminicola)[有性型]、链格孢属(Alternaria spp.)、草本枝孢(Cladosporium herbarum)、塔森球腔菌(Mycosphaerella tassiana)[有性型]、附球菌属(Epicoccum spp.)、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)、匍柄霉属(Stemphylium spp.)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)[有性型]、镰刀菌属(Fusarium spp.)、小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麦腥黑穗病(Tilletia tritici)、腥蟾(Tilletia laevis)、腥黑粉菌(Tilletia foetida)、禾谷黑膜座菌(Hymenula cerealis)、禾谷头孢霉(麦类条斑病菌，Cephalosporium gramineum)、麦根腐长蠕孢(Helminthosporium sativum)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)[有性型]、胡和鬼伞菌(Coprinus sychromorbidus)、看麦娘双极毛孢(Dilophosporaalopecuri)、小麦矮化腥黑穗病菌(Tilletia controversa)、紫瘢麦角菌(Clavicepspurpurea)、麦角蜜孢菌(Sphacelia segetum)[无性型]、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、假冰草壳孢(Pseudoseptoria donacis)、禾谷类晕斑病菌(小麦白秆病，Selenophoma donacis)、印度尾孢黑粉菌(Neovossia indica)、小麦印度腥黑穗病(Tilletia indica)、隐匿柄锈菌(小麦叶锈病，Puccinia recondita)、孢锈菌(Aecidiumclematidis)[无性型]、草坪褐条斑病(Cercosporidium graminis)、禾单隔孢(Scolicotrichum graminis)、小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria herpotrichoides)、小球腔菌属病菌(Leptosphaeria herpotrichoides)、小麦散黑穗病(Ustilago tritici)、微座孢属斑病(Microdochium nivale)、雪腐镰孢(Fusarium nivale)、小麦雪霉病(Monographella nivalis)[有性型]、麦类白粉菌(Erysiphe graminis)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、强雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、禾生腐霉(Pythium graminicola)、终极腐霉(Pythium ultimum)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)[无性型]、黑麦壳针孢(Septoria secalis)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、叶枯菌(Mycosphaerellagraminicola)[有性型]、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)、白粉菌属(Blumeria spp.)、小麦纹枯病(Ceratobasidium cereale)[有性型]、雪腐大粒菌核病(Myriosclerotiniaborealis)、白霉病菌(Sclerotinia borealis)、小麦雪腐病(Typhula idahoensis)、雪霉病(Typhula incarnate)、雪腐病核瑚菌(Typhula ishikariensis)、雪腐病核瑚菌变种黄花(Typhula ishikariensis var.canadensis)、颖枯壳针孢(Stagonospora nodorum)、狗牙根壳针孢(Septoria nodorum)、菜豆褐斑病菌(Phaeosphaeria nodorum)[有性型]、颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)、隐条黑粉菌(Urocystis occulta)、秆锈菌(Pucciniagraminis)、黄曲霉属(Aspergillus spp.)、球黑孢霉属(Nigrospora spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、小麦基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)、塔普斯梭状芽胞杆菌(Tapesia acuformis)[有性型]、条锈病(Uredoglumarum)[无性型]、小麦黄斑病真菌(Pyrenophora tritici-repentis)、小麦德氏霉(Drechslera tritici-repentis)[无性型]、壳针孢叶枯病(Helminthosporium tritici-repentis)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、腐霉属(Pythium spp.)、大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)、小麦条锈病(Puccinia striiformis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)和小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)。
优选地，植物病原体是隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)、小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)、秆锈菌(Puccinia graminis)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、腐霉属(Pythiumspp.)、大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)、小麦条锈病(条锈菌，Pucciniastriiformis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)或小麦冠腐病菌(假禾谷镰刀菌，Fusarium pseudograminearum)。在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属选自由以下组成的组：黑麦(普通黑麦，Secale cereale)、山黑麦(Secale montanum)、山地黑麦(Secale strictum)、森林黑麦(Secale sylvestre)和瓦维洛夫黑麦(Secale vavilovii)。优选地，黑麦属是黑麦(普通黑麦)。
在第三方面，本发明涉及一种制备稳定的宿主植物/禾本科植物类内生真菌组合的方法，包括使用与接种植物形成稳定组合的至少一种内生真菌来人工地感染黑麦属植物，其中所述宿主植物没有显示出内生菌感染的外部症状。
在一个实施方式中，稳定的植物/真菌组合是足够稳定的以允许内生菌的垂直传播(vertical transmission)。在一个实施方式中，垂直传播通过分蘖(tiller)进行，特别是通过花的分蘖进入种子，或者通过繁殖进行。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
在一个实施方式中，内生菌的垂直传播导致内生菌从第一代到第二代宿主植物的垂直传播。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
在一个实施方式中，该方法还包括从感染的宿主植物的群体中选择没有显示出内生菌感染的外部症状的黑麦宿主植物的步骤。
在第四方面，本发明涉及一种对宿主黑麦属植物赋予至少一定程度的害虫防护的方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种禾本科植物类内生真菌，其中，内生真菌-黑麦植物组合产生了足以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护水平的至少一种生物碱。
在第五方面，本发明涉及一种对宿主黑麦属植物赋予害虫防护的方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种禾本科植物类内生真菌，其中，内生真菌-黑麦植物组合产生了赋予宿主植物所述害虫防护的至少一种生物碱。
在第四或第五方面的一个实施方式中，所述至少一种生物碱是选自由以下构成的组中的生物碱：波胺(peramine)、N-乙酰基降黑麦草碱(N-acetylnorloline)、黑麦草碱(loline)、N-甲酰基黑麦草碱(N-formylloline)、N-乙酰基黑麦草碱(N-acetylloline)和N-甲基黑麦草碱(N-methylloline)。
在第四或第五方面的一个实施方式中，所述至少一种生物碱是黑麦草碱或波胺或两者。
在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以至少25ug/g的水平产生。
在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以用于黑麦草碱的如表7中所示的水平产生。
在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以至少25ug/g至大约3660ug/g的范围产生。
在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以至少1ug/g的水平产生。
在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以用于波胺的如表7中所示的水平产生。
在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以至少1ug/g至大约45ug/g的范围产生。
在一个实施方式中，该方法还包括选择内生真菌-黑麦植物组合的步骤，该内生真菌-黑麦植物组合产生了水平足以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护的至少一种生物碱。
在第六方面，本发明涉及一种感染了禾本科植物类内生真菌的黑麦属种子。优选地，黑麦属种子是选自由以下组成的组中的黑麦属的种子：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。更优选地，种子是黑麦的种子。
在如上所述的本发明的第三、第四、第五或第六方面中的任一个的一个实施方式中，黑麦属选自由以下组成的组：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。优选地，黑麦属是黑麦。
在如上所述的本发明的第三、第四、第五或第六方面中的任一个的一个实施方式中，至少一种内生真菌是从披碱草属中分离的内生菌。
优选地，内生真菌从披木芙蓉中分离。优选地，内生真菌是禾本科植物类内生菌。优选地，禾本科植物类内生菌选自由以下组成的组：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合。优选地，本发明涉及菌株AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074和AR3078，优选地AR3046、AR3050或AR3068。
本发明的其他方面可从以下仅通过举例并参照附图给出的描述中显而易见。
附图说明
现在将仅通过举例并参照附图来描述本发明，在附图中：
图1示出了根据如表2中列出的SSR等位基因大小的亲缘关系的树形图。
图2示出了黑麦品种Rahu的四种植物；一种是未感染的(E-)；并且三种感染了AR3046。从左至右为：正常、矮化和发育迟缓的形态。E-和AR3046感染的正常和矮化植物表现出花香出现，发育迟缓的植物没有。
图3示出了在感染了AR3046内生菌的黑麦品种Rahu植物(Rahu AR3046)上以及在未感染植物(无Rahu(Rahu Nil))上观察到的分泌物的量或吹沫虫/植物的数量。还示出了在感染了其天然存在的内生菌的牛尾草(草甸羊茅(Festuca pratensis syn)、黑麦草(Lolium pratense syn)、长花序亚属羊茅(Schedonorus pratensis))植物上，羊茅属植物(Neotyphodium uncinatum)(MF E+)和在未感染植物(MF E-)上观察到的分泌物的量或吹沫虫/植物的数量。
图4示出了在双培养中显著(P≤0.05)抑制了禾谷镰孢菌(禾谷镰刀菌，Fusariumgraminearum)的菌丝体生长的某些内生菌菌株(来自AgResearch有限公司Stuart Card的未发表研究的数据)。
图5示出了在双培养中显著(P≤0.05)抑制了立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌丝体生长的某些内生菌菌株(来自AgResearch有限公司Stuart Card的未发表研究的数据)。
具体实施方式
定义
给出以下定义，以更好地定义本发明并在本发明的实践中作为本领域普通技术人员的指导。
除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语应当理解为具有本公开所属相关领域的普通技术人员所理解的相同含义。植物学、微生物学、分子生物学和生物化学中的常见术语的定义的实例可以在以下中找到：Biology of Plants,Raven et al.(eds.),W.H.Freeman and Company,(2005)；Plant Physiology,Taiz et al.(eds.),Sinauer Associates,Incorporated,(2010)；Botany:An Introduction to PlantBiology,J.D.Mauseth,Jones&Bartlett Learning,(2003)；Methods for General andMolecular Microbiology,3rd Edition,C.A.Reddy,et al.(eds.),ASM Press,(2008)；微生物学百科全书(Encyclopedia of Microbiology),2nd ed.,Joshua Lederburg,(ed.),Academic Press,(2000)；Microbiology By Cliffs Notes,I.Edward Alcamo,Wiley,(1996)；微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology),Singleton et al.(2d ed.)(1994)；微生物生物学(Biology ofMicroorganisms)11th ed.,Brock et al.,Pearson Prentice Hall,(2006)；真菌的生物多样性(Biodiversity of Fungi):Inventory and Monitoring Methods,Mueller etal.,Academic Press,(2004)；Genes IX,Benjamin Lewin,Jones&Bartlett Publishing,(2007)；分子生物学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Biology),Kendrew etal.(eds.),Blackwell Science Ltd.,(1994)；分子生物学与生物技术(MolecularBiology and Biotechnology):a Comprehensive Desk Reference,Robert A.Meyers(ed.),VCH Publishers,Inc.,(1995)；草与种传内生真菌的共生(Symbioses of grasseswith seedborne fungal endophytes).Schardl CL et al.(2004)Annual Review ofPlant Biology 55:315-340；以及禾本科植物类的化学型多样性、草的真菌共生体(Chemotype diversity of epichloae,fungal symbionts of grasses),Schardl CL,Young CA,Faulkner JR,Florea S,Pan J(2012)Fungal Ecology 331-344(Schardl etal.,2012)。
还应该相信，可以利用标准的植物学、微生物学、分子生物学和生物化学协议和本领域已知的并且例如如在以下中所描述的程序：Methods of Studying Root Systems,vol.33,WolfgangSpringer-Verlag,(1979)；Root methods:A Handbook,AlbertL.Smit Springer,(2000)；Biodiversity of Fungi:Inventory and MonitoringMethods,Mueller et al.,Academic Press,(2004)；Environmental Microbiology:Methods and Protocols,J.F.T.Spencer et al.,Humana Press,(2004)；EnvironmentalMicrobiology,P.D.Sharma,Alpha Science International,(2005)；EnvironmentalMicrobiology,J.R.Leadbetter,Gulf Professional Publishing,(2005),MolecularCloning:A Laboratory Manual,Maniatis et al.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,(1982)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ed.),Sambrook et al.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,(1989)；分子克隆技术的指导(Guide to MolecularCloning Techniques)Vol.152,S.L.Berger and A.R.Kimmerl(Eds.),Academic PressInc.,(1987)；禾草内生真菌的生物技术(Biotechnology of Endophytic Fungi ofGrasses).1994Bacon和White(Eds.)以及本公开所属领域中相关的其他常用的参考资料来执行本发明的实践，并且通过引用将它们的全部内容均结合于本文。
如本文所使用的术语“植物”包括整个植物和来自植物生命周期的所有阶段的植物的所有部分，这些阶段包括但不限于营养和生殖细胞和组织、繁殖体、种子、胚胎、芽、茎、叶、叶鞘和叶片、花序、根、花药、叶舌、栅栏、叶肉、表皮、耳廓、内稃(palea)、外稃(lemma)和分蘖。
如本文所使用的术语“禾本科植物类(epichloae)”是指含有两个属(genera)的内生真菌的内生真菌的集体组：变形形态属Neotyphodium(羊茅属，禾本草属)的成员和有性属(香柱菌属)的成员。
如本文所使用的术语“禾本科植物类内生菌”是指本领域已知的或本文已经示出的与宿主植物形成共生体的“禾本科植物类”组的内生菌。
如本文所使用的术语“赋予至少一定程度的害虫防护”涵盖可显著降低害虫对黑麦属植物的发病率、严重程度和/或持续时间。优选地，可显著降低(可测量的降低，measureable reduction)是在统计学上具有0.05或更小的P值的显著减少。
如本文参照生物碱的水平所使用的术语“足以赋予害虫防护的水平”是指根据本发明由植物-内生菌共生体产生的对感染了内生真菌的黑麦属宿主植物的虫害感染或不利影响足以产生发生率、严重程度或持续时间的可显著降低的生物碱的任何水平。优选地，生物碱是波胺或黑麦草碱或黑麦草碱衍生物。优选地，可显著降低是在统计学上具有0.05或更小的P值的显著减少。
如本文所使用的术语“统计学上显著”指的是由除随机机会外的其他原因造成的结果或关系的可能性。结果可以利用统计假设检验而被认为是在统计学上显著，如本领域已知和使用的。统计假设检验提供如本领域已知的“P值”，其表示仅由于随机而造成的所测得结果的概率。被认为是本领域普遍接受的是，5％(0.05)或更低的显著水平被认为是统计学上显著的。
如本文所使用的术语“增强的害虫防护”是指赋予共生体中的黑麦属植物的害虫防护的水平，其中与对缺乏内生真菌(对照植物)的黑麦属植物和/或具有不同内生真菌的黑麦属植物的同样虫害、感染或有害影响的发病率、严重程度和/或持续时间相比，由于给定害虫的存在和/或活性，禾本科植物类内生真菌降低了对植物的虫害、感染或有害影响的发病率、严重程度和/或持续时间。
如本文所使用的术语“人工感染”和“人工接种”包括用内生真菌对植物的任何接种，特别是黑麦属植物，特别是黑麦，以形成本质上未知的植物/真菌共生体。
如本文所使用的术语“植物中(在植物体内，原位，in planta)”在内生真菌的背景下是指当其在宿主植物内共生地生活时的内生菌。
如本文所使用的术语“稳定的植物/真菌共生(fungal symbiosis)”是指在植物的整个生命周期内持续存在的共生体，其中植物没有显示出内生菌感染的外部症状。在“稳定的共生组合”中，宿主植物在第一代感染了内生菌并且产生种子，所述种子在发芽时成长为也感染了内生菌的第二代宿主植物。
如本文所使用的术语“正常的生命周期”是指黑麦的正常生殖周期，其包括第一代植物的生长，以产生发芽时成长为第二代植物的种子。
如本文参考包括内生真菌的宿主植物所使用的术语“没有显示出内生菌感染的外部症状”是指宿主植物具有如本领域已知的用于该宿主植物的基本上正常的形态学表型。其中，如本文所使用的宿主植物的“基本上正常的形态学表型”是指如本领域中已知和普遍接受的用于该宿主植物在给定的一组生长条件下的该宿主植物的典型形态。
如本文所使用的宿主植物的术语“正常表型”是指如在宿主植物的生命周期过程中所显示的宿主植物的典型形态、生长和其它表型特征，包括如本领域已知和普遍接受的用于不包含内生菌时的该宿主植物的宿主植物生殖周期和宿主植物种子。
如本文所使用的针对宿主植物的术语“异常表型”是指在宿主植物生命周期的任何阶段的宿主植物的形态、生长或其它表型特征，包括作为典型或在对于宿主植物的通常观察范围内的不同于本领域已知和普遍接受的宿主植物生殖周期和宿主植物种子。如本文所使用的针对宿主植物的术语“异常表型”可以包括发育不完全的植物或矮小植物或具有明显可见的内生菌感染的外部证据的植物或未能通过种子完成正常生殖的植物，但不限于此。
如在本说明书中使用的术语“包括”是指“至少部分地由…组成”。当解释本说明书中的包括该术语的语句时，每个语句中的由该术语开头的特征都需要存在，但也可以存在其他特征。以相同的方式来解释相关的术语，诸如“包括”和“包含”。
旨在提及本文所公开的数字的范围(例如，1至10)还结合引用在该范围内的所有有理数(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，7，8，9和10)以及在该范围内的任何范围的有理数(例如，2至8，1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，明确地在此公开的所有范围的所有子范围被在此明确地公开。这些仅仅是具体意图的示例，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为在本申请中以类似的方式被明确陈述。
详细描述
许多冷季型草(禾本科，早熟禾亚科)具有因它们的生物保护性而已知的种传禾本科植物类内生真菌，并且尤其是因抗虫害生物碱的生产而已知的，诸如黑麦草碱(lolines)(Zhang等人，2010)和波胺(peramine)(Koulman等人，2007)。无性禾本科植物类(Neotyphodium物种)主要或完全垂直传播，而相关的物种的性结构(基质)可以产生可水平传播的孢子(子囊)(Zhang等人，2010)。
大多数Neotyphodium物种被认为与属的物种密切相关。许多Neotyphodium物种可能通过包括种间杂交的过程已经从进化(Tsai等人，1994)。基于分子系统发育学证据，一些作者认为无性羊茅属(Neotyphodium)或者从个体物种衍生，或者从共享至少两个祖先属物种的杂种衍生(Tsai等人，1994；Moon等人，2004)。目前的分类学认为，变形形态属Neotyphodium的成员与有性属内的成员非常密切相关(Glenn等人，1996)。遵循先前的植物命名代码，形态属是指无性孢子或植物状态，并且有性属是指性状态。目前，植物命名代码用单个命名协议处理单个真菌(Miller等人，2011)。总的来说，这两个属，Neotyphodium和在本领域中被称为“禾本科植物类”内生菌。
禾本科植物类真菌和宿主禾草之间的共生体是很常见的，并且分子系统发育学证据表明，在这些共生体中所观察到的物种特异性是由于这些组(group)的植物和内生真菌的共同进化的结果(Schardl等人，2008)。
现代驯化谷物不会被禾本科植物类内生菌自然感染，但一些野生型亲属可能会被感染(Marshall等人，1999)。不希望受到理论的束缚，本发明人认为，在现代谷物的进化过程中，农业实践(诸如存储种子)可能已导致历史联系的损失，如果它们存在的话(Welty等人，1987)。
禾本科植物类内生真菌和宿主植物(其不是真菌的天然宿主)之间的稳定植物/真菌共生体的建立既是有问题的又是不可预测的(Simpson和Mace，2012)。
这被认为是由于形成这种共生体时的要求，以便在可以包括生态、生物化学和/或分子不兼容性的伙伴(partner)之间成功整合多个生物学变量(Christensen等人，2000)。本公开内容详细介绍了大量的所需要的研究，包括重大试验和试错实验，以开发成功的协议和程序，通过所述协议和程序，建立禾本科植物类内生真菌的某些菌株与黑麦属宿主植物(其不是这些真菌的天然宿主)之间的稳定共生体。
令人惊讶的是，发明人已经确定人工接种可以用于建立一些禾本科植物类内生真菌和黑麦属宿主植物之间的稳定的植物/真菌共生体。通过使用本文所描述的本发明的方法，发明人能够生产与感染真菌形成稳定共生体的受感染的黑麦属宿主植物，所述感染真菌允许受感染的植物通过正常的生命周期进展，和/或其中受感染的植物没有显示出内生菌感染的外部症状。此外，发明人已经发现，这种共生体的建立可以在至少一种黑麦草碱生物碱、黑麦草碱生物碱衍生物、或波胺、或它们的组合的植物的生产方面对宿主植物提供至少一定程度的好处，其可以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护。
发明人已令人惊讶地确定取自谷物的野生亲属的某些内生真菌菌株适于与黑麦属宿主植物(特别是黑麦)建立稳定的植物/真菌共生体。特别是，发明人已经建立了导致内生真菌/黑麦属宿主植物组合的共生体(symbiotic association)，其与黑麦属对照植物(即，未感染同样的共生禾本科植物类真菌菌株的同样的黑麦属植物)相比，可以具有至少一定程度的增强的害虫防护。不希望受理论的束缚，发明人相信，在产生某些生物碱，尤其是黑麦草碱、黑麦草碱衍生物和/或波胺的内生真菌/宿主植物组合中，增强的害虫防护是可以预料的。因此，发明人相信，由禾本科植物类内生真菌或内生真菌/宿主植物组合生产黑麦草碱和/或波胺生物碱(多种)对宿主植物提供至少一定程度的增强的害虫防护。特别是，遵循在此公开的本发明的内生菌菌株的使用和方法，发明人已经确定，与黑麦对照植物相比，被禾本科植物类内生真菌的某些菌株感染的黑麦属宿主植物，特别是黑麦宿主植物，具有增强的抵御线虫防护。
一般来说，宿主植物与它们的禾本科植物类内生真菌之间形成的共生体基于导致对于内生菌和宿主两者而言具有高度物种特异性的复杂且亲密的生物相互作用(Simpson和Mace，2012)。
作为长期研究方案的结果，申请人已首次确定了能够与黑麦属宿主植物形成稳定的植物/真菌共生体的禾本科植物类真菌。申请人已进一步确定了在与黑麦属宿主植物(特别是黑麦宿主植物)共生时能够赋予被感染宿主植物的内生菌，与未感染的对照植物相比，具有产生一种或多种已知生物碱的能力，以对植物提供至少一定程度的增强的害虫防护。具体地，一种或多种生物碱可以是黑麦草碱、黑麦草碱衍生物或波胺生物碱。
因此，在一个方面，本发明涉及一种选自由以下组成的组中的禾本科植物类内生真菌的分离菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合。在一个实施方式中，分离菌株在生物学上是纯的。优选地，本发明涉及菌株AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074和AR3078，优选地AR3046。
根据用于专利程序的布达佩斯条约，上述内生真菌菌株保藏在伊利诺斯州皮奥里亚市1815北大学街，美国农业部农业研究服务中西部地区农业应用研究国家中心，61604-3902(The United States Department of Agriculture,Agricultural ResearchService Midwest Area,National Center for Agricultural Utilization Research,1815North University Street,Peoria,Illinois,61604-3902,USA)，对于菌株AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)和AR3050(NRRL#50578)于2011年10月13日保藏；对于菌株AR3039(NRRL#50716)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)于2012年3月6日保藏。
内生菌是从披碱草属(包括批木芙蓉)分离出来的，从吉尔吉斯斯坦、哈萨克斯坦、前苏联和俄罗斯的各地获得，如表6所示。
上述内生菌是从被内生菌感染的披碱草属(包括批木芙蓉)、如所述的遵循植物组织的表面消毒的植物分离出来的(Christensen等人，2002)。
一旦分离，可以利用如本领域已知的和如本文所公开的包括在实例中的标准技术来培养所分离的和/或生物学上纯的内生真菌。
在一个实施方式中，在抗生素马铃薯葡萄糖琼脂(ABPDA)中在20℃至25℃之间培养内生真菌，优选地在21℃至23℃之间。对于内生真菌生长的最佳温度是22℃。在高于或低于该范围的温度下内生真菌的生长也是可能的，但生长可能降低，或者可能完全停止。在一个实施方式中，在黑暗中培养内生真菌。
本发明还涉及一种保护黑麦属植物免受害虫的方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种禾本科植物类内生真菌，其中植物中的内生真菌产生足以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护水平的至少一种生物碱。在一个实施方式中，所述至少一种生物碱是选自由以下组成的组中的生物碱：波胺、N-乙酰基降黑麦草碱、黑麦草碱、N-甲酰基黑麦草碱、N-乙酰基黑麦草碱和N-甲基黑麦草碱。
可以利用已发芽(发育，生长)约两周的黑麦属幼苗进行接种。优选地，幼苗已发芽(发育)4至9天。
在该范围以外，幼苗仍可以形成有效的关联，但在某些情况下对于建立内生真菌而言可能太小或太老。种子必须不含非靶向的真菌和细菌，以确保幼苗不被微生物污染战胜。
在一个实施方式中，可利用黑麦属幼苗的基础接种进行人工接种。为了有效地建立真菌共生体/黑麦属宿主植物的关联，内生菌的接种应该通过切开植物和插入所培养的真菌菌丝体而进入宿主植物分裂组织内。
对本领域中熟悉天然抗病虫害和禾草保护技术人员而言已知的是，与宿主禾草植物共生成长的禾本科植物类内生菌可以赋予该组合一定的免受虫害。尤其已知的是，黑麦草碱生物碱和生物碱波胺赋予一定的这种防护，而不会对消耗草或消耗间接来自草消耗的产品的哺乳动物或人类造成显著或已知的毒性。
黑麦草碱是一组分享独特的化学和生物特性的相关的生物活性的天然产物。黑麦草碱是生物碱，即含有碱性氮原子的有机化合物，并且在化学上被定义为具有连接两个环(C-2至C-7)碳的内部醚桥的饱和1-氨基吡咯啶类(1-氨基吡咯双烷类，1-aminopyrrolizidines)。在有机化合物中不常见的内部醚桥被认为是该组的标识特征。具体的黑麦草碱包括降黑麦草碱(norloline)及其1-氨基部分为黑麦草碱(具有甲基基团)、N-甲基黑麦草碱(具有两个甲基基团，NML)、N-乙酰基降黑麦草碱(具有乙酰基，NANL)、N-乙酰基黑麦草碱(具有甲基和乙酰基，NAL)和N-甲酰基黑麦草碱(具有甲酰基，NFL)的衍生物(Schardl等人，2007；Schardl等人，2012)。
黑麦草碱一般被称为在被禾本科植物类内生真菌共生体(Neotyphodium属))感染的草内产生的杀虫和威慑害虫的化合物。黑麦草碱已被证明能增加宿主草植物对害虫取食的抗性(Bush等人，1997)。具体的黑麦草碱在针对特定害虫的生物活性研究方面可能具有一些变化。还已经提出，黑麦草碱的存在可提供宿主植物一定程度的环境应力的保护，包括干旱和空间竞争(Malinowski和Belesky，2000)。
黑麦草碱生物碱可以通过内生真菌或宿主植物在共生组合中生产。重要的是通过组合产生黑麦草碱生物碱，其中通过在植物组织上或之内的内生真菌的存在而在组合中诱导所述生产，特别是通过植物细胞之间的真菌菌丝的存在。在历史上，允许体外黑麦草碱生物碱的生产的在共生体中经历的条件的再现这被认为是非常困难的(Porter，1994)。因此，直到最近才知道的是，所观察到的在这些共生组合(共生体，symbiotic association)中产生的黑麦草碱生物碱由内生真菌自身产生，或者它们在植物中响应于感染而合成。只是Blankenship等人(2001年)最近的工作才证明了，内生真菌Neotyphodium uncinatum可以在化学上定义的生长培养基中产生黑麦草碱。这项工作表明，内生菌在其天然存在的宿主草中也是黑麦草碱的生产者(Blankenship等人，2001)。天然存在的禾本科植物类的直接化学分析也证明了该效果(Schardl等人，2007)。
波胺(一种吡咯并吡嗪类生物碱)是由内生菌和植物的某些组合产生的生物活性的生物碱(Schardl等人，2012)。波胺生产已被证明依赖于内生菌来源的至少一种基因的功能(Tanaka等人，2005)。波胺已被证明是会引起对植物破坏的某些昆虫的取食抑制剂，并且可以赋予感染内生菌的植物一定防护而不被某些昆虫侵染(Rowan和Latch，1994)。
本发明还涉及一种制造稳定的宿主植物/禾本科植物类内生真菌组合的方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种内生真菌，该内生真菌与接种植物形成稳定的组合，其中宿主植物未显示出内生菌感染的外部症状。这意味着，在建立组合之后，被感染的黑麦属宿主植物表现出如本领域已知的对黑麦属而言正常的形态表型，并且对于发现组合的生长条件将是预期的。
在一定条件下，作为一种宿主植物物种或菌株的专性共生体的内生真菌可以被引入到不同的宿主植物物种或菌株中，以形成通常在自然界中不被发现的组合。然而，这样的组合可能是不稳定的，并且与或者未感染或者包含天然存在的共生体的同一菌株或物种的宿主植物相比，导致具有异常表型的宿主植物，即，异常的形态和/或生理特征。异常表型特征可以包括矮化植物(Simpson和Mace，2012)、附生显着增长的植物(Christensen等人，2012)、维管束定植(Christensen等人，2001)和本地化的细胞死亡(Christensen，1995)。
申请人第一个提供了黑麦属宿主植物和禾本科植物类内生真菌之间的稳定共生组合，其导致未显示出内生菌感染的异常影响的稳定的植物/真菌组合。本文所提供的稳定的共生组合可以表现出正常的形态表型以及完整且正常的生殖周期。
在一个实施方式中，稳定的共生组合足以允许内生菌的垂直传播。在一个实施方式中，垂直传播通过花的分蘖进行，并随后产生种子。在一个实施方式中，内生菌的垂直传播是从第一代宿主植物到第二代宿主植物。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
在一个实施方式中，宿主植物是选自由以下组成的组中的黑麦属：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。优选地，宿主植物是黑麦。
本发明还涉及能够赋予黑麦属宿主植物抗感染的内生菌，对内生菌/植物组合而言的一种能力，以产生黑麦草碱、黑麦草碱衍生物和/或波胺生物碱中的一种或多种。
本发明还涉及一种被至少一种禾本科植物类内生真菌感染的黑麦属植物的种子。优选地，禾本科植物类内生菌从披碱草属中分离。优选地，内生真菌从批木芙蓉中分离。优选地，禾本科植物类内生菌选自由以下组成的组：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)，以及它们的组合。优选地，本发明涉及菌株AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074和AR3078，优选地AR3046。
优选地，黑麦属种子是黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦种子。更优选地，所述种子是黑麦种子。
现在将参考以下实施例以非限制性方式来说明本发明的各个方面。
实施例
实施例1
内生真菌菌株的检测
从各种来源获得超过580个登记(登录)的披碱草属种子，并且在种子的数量允许的情况下，检查可达约50个独立种子或幼苗感染有内生菌。通过Simpson等人(2012)的方法来确定生长至两个或更多个分蘖阶段的幼苗的叶鞘内的活内生菌。约6％的登记被示出，以产生含有活内生菌的至少一个幼苗，其可以进一步探讨作为以下实施例的一部分。
实施例2
内生真菌菌株的遗传变异的检测
为了从含有活内生菌的那些披碱草属中集中选择内生菌菌株，这可能是进一步感兴趣的，用于每个登记的多达6个植物的内生菌被部分地表征和加以分辨，以便利用表1的引物序列，基于衍生自多达8个所选的简单序列重复(SSR)标记基因座的基因数据，经DNA“指纹图谱”进行遗传变异。这些引物序列以前已经被证明，以当内生菌在植物中时通常扩增禾本科植物类内生菌多态性DNA序列。
利用基底分蘖的约100mg鲜重样品来提取总基因组DNA(植物+内生菌)，接着是如制造商所推荐的FastDNA试剂盒(Bio101，Vista，加利福尼亚州)的植物DNA分离过程。
利用两个聚合酶链反应(PCR)协议(表1)中的一个，用寡核苷酸引物对进行SSR扩增。在这两个协议中，利用iCycler热循环仪(BioRad，Hercules，加利福尼亚州，美国)进行PCR。
协议1如所描述的(Moon等人，1999)，不同之处在于，使用60℃的退火温度。在这个协议中，用荧光团6-FAMTM在5'末端对正向引物进行标记(Applied Biosystems，福斯特城(Foster City)，加利福尼亚州)。
在协议2中，用21个核苷酸的M13尾序列在5'末端(5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3')(SEQ ID NO：1)合成正向引物，以通过6-FAMTM标记的M13引物帮助PCR产物的通用标签(Schuelke，2000)。用序列5'-GTTTCTT-3'(SEQ ID NO：2)在5'末端合成反向引物，以促进PCR产物的3'末端处的非模板腺苷酸化(Brownstein等人，1996)。使用10μL的PCR反应体积，含有约10ng的总基因组DNA、2.5mM的氯化镁、1×PCR的缓冲液、0.05mM的每种dNTP、0.0375μM的正向引物、0.15μM的反向引物、0.15μM的荧光标记的M13引物和0.75U的铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚州)。利用以下分布进行PCR：(1)94℃4:00分钟，(2)30次循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，(3)8次循环：94℃30秒、53℃30秒和72℃30秒，(4)72℃30分钟(Schuelke，2000之后)。
使用具有POP-7TM聚合物的22cm毛细管阵列(Applied Biosystems)在ABI3100遗传分析仪上通过毛细管电泳法对PCR产物进行分析。使用GS500LIZ(Applied Biosystems)作为内部尺寸标准。使用ABI棱镜基因扫描仪(ⅴ3.7，Applied Biosystems)对电泳图进行分析，并使用ABI棱镜基因测试仪(Prism Genotyper)(ⅴ3.7，Applied Biosystems)对基因型数据进行评分。
然后通过进行化学分析对以上检查的植物进一步表征。六个感染的幼苗被进一步检查生物碱的存在，可归因于内生菌的存在，如吲哚双萜、麦角生物碱、波胺和黑麦草碱。利用为多态位点SSR基因座(位点)选定的引物，对每种真菌基因型的代表抽样，以便进行更详细的基因分型。
表2和图2中的结果表明，本发明的内生菌属于表2中的单个分支指定组1，并且可以表征为对于表1和表2中列出的SSR基因座共享SSR等位基因大小的至少大部分。表2、表3和图2中的其它内生菌是用于说明不符合本发明要求的不同内生菌种类的发生和关系的目的的实例。
表1 SSR引物序列
表2 SSR等位基因大小
1等位基因大小+/-0.5bp
2对于除B10外的所有SSR基因座，产品尺寸包括大约25bp，由于M13和“猪尾”序列
3组1＝AR3039、3046、3049、3050、3064、3067、3068、3073、3074、3076和3078
4组2＝AR3002、3005、3015、3017和3020
实施例3
内生真菌菌株的分离
真菌是从大量被内生菌感染的植物分离的，接着是植物组织的表面灭菌，如本领域公知的，特别是如Christensen等人(2002)描述的。通过在基部切割并在表面灭菌前修剪至约5cm，从植物中除去分蘖。通过用96％的乙醇快速冲洗并在10％的漂白溶液中浸泡1分钟，随后在无菌水中漂洗两次，对切片后的分蘖进行表面灭菌。对分蘖进行横向切片；分离鞘环，并置于5μg/ml的四环素抗生素马铃薯葡萄糖琼脂(ABPDA)中。将培养皿在黑暗中在22-25℃孵育3-5周。可以是在相同的培养基上次培养培养物。
检查培养物的菌落生长速率、菌落形态、产生分生孢子的能力、分生孢子的尺寸范围、β-微管蛋白基因的序列(tub2)(Moon等人，2004)和其他描述特征，所有这些都被考虑，以便选择内生菌用于进一步检查。
以本实施例的方式制备和有时次培养的所选培养物被用于测试黑麦幼苗的接种和可能持久的感染，如下面所描述的。
实施例4
内生菌的描述
在PDA上生长时的体外特征与羊茅属(Neotyphodium)的描述一致(Christensen等人，1993；Glenn等人，1996)，即，对适度缓慢生长而言是缓慢的，在PDA上4周之后变化。从琼脂出现菌落，白色的，絮状的，轻微到强烈地盘绕状，毡状，具有丰富的气生菌丝。菌落反向晒成棕褐色，在边缘呈膏状。产孢细胞是孤立的，从菌丝垂直产生，在底部更宽，而在尖端渐缩。瓶梗式分生孢子(phialidic conidia)是透明的，光滑的，从舟形到月形，2.05-14.96μm长×1.37-8.19μm宽。没有一个分离是无菌的。每个菌株的个体特征列于表3中。
表3分生孢子和菌落大小
实施例5
使用β-微管蛋白基因序列来确定内生菌与已知的物种的关系
草的内生真菌可以是物种或Neotyphodium物种。一些但不是所有的Neotyphodium物种显然是源自两种或更多种物种的杂种，如通过比较所选的基因序列而主要公开的(Moon等人，2004)。
对于一些用于内生菌的SSR分析的基因座(如在以上实施例2中)而言，多个等位基因的存在可能表明它们所属的分支有可能成为混合来源。
来自内生菌的三个实例的tub2的基因序列，使用Moon等人(2004)的方法的微小变化检查本申请的AR3039、AR3046和AR3064，以便确定内生菌源自于的一个或多个可识别物种的可能性。也类似地检查了明显不同分支的四种其他内生菌，以表明它们与已知的物种的关系。
改变用于PCR扩增的引物和条件从而更好地确保tub2的多个等位基因在所有的样品中都可以观察到，混合来源被认为是可能的或可行的。所选的引物序列为正向引物TCGGCC TCA CGA CGC ACA AC(RJ251-F)(SEQ ID NO:29)和反向引物CCC ATA CAT TAC ACCTTT CTG GCG(RJ252-R)(SEQ ID NO:30)，这些引物被选择，以便从基本上对应于并且包括所报告的对应序列的披碱草属得到内生菌的PCR产物，并且用于确定和Neotyphodium内生菌与它们的杂交种的关系(Moon等人，2004)。如下进行PCR：初始步骤为95°(3分钟)；95°(30秒)、62°(30秒)、72°(45秒)下35次循环；最后步骤为72°(5分钟)。
在ABI PRISM 3700DNA分析仪(Applied Biosystems)上通过Sanger(1997)的方法对PCR产物进行测序。包含多个重叠峰的序列被认为是来自于杂种，而那些不包含多个重叠峰的被认为来自于非杂种。
当指示多于一个序列时，使用TA试剂盒(具有2.1-矢量)(Invitrogen)进行PCR扩增子的克隆。多达10个克隆被测序，如上所述，并且使用Vector NTI Advance 11(Invitrogen)的对齐X模块与个体tub2等位基因的序列对准。
个体tub2等位基因被分配给最接近的非杂交物种如下：使用Dialign-TX(Subramanian等人，2008)对准序列，并且使用Phylip软件套件(Felsenstein，2005)从这种对准建立最大似然树。为了创建最终的树，运行程序DNAML，每组使用1000个引导程序和三个随机的序列输入顺序，并缩减为使用多数规则方法的单个一致树。对于所选的内生菌已知的物种的最接近原因，使用Dendroscope(Huson等人，2007)准备树。
本申请的内生菌AR3039、AR3046和AR3064得到与作为E.bromicola(雀麦属)和E.amarillans的杂种的内生菌一致的两个Tub2序列。这是一个至今未报告的杂种并且可以被认为是一个用于本指定E.bromicola x amarillans的新物种。
内生菌菌株AR3049、AR3050、AR3067、AR3068、AR3073、AR3074和AR3078通过SSR分析与AR3039、AR3046和AR3064密切成组(图1)，并且也可以被认为是最有可能成为E.bromicola x amarillans。对比测试中的其他内生菌中的三个被认为仅与E.bromicola成组，且另一个内生菌与E.yangzii成组，这些是其他内生菌群体的代表，与从披碱草属来源观察到的SSR基因型具有共享模式。
一起考虑SSR和β-微管蛋白的数据表明，内生菌菌株AR3039、AR3046、AR3049、AR3050、AR3064、AR3067、AR3068、AR3073、AR3074和AR3078形成一组有代表性新特征的内生菌，这些内生菌可以被认为是可以从它们的天然宿主植物转移到备用宿主(黑麦)的功能性分支，形成人工创造的稳定的共生黑麦/内生菌组合，其中被感染的黑麦宿主呈现出正常的生长，并且具有正常的生命周期。
实施例6
将禾本科植物类内生真菌接种到黑麦中
黑麦种子，品种Rahu、Amilo和“KWS”，以及从Dr Mark Newell，罗伯茨塞缪尔贵族基金会(The Samuel Roberts Noble Foundation)获得的黑麦品种(NF95307A、NF95319B、97326、Bates RS4、或MATON2)的选择被表面消毒和接种，如Latch和Christensen(1985)所描述的。通过以下对种子进行表面消毒：浸没在50％硫酸溶液中15分钟，接着是用自来水冲洗五次，然后浸没在10％家用漂白(Janola)溶液中15分钟，接着是用无菌水冲洗2次。在置于4％的水琼脂培养皿中之前，在层流柜中在无菌Whatmann滤纸上干燥种子。培养皿上的种子在黑暗中在22-25℃下发芽4-9天，并且对所得到的黄化幼苗接种，之后返回到黑暗培养箱中7天。在此之后，将该培养板放置在白色荧光灯下至少7天，之后除去幼苗并将它们种植在商业盆栽组合中且在温室中成长。在识别被感染的个体前，植物生长约6周。通过Simpson等人的方法(2012)对被感染的植物进行鉴定。植物在温室中进一步生长，以与典型的未受感染植物比较而检查被感染植物的植物表型，特别是确定是否将形成花序和种子头。
对于那些内生菌菌株标有“是”的成功接种的总结列于表4中，其中至少一些所接种的植物是基本上正常的表型，并且能够通过正常的生活周期进展(图2)。从如表4中所示的植物中采集种子。
表4接种到黑麦中并感染黑麦的菌株以及种子生产的实例
*接种到黑麦品种Rahu中
**接种到黑麦品种Amilo中
***除Dr Mark Newell，罗伯茨塞缪尔贵族基金会外的黑麦(黑麦)的接种选择。变种如所示：NF95307A、NF95319B、97326、Bates RS4或MATON2。
TBD＝待确定
是1＝预期的结果
实施例7
被内生菌感染的天然亲本植物中的生物碱生产
通过已建立的方法(Kennedy和Bush，1983；Yates等人，1989)和波胺(Rasmussen等人，2012)的稍加修改，对于黑麦草碱生物碱和波胺，对感染了特定内生菌菌株的披木芙蓉、犬草、甘草披碱草(Elymus uralensis)、粉绿披碱草(Elymus nevskii)和披木芙蓉变种oschensis植物的叶片和假茎进行分析。结果示于表5中。在所检查的植物叶子中的黑麦草碱生物碱的总量大于假茎中的总量。不希望受理论的束缚，本发明人认为，存在于被检查的植物中的生物碱的总量代表一范围，其足以对宿主植物提供至少一定程度的害虫防护(Wilkinson等人，2000)。这些结果表明，本文其他地方所提出的由SSR和β微管蛋白数据所定义的分枝内的大量内生菌菌株，当在植物中时，可赋予共生组合产生显著量(可测量的，measurable amount)的黑麦草碱生物碱或波胺或两者的能力。
表5用于被内生菌感染的亲本披碱草(Elymus)植物的总的黑麦草碱和波胺生物碱
脚注：1由GC-FID进行分析，2由LC-MS进行分析
实施例8
从披碱草属选择的内生菌的来源和地理起源
表6列出了本文所公开的一些分离的内生菌菌株、得到它们的来源登记号、原宿主植物登记的推定物种和登记的地区来源。披碱草属宿主植物通常从中亚获得。
表6通过AR代码号、原始推定的宿主物种、地区来源和来源登记号分离的内生菌的菌株
脚注：
1.英国阿丁莱皇家植物园种子保存部
2.铂尔曼学院，华盛顿州立大学，普尔曼，WA.,USA
3.北欧遗传资源中心(NordGen)，奥纳普，瑞典
实施例9
黑麦植物中的生物碱生产
用如表7中所列出的内生菌接种黑麦品种Rahu的幼苗，在温室中生长，并被确认为含有具有基本正常的植物表型的内生菌。分别进行叶片和茎的黑麦草碱生物碱(Kennedy和Bush，1983；Yates等人，1989)或波胺(Garthwaite等人，1994)的分析。表7中的结果示出了对于黑麦草碱生物碱和波胺的浓度范围。不希望受理论的束缚，本发明人认为，存在于被检查植物中的黑麦草碱生物碱和波胺的总量代表一范围，其足以对宿主植物提供至少一定程度的害虫防护(Rowan，1993；Wilkinson等人，2000；Bacetty等人，2009a 2009b)。
表7感染了内生菌的黑麦植物(多达3种植物)的生物碱分析观察
脚注：1由GC-FID进行分析，2由ELISA进行分析
实施例10
具有抗病虫害生物活性的批木芙蓉/内生菌组合
在没有无内生菌的批木芙蓉对照的情况下，使用具有和没有其天然内生菌(羊茅属植物(Neotyphodium uncinatum)的牛尾草，因为它对于产生黑麦草碱生物碱是已知的并且具有防治蚜虫的已知活性。
对蚜虫的效果
蚜虫禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)是谷类植物的重大害虫，因为它传输大麦黄矮株病毒。
在使用分蘖在培养皿中进行的选择生物测定中，感染了AR3050的批木芙蓉上的禾谷缢管蚜的数量类似于感染了其天然内生菌Neotyphodium uncinatum的牛尾草上的数量，并且显著少于无内生菌对照的牛尾草上的蚜虫的数量(表8)。
表8选择试验3天，在感染了AR3050的批木芙蓉的分蘖上发现的禾谷缢管蚜的数量以及具有(MF E+)和不具有(MF E-)其天然内生菌N.uncinatum的牛尾草的分蘖上发现的数量
这项试验的结果表明，作为在批木芙蓉和AR3050之间形成的共生组合(共生体)的结果而产生的黑麦草碱生物碱可能会阻止如在牛尾草上看到的蚜虫(Wilkinson等人，2000)。
对螨虫的效果
螨属，特别是小麦卷叶螨(A.tosichella)，是在澳大利亚传输小麦条花叶病的螨虫。在这些试验中所用的螨虫已被确定为螨属，暂定为小麦卷叶螨。
由于缺乏无内生菌的批木芙蓉对照和植物基因型对荔枝瘿螨(Aceria)的发生的未知效果，在六种被内生菌感染和六种无内生菌的牛尾草植物上，对黑麦草碱生物碱对螨虫的影响进行评估。在每种植物的三个分蘖上计数荔枝瘿螨。无内生菌的植物上比被内生菌感染的植物上出现显著更多的螨(编号/分蘖：对于E+cf为74，对于E-为454。P<0.001)。下面在表9中给出了结果。
表9在具有(E+)和没有(E-)内生菌N.uncinatum的六颗牛尾草植物上的三个分蘖中的两片叶子上的荔枝瘿螨的平均数
如以上在所应用的试验中所示出的，该螨虫试验中的结果表明黑麦草碱生物碱负责阻止螨的食草动物，类似于已在牛尾草中显示的对蚜虫的效果(Wilkinson等人，2000)。
对浅褐色苹果蛾的效果
已知这种昆虫对黑麦草中的内生菌产生的生物活性的敏感性。本文这里用来表示生物活性在感染了AR3046的批木芙蓉植物中的存在。
当从感染了AR3046的植物中提取的批木芙蓉植物材料被并入人工饲料中并喂养给浅褐色苹果蛾时，发现了AR3046的严重影响。在将新生幼虫置于测试饮食上的第一个24小时内建立和开始喂养的幼虫的平均百分比为：与吃了含有感染了AR3046的批木芙蓉的幼虫中的4％相比，其它三个披碱草属物种的平均88％未感染内生菌。试验第10天，与被喂养AR3046且蜕皮到龄的只有13％的那些相比，喂养没有内生菌的植物材料的幼虫中的60％已经蜕皮至第1龄。下面在表10中给出了该试验的结果。
表10当置于结合了来自没有内生菌或感染了产生黑麦草碱的内生菌AR3046的披碱草属的冻干植物材料的饮食上时，对已设定饮食24小时之后以及开始饲养24小时和48小时之后的浅褐色苹果蛾的比例，以及至第一次蜕皮的平均时间。
这种蛾试验的结果有力地表明，AR3046产生负责阻止浅褐色苹果蛾食草动物的黑麦草碱生物碱。
实施例11
在被内生菌感染的黑麦中的害虫防护
利用黑麦品种Rahu的分蘖，带有或没有AR3046内生菌，进行实验，以测试内生菌保护黑麦不受根腐线虫(短体线虫属)影响的能力。E+和E-Rahu的11个个体分蘖，其从每次处理的4棵独立的亲本植物(每个亲本植物2-3次克隆)中选择，被移植到5×5×12cm的含有100g场地采集土壤中且具有每100g含30个短体线虫属的自然侵扰的深根培养器中。另外30个实验室饲养的穿刺短体线虫被加入到各个根培养器中，使得每棵植物暴露于60个线虫。植物在照明的生长室中在20℃下培养30天。然后从土壤中取出植物，将根部洗净，然后用1.5％的氯化钠清洗3分钟。使用在甘油中的苯胺蓝对根部内的线虫进行染色。然后在显微镜下检查根部，
并计数根部系统内的线虫的数量。内生菌感染并没有影响根部重量。
AR3046内生菌的存在导致每个根部系统的线虫数量的显著(p<0.05)减少(表11)。
如在上所描述的昆虫威慑试验中所示出的，该线虫试验的结果有力地表明，通过AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责通过阻止内生菌感染的黑麦植物的根部的线虫定植而赋予被感染的黑麦至少一定程度的害虫防护。这与正在示出的黑麦草碱一致，对线虫具有威慑和杀虫效果(Bacetty等人，2009a 2009b)。
表11在具有内生菌(AR3046)和没有内生菌(E-)(P＝0.013)的黑麦品种Rahu植物的根部中的根腐线虫(短体线虫属)的数量
实施例12
感染有内生菌AR3046的黑麦变种“Rahu”对角潜蝇芦苇(Cerodontha australis)的影响
新西兰和澳大利亚的牧草和谷物经常被叶采蝇，角潜蝇芦苇(Cerodonthaaustralis)(双翅目：潜蝇科)，也被称为小麦鞘矿工，的幼虫骚扰。这个蝇科的幼虫在一系列牧草和谷物的组织上内部饲养，从而造成可能导致分蘖死亡的破坏。螨在叶子上留下明显的痕迹。
在该实验中，感染了产生黑麦草碱的内生菌(AR3046)或未感染(无)的黑麦品种Rahu植物由C.australis暴露于虫害。感染了其天然内生菌Neotyphodium uncinatum的牛尾草被包含在实验中，因为这种内生菌也产生黑麦草碱生物碱。
方法
六棵植物，分别为感染了AR3046的“Rahu”黑麦和感染了N.uncinatum的牛尾草，其与内生菌无关(无)，对这六棵植物通过C.australis比较它们对虫害的影响。植物被随机地布置在重复组(复制组)内，所述组包括每次处理的单个植物，并且从在温室中生长的多年生黑麦草植物切开的四个叶矿蝇蛹被放置在每个植物的基部(在分蘖当中)。此外，已经从所收集的蛹出现的一雌一雄成年蝇被释放到重复组1-5，并且一雄成年蝇被释放到重复组6。用放置在铁丝笼上的细网布覆盖四种植物的每个重复组。在笼子被设置2周后将笼子从植物上除去。在温室中在22℃的最高日温下进行实验，并且根据需要手工浇灌植物。
在将蛹和成虫置于植物上且每个茎中的幼虫损坏或蛹存在6周时，记录每个叶子中的分蘖数以及幼虫的数量和长度4和6周。
在通过重复(复制)阻止的ANOVA在GenStat v16中进行分析之前，对统计数据进行对数变换(ln)和比例数据平方根变换。
结果
与所有六个无Rahu植物相比，感染了AR3046的六棵Rahu植物中的仅一棵感染了苍蝇。在4周和6周检查时，感染了AR3046的Rahu比无Rahu具有显著较少的分蘖/植物(P<0.001)和被C.australis感染的较低比例的分蘖(P<0.002)(表12)。此外，AR3046减少了潜道(mines)/植物的数量(P<0.001)(潜道(mines)是由幼虫在植物组织内喂养时留下的垂直路径)和被幼虫或蛹损坏或含有幼虫或蛹的分蘖茎的数量(即，各分蘖的下部)。
一般来说，所有植物被攻击时，牛尾草植物更容易被苍蝇感染。由N.uncinatum对牛尾草的感染减少了在4周(P<0.007)和6周(P<0.002)时感染C.australis的分蘖比例(表12)。此外，被内生菌感染的牛尾草与无内生菌的牛尾草相比，被损坏或含有幼虫的分蘖茎显著减少(P<0.05)。
表12在蛹和成虫被释放到黑麦变种“Rahu”的植物以及具有(MF N.unc.)内生菌和无(MF Nil)内生菌的牛尾草上之后，在4周和6周时，活分蘖的平均数，损坏分蘖的数量，损坏分蘖的比例以及由角潜蝇芦苇(Cerodontha australis)引起的潜道(mines)/植物的数量列表如下。给出了分蘖茎中的带有损坏和/或蛹的分蘖的平均数，用于6周的检查。对于平均数的数据进行对数(ln)变换并且对比例数据进行平方根变换。
1SED＝对于所有四次处理的比较的标准误差
2P值用于物种内的感染内生菌和无内生菌的植物之间的比较
结论
感染了产生黑麦草碱的内生菌(AR3046)的黑麦品种Rahu的感染显著减少了叶采蝇角潜蝇芦苇(Cerodontha australis)的感染。牛尾草中的内生菌的另一个产生黑麦草碱的物种也减少了由蝇蛆损坏的分蘖的比例和具有茎损坏的分蘖的数量。
该试验的结果有力地表明，通过减少C.australis对感染内生菌的黑麦属植物的侵扰，由AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责赋予被感染的黑麦属至少一定程度的害虫防护。这与正在示出的黑麦草碱一致，对其他昆虫和植物害虫具有威慑和杀虫效果(Schardl等人，2007；Bacetty等人，2009a 2009b)。
实施例13
感染了内生菌AR3046的“Rahu”黑麦对吹沫虫的影响
进行实验，比较感染了AR3046的黑麦变种Rahu和感染了其天然的产生黑麦草碱的内生菌N.uncinatum的牛尾草、连同各自的未感染对照物对被认为对黑麦草碱生物碱敏感的木质取食害虫沫蝉(Philaenus spumarius)(吹沫虫)的影响。对植物进行克隆，使得每个实验用不同的昆虫，使用感染了Rahu以及感染和未感染牛尾草的六种遗传学上相同的植物，但是六种无内生菌的Rahu植物中只有三个是相同的。
进行两个实验，第一个使用很快发展到成年的成熟吹沫虫幼虫，而第二个使用更年轻的幼虫。在这两种情况下，3个吹沫虫被释放到每棵植物上。在第一个实验中，植物被覆盖有没有完全防虫的乙酸笼子，而在第二个实验中，使用防虫尼龙罩。目前吹沫虫的数量以及在吹沫虫饲养时排出的小、中和大唾沫排泄物的数量，在每个实验过程中被定期计数。与无内生菌的相比，感染AR3046的Rahu黑麦减少了吹沫虫的数量和吹沫虫产生的唾沫量(图3)。
在第一个实验中，在整个实验过程中，与无内生菌的相比，显著更少的吹沫虫存在于AR3046植物上，而在第二个实验中，只在实验开始时数量的减少是显著的。相对于这些结果，内生菌感染的牛尾草对吹沫虫的数量或饲养没有影响。
该试验的结果有力地表明，通过减少吹沫虫对感染内生菌的黑麦属植物的侵扰，由AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责赋予被感染的黑麦至少一定程度的害虫防护。这与正在示出的黑麦草碱一致，对其他昆虫和植物害虫具有威慑和杀虫效果(Schardl等人，2007；Bacetty等人，2009a 2009b)。
实施例13
植物病害试验
以下体外结果表明所选的内生菌对谷物真菌病原体的影响，包括抑制一系列病原和腐生真菌的发展。例如，一些内生菌菌株显著(P≤0.05)抑制禾谷镰刀菌和稻纹枯病菌的菌丝体生长(图4和图5)。这两种病原体分别是赤霉病和裸补丁的致病因子，这两种都是谷类作物的毁灭性疾病。这些内生菌具有提供保护防止许多谷物疾病的潜力。不希望受理论的束缚，发明人相信，虽然迄今没有确定动作的机制来解释这种抑制作用，但通过产生未知的次级代谢产物的抗菌是一种可能的机制。
试验结果表明，一些内生菌菌株显著((P≤0.05)抑制了禾谷镰刀菌(图4)和稻纹枯病菌(图5)的菌丝体生长。
虽然已经通过实例并参考具体实施方式描述了本发明，但应当理解的是，在不脱离本发明范围的前提下，可以进行修改和/或改进。
此外，尽管按照马库什组的方式描述了本发明的特征或各方面，但本领域技术人员将认识到，也由此按照马库什组的任何个别成员或成员的子组来描述本发明。
本领域技术人员将理解，如本文所阐述和描述的本发明并不仅仅局限于如所描述的各方面、各实施方式和各实施例，而且在本发明的精神和范围内也涵盖本发明的那些变化和修改，鉴于本文所提供的公开内容和普通知识，这些变化和修改对本领域技术人员(包括本领域中的普通技术人员)而言是显而易见的。
工业应用
根据如本文所公开的本发明，禾本科植物类内生菌菌株、植物/真菌共生体、从这种共生体产生的种子和制造这种共生体的方法都具有工业应用，以便生产用于人或动物消费的植物。
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根据布达佩斯条约进行的微生物保藏的描述
按照布达佩斯条约关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的条款，进行了以下生物保藏
| 保藏鉴定参考 | 国际保藏指定名称 | 保藏日期 |
| AR 3039 | NRRL 50716 | 2012年3月6日 |
| AR 3046 | NRRL 50576 | 2011年10月13日 |
| AR 3049 | NRRL 50577 | 2011年10月13日 |
| AR 3050 | NRRL 50578 | 2011年10月13日 |
| AR 3064 | NRRL 50718 | 2012年3月6日 |
| AR 3067 | NRRL 50719 | 2012年3月6日 |
| AR 3068 | NRRL 50720 | 2012年3月6日 |
| AR 3073 | NRRL 50721 | 2012年3月6日 |
| AR 3074 | NRRL 50722 | 2012年3月6日 |
| AR 3076 | NRRL 50723 | 2012年3月6日 |
| AR 3078 | NRRL 50724 | 2012年3月6日 |
下面附上用于以上保藏的微生物的保藏证明和存活证明。
Claims (38)
1.一种制作稳定的黑麦属植物-内生真菌组合的内生真菌的分离菌株，所述内生真菌的分离菌株来自羊茅属(Neotyphodium)和/或香柱菌属所述内生真菌的分离菌株选自由以下组成的组：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、AR3049(NRRL#50577)、AR3050(NRRL#50578)、AR3064(NRRL#50718)、AR3067(NRRL#50719)、AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)，以及它们的组合。
2.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3039(NRRL#50716)。
3.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3046(NRRL#50576。
4.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3049(NRRL#50577)。
5.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3050(NRRL#50578)。
6.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3064(NRRL#50718)。
7.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3067(NRRL#50719)。
8.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3068(NRRL#50720)。
9.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3073(NRRL#50721)。
10.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3074(NRRL#50722)。
11.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3076(NRRL#50723)。
12.根据权利要求1所述的分离菌株，所述分离菌株是AR3078(NRRL#50724)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的分离菌株，所述分离菌株在生物学上是纯的。
14.一种制作稳定的宿主植物-来自羊茅属(Neotyphodium)和/或香柱菌属的内生真菌组合的方法，包括用至少一种权利要求1所述的内生真菌人工地感染黑麦属植物，该内生真菌与接种植物形成稳定组合，其中所述宿主植物没有显示出内生真菌感染的外部症状。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，稳定的黑麦属植物-内生真菌组合足以稳定地允许内生真菌的垂直传播。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，垂直传播通过分蘖或者繁殖进行。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，垂直传播通过花的分蘖进入种子进行。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述内生真菌的垂直传播导致所述内生真菌从第一代宿主植物垂直传播到第二代宿主植物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，从所述第一代宿主植物到所述第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
20.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括从感染的宿主植物群体中选择没有显示出内生真菌感染的外部症状的黑麦属宿主植物的步骤。
21.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述黑麦属植物选自：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。
22.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述黑麦属植物是黑麦。
23.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述至少一种内生真菌是从披碱草属分离的内生真菌。
24.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述内生真菌从披木芙蓉中分离。
25.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述内生真菌是来自羊茅属(Neotyphodium)或香柱菌属的内生真菌。
26.根据权利要求14所述的方法，其中，所述内生真菌是AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074或AR3078。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述内生真菌是AR3046、AR3050或AR3068。
28.一种对宿主黑麦属植物赋予至少一定程度的害虫防护的方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种来自羊茅属(Neotyphodium)和/或香柱菌属的内生真菌，其中，所述至少一种内生真菌是权利要求1所述的制作稳定的黑麦属植物-内生真菌组合中的内生真菌，并且所述黑麦属植物-内生真菌组合产生足以赋予所述黑麦属植物至少一定程度的害虫防护的水平的至少一种生物碱。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述至少一种生物碱是选自由以下组成的组中的生物碱：波胺、N-乙酰基降黑麦草碱、黑麦草碱、N-甲酰基黑麦草碱、N-乙酰基黑麦草碱和N-甲基黑麦草碱。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种生物碱是黑麦草碱或波胺或两者。
31.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述方法还包括选择黑麦属植物-内生真菌组合的步骤，所述黑麦属植物-内生真菌组合产生足以赋予所述宿主植物至少一定程度的害虫防护的水平的至少一种生物碱。
32.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述黑麦属植物选自：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。
33.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述黑麦属植物是黑麦。
34.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种内生真菌是从披碱草属分离的内生真菌。
35.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述内生真菌从披木芙蓉中分离。
36.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中，所述内生真菌是来自羊茅属(Neotyphodium)或香柱菌属的内生真菌。
37.根据权利要求28所述的方法，其中，所述内生真菌是AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074或AR3078。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述内生真菌是AR3046、AR3050或AR3068。
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