CN106047729B - 一株腐霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株腐霉菌株及其应用，属生物农药领域。腐霉(Pythium sp.)菌株于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.12238。保藏单位地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。腐霉(Pythium sp.)菌株在制备抑制根结线虫卵粒孵化的生物药物中的应用。腐霉(Pythium sp.)菌株在制备毒杀根结线虫二龄幼虫的生物药物中的应用。本发明的优点在于：腐霉真菌（Pythium sp.）能够明显抑制根结线虫卵粒的孵化；对农产品、人畜和环境均无污染；能够用于制备寄生或毒杀根结线虫二龄幼虫的生物农药。

Description

一株腐霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株腐霉菌株及其应用，属于农业生物防治领域。
背景技术
植物寄生线虫是一种世界范围内难以防治的土传性病害，其寄主广泛，适应环境能力强。在常见的植物侵染性病害中，植物寄生线虫引起的危害已超过细菌和病毒，成为了仅次于真菌的第二大植物侵染性病害。据统计，每年植物寄生线虫给农业造成的直接经济损失高达约1570亿美元，其中根结线虫引起的经济损失最为严重。在常见的四种根结线虫属(南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla))内，以南方根结线虫发生最为普遍，对农作物引起的危害也最为严重。
目前，根结线虫的防治主要依靠化学杀虫剂、轮作防病和抗线虫品种培育。其中，化学杀虫剂能够起到立竿见影的杀虫效果，然而，其在毒杀线虫的同时也会给人类健康和环境带来负面影响。在欧美等西方发达国家，已有不少化学杀虫剂(如：溴甲烷及二溴甲烷)被相继禁止使用。作为传统的线虫防治，轮作防病对寄主范围较窄的线虫确实有一定的防控效果，然而，对于具有广泛寄主根结线虫属来说，其防效甚微。抗线虫品种培育是一项高效、经济且无公害的线虫防治措施，但其面临着远缘杂交、性不亲和、杂交和分离世代长以及抗源僵乏和抗源基因表达不稳定表达等问题，使该项工作开展比较困难且耗时较长。根结线虫的生物防治越来越受到人们的重视。
在自然界土壤中，广泛分布着线虫的天敌，主要有食真菌、细菌、病毒、立克氏体、放线菌和原生动物等。其中研究最多的是食真菌，根据其对线虫的作用机制的不同，李天飞等(2000)将食线虫真菌分为捕食线虫真菌、内寄生线虫真菌、产毒真菌和机会真菌等4类。捕食线虫真菌是指以营养菌丝特化形成的捕食器官捕捉线虫的一类菌物。内寄生线虫真菌是指通过特殊的孢子寄生游离活动线虫的一类菌物。机会真菌是指专性或兼性定殖于植物寄生固着性线虫的卵、雌虫、胞囊等或寄生游离线虫卵的一类菌物，包括大量的土壤习居性菌物。
基于以上的杀线虫真菌分类基础，本研究从番茄土壤中纯化分离到一株腐霉(Pythium sp.)菌株，关于其对线虫卵孵化有高效抑制并有明显毒杀幼虫的毒杀效果和相关机理尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于为开发高效生物农药，而提供一株腐霉菌株及其应用。
本发明分离纯化到一株能够高效抑制线虫卵孵化和并能明显寄生幼虫的腐霉(Pythium sp.)。以基因组为模板，用真菌ITS通用引物(ITS4-5)克隆出885bp的片段(见文件“腐霉核酸序列ITS4-5，885bp)。该菌株已于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.12238。
本发明的真菌通过分离纯化培养后，再经过常规的生测测定对线虫的寄生效果，具体步骤如下(以下为重量百分比)：
1、腐霉真菌Pythium sp.的分离、纯化和培养
CMA平板培养基配方为：玉米粉40.0g，琼脂20g，1L蒸馏水，pH自然。将带有腐霉菌的根结线虫卵块接种到CMA平板中，25℃下培养一周。之后，用无菌接种针挑取单孢子接种于CMA三角瓶(400ml三角瓶，100ml CMA)，并继续培养一周。
2、获取大量孢子
向CMA三角瓶中加入20ml无菌蒸馏水和100粒无菌玻璃珠(直径：2mm)，摇晃三角瓶5min。将三角瓶中的蒸馏水和玻璃珠倒入铺有6层擦镜纸的漏斗中，离心收集透擦镜纸上的孢子。
3、测定对线虫卵的寄生效果
将分离纯化的寄生真菌接种到含有100ml CMA培养基的400ml三角瓶中，CMA培养基配方为：玉米粉40.0g，琼脂20g，1L蒸馏水，pH自然。28℃培养8天，获得大量孢子。
向CMA三角瓶中加入20ml无菌蒸馏水和100粒无菌玻璃珠(直径：2mm)，剧烈摇晃三角瓶5min。将三角瓶中的蒸馏水和玻璃珠倒入铺有6层擦镜纸的漏斗中，离心收集透擦镜纸上的孢子。将收集到的孢子用无菌水调成一序列浓度，其浓度分别为：2.0×102个/ml，2.0×103个/ml，2.0×104个/ml，2.0×105个/ml，2.0×106个/ml，2.0×107个/ml,将上述浓度的孢子均一地涂布到CMA平板上。然后，在CMA平板上随机打取4-5个圆孔(直径＝1cm)，将涂布有孢子CMA的平板放置于25℃培养一周。
拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净。选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其加入到涂有不同孢子浓度CMA平板的圆孔中，每个圆孔中加入2个成熟卵块，以成熟卵块未加入没有涂布有孢子的CMA平板圆孔为对照。随后加入800μl无菌水并置于25℃培养，察并统计孵化出来的二龄幼虫数目。
卵粒抑制率(％)＝100(A-B-C)/A
其中：A是初始加入的卵粒数目、B是完整卵粒的数目、C是孵化出的J2数目。
卵块孵化抑制效果＝b-a
其中a为对照组的卵粒抑制率
b为各孢子浓度实验组的卵粒抑制率
4、测定对线虫幼虫的毒杀效果
拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净。选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其置于40μm细胞筛网。挑取后将筛网和卵块置于2％(质量/体积)次氯酸钠中1min，期间缓慢振动筛网。无菌水冲洗卵块7次后将筛网放置于装有15ml无菌水的6cm培养板中28℃恒温培养箱中孵化，每24h收集一次，并将其制备成线虫悬浮液。
将500μl根结线虫二龄幼虫悬浮液加入涂有不同孢子浓度的CMA平板圆孔中，继续放置于25℃培养8天，以没有涂布孢子的CMA平板为对照，显微镜下观察并统计仍然存活的J2。
线虫毒杀率(％)＝100(A-B)/A
其中：A是初始加入的幼虫数目、B是观察时仍然存活的幼虫数目。
线虫的毒杀效果＝b-a
其中a为对照组的线虫毒杀率。
b为各孢子浓度实验组的线虫毒杀率。
本发明的优点在于：用线虫寄生性腐霉真菌(Pythium sp.)寄生线虫毒杀线虫时效快、防效高；对农产品、人畜和环境均无污染；特别是对于世界性土传病害的根结线虫的防控具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1显示孢子形态(标尺＝9.5μm)。
图2显示菌丝形态(标尺＝4.0μm)。
图3显示孢子囊形态(标尺＝5.0μm)。
图4显示菌丝侵染根结线虫卵粒(标尺＝20μm)。
图5显示菌丝侵染根结线虫二龄幼虫(标尺＝20μm)。
具体实施方式
本发明实施例中的腐霉真菌的纯化、培养方法及对线虫的生测测定同发明内容部分所述。
实施例一：
拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净。选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其加入到5％(质量/体积)次氯酸钠溶液中，激烈震荡2min后，离心收集管底的卵粒，并用蒸馏水洗涤，直到没有次氯酸钠味道，并制成卵粒悬浮液(400个/ml)。
将500μl线虫卵粒悬浮液分别加入涂有孢子浓度为2.0×102个/ml，2.0×103个/ml，2.0×104个/ml，2.0×105个/ml，2.0×106个/ml，2.0×10 7个/ml的不同CMA平板圆孔中，继续放置于25℃培养4天，以没有涂布孢子的CMA平板为对照。显微镜下观察统计仍然完整的卵粒或孵化出的J2。结果见表1。
实施例二：
拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净。选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其置于40μm细胞筛网。挑取后将筛网和卵块置于2％(质量/体积)次氯酸钠中1min，期间缓慢振动筛网。无菌水冲洗卵块7次后将筛网放置于装有15ml无菌水的6cm培养板中28℃恒温培养箱中孵化，每24h收集一次，并将其制备成600条/ml的线虫悬浮液。
将500μl根结线虫二龄幼虫悬浮液分别加入涂有孢子浓度为2.0×102个/ml，2.0×103个/ml，2.0×104个/ml，2.0×105个/ml，2.0×106个/ml，2.0×107个/ml的不同CMA平板圆孔中，继续放置于25℃培养8天，以没有涂布孢子的CMA平板为对照，显微镜下观察并统计仍然存活的J2。结果见表2。
表1寄生真菌对根结线虫卵粒孵化的抑制效果
结果表明，腐霉真菌(Pythium sp.)能够明显抑制根结线虫卵粒的孵化。
表2寄生真菌对根结线虫二龄幼虫的毒杀效果
结果表明，腐霉真菌(Pythium sp.)能够较好地寄生或毒杀根结线虫二龄幼虫。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南大学
<120> 一株腐霉菌株及其应用
<130> 2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 885
<212> DNA
<213> Pythium sp.
<400> 1
gaaaaatttt tatatataat aaaaaaaaaa aaaaatcaag ttcgtaggga acctgcggaa 60
ggatcattac cacaccaaaa aaactttcca cgtgaaccgt agtaacattg ttctgtgctg 120
tctttcggga cggctgaacg aaggtggatc gcaaggtctg ccgatgtact tttaaaccca 180
ttacctaaat actgaactat actccaaaaa cgaaagtctt tggttttaat caataacaac 240
tttcagcagt ggatgtctag gctcgcacat cgatgaagaa cgctgcgaac tgcgatacgt 300
aatgcgaatt gcagaattca gtgagtcatc gaaattttga acgcacattg cactttcggg 360
ttatgcctgg aagtatgcct gtatcagtgt ccgtacaaca aacttgcctt tctttttctg 420
tgtagtcagg gagagaaatg gcagaatgtg aggtgtctcg ctgactccct cttcggagga 480
gaagacgcga gtctctttaa acgtacgttc gctctttctt gtgttcatgt agaagtgtgg 540
cttgcgaacg cagtgatctg tttggatcgc tttgcgcttt cgggcgactt cggttggaac 600
attaaaggaa gcaacctcta ttggcggtat gttaggcttc ggcccgactt tgcagctgac 660
agtgtgttgt tttctgttct ttccttgagg tgtacctgtt atagtgtgag gcaatggtct 720
gagcaaatgg ttattgtgta gtagtgggtc gctgctcttg gacgctctgg atttattcag 780
agtaaagaag acaacaccaa tttgggattg agtcttcgga ttcataattt ctaattggac 840
ctgatatcag gtaagattac ccgctgaact aacaacattg aaggg 885

Claims (3)

1.一株腐霉(Pythium sp.)菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO. 12238。
2.权利要求1所述的腐霉(Pythium sp.)菌株在制备抑制根结线虫孵化的生物药物中的应用。
3.权利要求1所述的腐霉(Pythium sp.)菌株在制备毒杀根结线虫二龄幼虫的生物药物中的应用。
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