UA120250C2 - Виділений штам грибкового ендофіта виду neotyphodium групи epichloae для підвищення стійкості до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин secale spp. (варіанти) та його застосування - Google Patents

Abstract

Винахід стосується принаймні одного штаму грибкового ендофіта групи Epichloae, який при об'єднанні з принаймні одним видом Secale spp. надає захист від шкідників рослині Secale spp. Зокрема, винахід стосується виділеного штаму грибкового ендофіта групи Epichloae, вибраного з групи, що складається з NRRL 50716, NRRL 50576, NRRL 50577, NRRL 50578, NRRL 50718, NRRL 50719, NRRL 50720, NRRL 50721, NRRL 50722, NRRL 50723 та NRRL 50724 та їх комбінацій, рослини Secale spp., інфікованої грибковим ендофітом, де Secale spp. не є природним хазяїном ендофіта, способу одержання стабільної комбінації рослини-хазяїна/грибкового ендофіта групи Epichloae, способу надання захисту від шкідників рослині-хазяїну Secale spp., та насіння Secale spp., інфікованого грибковим ендофітом групи Epichloae.

Description

Винахід стосується принаймні одного штаму грибкового ендофіта групи Ерісніосає, який при об'єднанні з принаймні одним видом 5бесае 5рр. надає захист від шкідників рослині беса/е 5рр.

Зокрема, винахід стосується виділеного штаму грибкового ендофіта групи Еріспіоае, вибраного з групи, що складається з МЕКІ 50716, МКК 50576, МЕКІ 50577, МКК 50578, МКК 50718,

МАК 50719, МАК 50720, МКК 50721, МЕКІ 50722, МАК 50723 та МЕКІ 50724 та їх комбінацій, рослини беса/е 5рр., інфікованої грибковим ендофітом, де беса/е 5рр. не є природним хазяїном ендофіта, способу одержання стабільної комбінації рослини- хазяїна/грибкового ендофіта групи Ерісніосає, способу надання захисту від шкідників рослині- хазяїну бесае 5рр., та насіння бесае 5рр., інфікованого грибковим ендофітом групи Еріснісає. . що : | | Щі ява не ВИ р ! і ннхюв о : ї Ї ння отиту інініетінтнтнтенінтніл нн ВВЗВТВ : : - | - що Ав . ення миша | | | Анзщо й . ! й ! : мак

Ї ще и : (АНЗОво ще ше лез : | ш : : дезове й | пе з потен Кк Дінннвеотнтнннк от тутнттетннтннттчтнннн АВВОВТ . Й АноВЕ : : - Анзота ще ше ! ! . АНТ і ! ше Ї ідвмив

БАН паж кн о в п ТЯ

НЯ вд с | 5 : . ше вд «оо Коефіцієвт Жаккара.у/ ши З ФІГ. 1

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід загалом стосується ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає), які утворюють стабільну симбіотичну асоціацію із житом (5есаїе сегеаї!є).

ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Зесаіє сегеаїє, загальновідомий як жито, вирощується в усьому світі, типово для виробництва зерна. Зерно використовують переважно для виробництва борошна, хліба та для прямого споживання, особливо в країнах, що мають традицію споживання житнього хліба.

Вегетативні частини 5. сегеаіє можуть бути використані як солома, або перетворені на силос, для використання як корм для тварин, в тому числі при загінному випасу (іп 5їш агагіпод).

Як було відзначено вище, жито переважно вирощують на зерно. Отже, потрібний ефективний захист від шкідників під час вирощування для забезпечення виробництва великої кількості зерна прийнятної якості. Жито типово вважають осінньою культурою, насіння якої звичайно висівають восені. Сівозміна з іншими зерновими або польовими культурами може бути використана для зменшення накопичення шкідників та/або грибкових хвороб, які присутні у грунті або розвиваються в пожнивних рештках.

Основні шкідники жита включають, без обмеження, попелицю; трипсів; дротяників та личинок хрущів; личинок комарів-довгоніжок (Тірша б5рр.); озиму муху (Оєїїа соагсіаїа); вузькокрилих молей-мінерів (Адготуа 5рр.); шведську муху (ОзсіпеїЇа їі); жужелицю (7абгив5

Іепебгіоїде5); галицю злакову сідельну (Наріоадіріовзів тагдіпайа); п'явиць (ОшШета теїіапорив, 0. даІаесіапа); нематод; та слимаків.

Відомі способи боротьби зі шкідниками жита включають деякі або усі з таких заходів: використання стійких до шкідників сортів рослин, оптимізація часу посіву та посів здоровим насінням, ефективна сівозміна, знищення та/або захоронення або видалення пожнивних рештків (стерні). Додаткові способи боротьби зі шкідниками, що можуть виявитися потрібними, включають обробку різними пестицидами рослин та/або насіння. Інколи для боротьби зі шкідниками може бути потрібним одночасне нанесення двох чи більше активних речовин.

Однак, використання багатьох пестицидів може бути проблематичним через відомі проблеми, асоційовані з хімікатами, часто використовуваними для таких цілей. Багато пестицидів є токсичними і можуть бути небезпечними для людей та тварин, що є споживачами

Зо оброблених сільськогосподарських культур (Сазіда апа Оцізіайд, 1998). Зокрема, накопичення у людей та тварин токсичних пестицидів може призводити до серйозних проблем зі здоров'ям у осіб, особливо на ранніх стадіях розвитку. Наприклад, дія пестицидів пов'язувалася з респіраторними розладами, раками розвитку, і було показано, що вони мають довготривалі ефекти на розвиток розумової здатності (7 є|да еї а!., 1993).

Використання пестицидів може бути ускладненим з погляду контролю в змінних умовах навколишнього середовища, що приводять до небажаного розсіювання токсичних сполук, наприклад, в результаті зносу розпилюваних матеріалів або вилуговування грунту. Крім того, у шкідників може розвиватися резистентність до пестицидів з ряду причин, включаючи неналежні практику та поводження, які можуть створювати реальну загрозу врожайності (зерна).

Відповідно, існує потреба у заходах боротьби зі шкідниками, які б не використовували нанесення пестицидів.

Метою даного винаходу є створення принаймні одного штаму грибкових ендофітів роду епіхлое, який при поєднанні з принаймні одним видом бесаІє зрр. надає принаймні деякий рівень захисту від шкідників рослині Зесаїе 5рр., та/або забезпечує для спільноти корисний вибір.

Коли в даному описі наводяться посилання на описи патентів, інші зовнішні документи або інші джерела інформації, це загалом робиться з метою забезпечення контексту для обговорення ознак винаходу. Якщо конкретно не зазначено інше, посилання на такі зовнішні документи не слід тлумачити як припущенння того, що такі документи, або такі джерела інформації, в будь-якій юрисдикції, є відомим рівнем техніки, або утворюють частину загальновідомого знання в цій галузі техніки.

СУТЬ ВИНАХОДУ

В першому аспекті, даний винахід стосується виділеного штаму грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає), вибраного з групи, що складається з АНЗОЗ3О (МАВІ Я 50716), АНЗО046 (МАНІ 50576), АНЗО49 (МАНІ 250577), АНЗО5О (МАНІ 50578), АНЗОб4 (МАНІ Я 50718),

АНЗОб7 (МАНІЯ 50719), АНЗО68 (МАНІЯ 50720), АНЗО7З3 (МАНІ 50721), АНЗО74 (МАНІЯ 50722), АН3076 (МАНІ 50723) та АНЗО78 (МАВІЖ 50724) та їх комбінацій. Краще, винахід стосується штамів АНЗОЗ39, АНЗО46, АНЗО5О, АНЗОб7, АНЗОб68, АНЗО74 та АНЗО78, краще,

АВЗО46, АНЗ3050 або АНЗОБ8. бо В одному варіанті реалізації, виділений штам є біологічно чистим.

В другому аспекті винахід стосується рослини Зесаїе 5рр., інфікованої грибковим ендофітом, причому бесаіє 5рр. не є природним хазяїном ендофіта, і рослина та ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію, що дозволяє рослині розвиватися в нормальному життєвому циклі.

В одному варіанті реалізації, ендофіт передається від першого покоління Зесаіе 5рр. другому поколінню ЗесаЇІе 5рр. шляхом вертикальної передачі. Краще, вертикальна передача від першого покоління рослин-хазяїв другому поколінню рослин-хазяїв відбувається через насіння.

В одному варіанті реалізації ендофіт є ендофітом, виділеним з ЕіІутиз 5рр. Краще, ендофіти виділені з ЕІути5 тшабіїї5. Краще, ендофіт є ендофітом з роду епіхлое (Еріспіоає). Краще, ендофіт з роду епіхлое є ендофітом, що належить до штаму роду епіхлоє, вибраного з групи, що складається з АКЗ3039 (МККІЖ 50716), АК3046 (МЕКІЖ 50576), АК3049 (МЕКІ 550577),

АНЗОБО (МАНІ 50578), АНЗОб4 (МАНІ 50718), АНЗОб7 (МАНІ Я 50719), АНЗОб8 (МАНІ 50720), АНЗО7З (МАНІ Я 50721), АНЗО74 (МАНІ 50722), АНЗ076 (МАНІ 50723) та АКЗ078 (МЕКІ Ж 50724), або їх комбінацій. Краще, винахід стосується ендофітів штамів АК3039, АК3046,

АКЗ050, АК3067, АК3068, АК3074 та АК3078, краще, АК3046, АКЗ3050 або АК3068.

В одному варіанті реалізації, Зесае 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, не демонструють зовнішніх симптомів ендофітної інфекції.

В одному варіанті реалізації, бесаїІе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, демонструють нормальний морфологічний фенотип.

В одному варіанті реалізації, бесаІе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, продукують лолінові алкалоїди та/або перамін.

В одному варіанті реалізації, Зесаїйе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, мають підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників або підвищену резистентність до хвороби рослин, або обидві, у порівнянні з 5есаїйе 5рр., не інфікованими грибковим ендофітом.

В одному варіанті реалізації, Зесаїйе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, мають підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників, де один чи декілька шкідників вибрані з групи, що складається з: (1) видів попелиці (Арпіаідає), представлених Нпораіозірпит раді, Зспігарнів дгатіпит, Апораіозірпит таїадів, Меїороїїрпішт аікподит, ЗпйобБіоп 5рр., Зйобіоп амепає, ЗйПОоБіоп

Зо їадапає, Оішгарніє похібв; (2) видів злакових та зернових мух (Адготу/ідає; Апіпотуїдає,

Спіогорідає, Серпідає та Сесідотуїйдає), представлених ОзсіпеїІа її, Оз5сіпеїа ризійа, Мауейоїа девігисіог, Сегодопіна 5рр., Сегодопіна айвігаіє, Сегодопіна ападивіїреппів, Боптіа Тштідаїа,

Меготуе атегісапа, Наріоадіріозіз тагаіпаїа, Спіогор5 ритіїйопіє5, Тірша в5рр. Спготайтуіа тТи5сша, Серпи5 рудтаєи5, Спготаїйотуїа Ти5сцшіа, Сопіагіпіа їгйісі; (3) видів трипсів (ТНгірідає), представлених Гітотрипси сегеаїїшт, Гітотрипси депіїсогпі5, Арііпотрипси гиїи5, 5Їепотрипси дгатіпит; (4) видів коників та цвіркунів (Асгідідає та СгуїПдає), представлених І осивіа тідгацсогіа,

Рпашастідійт тагадіпаіє, Рпашасгідішт. мат, Меїапоріиб5 в5рр., ТеІєодгуПи5 соттодив; (5) видів клопів (І удаеіїдає), представлених Муззіи5 попі, Віїз5и5 Іеисорепиз Іеисорегпив5; (6) видів довгоносиків (Сигсшіопідає), представлених Зрпепорпоги5 5рр.; (7) видів совок (похідний черв'як та озимий черв'як) (Мосіцідає), представлених Рзецдаїейа ипірипсіа, 5родорієвга 5рр.,

Муїпітпа зерагаїа; Регзесіапіа амегза, Адгобвіїв ірвіп; (8) видів листоїдів (Спузоптеїїаає), представлених Оціета теїапорив; (9) личинок хрущів (Зсагараєїдає), представлених видами

Роріййа іаропіса, Совієїуїа 7єаіапаіса, РнуПорепна 5рр., ВНігоїгоди5 тайаїї5, Апізоріа зедейшт; (10) видів борошнистого червця (Рзейдососсідає та Соссідає), представлених Рпепасоссив5 погаєї, Ваіапососсив роає, ВНірегзеїйа гитісіє5, Рогрпугорпога інйісі; (11) видів дротяників (ЕІаїегідає), представлених Соподеги5 5рр., Ійтопіи5 5рр.; видів жуків (Сагабрідає), представлених 2абги5 ТІепебгіоїдеє5; (13) видів кліщів (Егіорпуїдае та Репіпаїеїідає), представлених РепіпаЇеєив5 5рр., Наюїуадеиз аевзігисіог, Асегіа 5рр.; (14) видів шкідників запасів продуктів (Сигсціопічає, Зіїмапідає, Ругаїїдає, СеїІеспідає, Тепебгіопідає, Вобвігіспідає), представлених 5йорпйи5 огулає, ЗЙорпйиз дгапагіиз, Зйоїгода сегеаіеПа, Кпугорегпгійа аотіпіса,

Стуріоієзієз зрр., Огулаєрпій5 зигіпатепвіх5, Садга сацієїйа, Ріодіа іпіегрипсіеМйа, Тіроїйт сопіибит, Тгіроїййт сазіапецт, Ііавзіодегпта егісогпе; (15) видів пінниць (Сегсороїдеа), представлених Ріпйаепи5 5ритагіий5; (16) видів нематод, представлених кореневою нематодою (Ргагуіепспи5 5рр., зокрема Р. Шогпеї, Р. сгепайи5, Р. педіесіи5 та Р. репеїгап5), вівсяною нематодою (Неїегодега 5рр. та Рипсіодега 5рр., зокрема Н. амепає, Н. Іаїропв, Н. Ногаесаїв, Н.

Тіїріємі, Н. тапі, Н. Бітепезіга, Н. ракКкізіапепвів та Р. рипсіага), галовою нематодою (Мепіоідодупе 5рр., зокрема М. спім/ооаі, М. пааві, М. апієїПа, М. тістоїуїа, М. оНегзопі, М. дгатіпісоїа, М. дгатіпіє, М. Кікоуєпвіз та М. зрапіпає), стебловою нематодою (Ойуіепспив5 5рр., зокрема 0. аірзісаї та 0. гадісісоіїа); пшеничною нематодою (Апдпіпа ійіїісі); (16) видів слимаків (Оеєгосегав бо гейсшашт та Агіоп 5рр., зокрема А. Ппопепвів адад. та А. зибіивзсив5). В одному варіанті реалізації,

шкідники є нематодами, краще, кореневими нематоди (Ргаїуіепспиє5 5рр.), або мінуючими мухами Сегодопійа ашизігаїї5 (Оіріега: Адготу?ідає), також відомими як у/пеаї 5пеаїй тіпег (мінер піхви листя пшениці).

В одному варіанті реалізації, Зесаїе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, мають підвищену резистентність до хвороби рослин, де хвороба рослин спричинена рослинним патогеном, вибраним з групи, що складається з вірусу жовтої карликовості ячменю (І еїеоміги5), грунтового вірусу мозаїки пшениці (Ригоміги5) та вірусу смугастої мозаїки пшениці «(Тгййптомігив5),

Хапіпотопаз сатревігіх, Рвгецдотопаз зупіпдає, СоПейоїгспит дгатіпісоїа, СіотегеїІа дгатіпісоїа (гелеоморфа|, Айегпага 5рр., Сіадозрогішт Неграгит, МусозрНаєгеїйа іаззіапа

Ігелеоморфаї!, Ерісоссит врр., Зрогороіотусе5 5рр., 5іетрНуїйшт 5рр., Віроїагі5 5огоКіпіапа,

Соспііобоїи5 займи5 (гелеоморфаї, Ризагішт 5рр., Тека сагіе5, ТІШПебіа «пісі, ТіПеба Іаемі5, ТШейа

Тоеїіда, Нутепшіа сегеаїї5, Серпаіозрогішт дгатіпейт, НеїІтіпіпйозрогішт заїймит, Соспіороїйв5 займиз (гтелеоморфа|, Соргіпи5 зуспготогрідив5, Ойорпозрога аїоресигі, ТіШейа сопігомегза,

СіІамісер5 ригригеа, Ззрпасеїйа зедешт (Іанаморфа), Ризагчт сиїтогит, Рзецйдозеріогіа допасів,

Зеіепорпота допасіх, Меомо55іа іпаіса, ТІШейа іпаіса, Риссіпіа гесопайа, Аесідіит сіетаїіаїів

І(анаморфа!|, Сегсозрогідішт дгатіпів, Зсоїїсоїгіспит дгатіпієх, Ріпаеозрнаєтгтіа Пегроїгіспоїдев,

І ерюзрпаєтіа Пегроїгіспоіїде5, ОзШадо іпйсі, Містодоспішт пімаІє, Ризагійт пімаІє, Моподгарпеїа пімаїїх |(гелеоморфаї|!, Егузірпе дгатіпі5, Руїпішт арпапідегтайт, Руїйішт агппепотапевз, Руїпічт дерагуапит, Руїйішт агатіпісоїа, Руїфішт ШПітит, Сіррегейа 7є6єає, ЕРизапйт агатіпеагит

І(анаморфа)|, зеріогіа зесаїї5, Зеріогіа ігпйісі, МусозрпаєгеїІа дгатіпісоїа (телеоморфа), КПі2осіопіа сегеаїї5, ВНігосіюопіа 5оїапі, ВНі2осіопіа 7єає, Віштетіа 5рр., Сегаюбавзідіит сегеаіе (телеоморфа)|,

Мутіозсіеєгоїїпіа Брогеаїї5, осіегоїїпіа Богеєаїї5, Турпша ідапоепвзіх, Турпша іпсатаїйє, Турпша ієпіКагтієпвіз, Турпша ізпікапепвіє маг. сападепві5, Єіадопозрога подогит, беріоїйа подогит,

Рпаеозрпаєгтіа подогит (гелеоморфа|, ІГеріозрпаєгіа подогит, ПМкгосувіїї оссиМйа, Риссіпіа дгатіпів, А5регдійив 5рр., Мідтозрога 5рр., РепісШит 5рр., АПігорих 5рр., Рзейдосегсозрогеїїа

Пегроїгіспоїде5, Тарезіа асшоптів (гелеоморфаї, Огедо діштагит І(анаморфаї|!, Ругепорпога ігійісі- герепіїв, ЮОгеспвієга ійісі-герепіїз (анаморфаї), НеІтіпіпозрогіит ігйісі-герепії5, Риссіпіа (ийісіпа,

Рушіит 5рр., Кпупспозрогіит 5есаїїв, Риссіпіа вігіїтогті5, заештаппотусез дгатіпі5 та Ризагійт рзейдодгатіпеагит.

Зо Краще, рослинним патогеном є Риссіпіа гесопайа, Риссіпіа Шйісіпа, Риссіпіа дгатіпів,

Еизагішт врр., РуїШішт зврр., Апупспозрогішт зесаїї5, Риссіпіа віпйогтіє5, Савитаппотусев5 дгатіпіб, КпПігосіопіа 5о0Їапі або Ризагішт рхейдодгатіпеаги т.

В одному варіанті реалізації, ЗесаІе 5рр., інфіковані грибковим ендофітом, вибирають з групи, що складається з 5есаїе сегеаІє, ЗесаІе топіапит, 5есаїе в5ігісішт, Зесаїе з5уїмевзіге та зесаїе маміомі. Краще, Зесаїйе 5рр. є 5есаїе сегеаї!е.

В третьому аспекті винахід стосується способу одержання стабільної комбінації рослина- хазяїн/грибковий ендофіт роду епіхлое (Еріспіоає), який включає штучне інфікування рослини бЗесаіе 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом, що утворює стабільну комбінацію з інокульованою рослиною, де рослина-хазяїн не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції.

В одному варіанті реалізації, стабільна комбінація рослина/грибок є достатньо стабільною, щоб дозволити вертикальну передачу ендофітів. В одному варіанті реалізації, вертикальна передача здійснюється за допомогою відростків, особливо, квітковими пагонами, що дають насіння (Погаї! йіеге іп 5еей), або частин, придатних для вегетативного розмноження. Краще, вертикальна передача від першого покоління рослин-хазяїв другому поколінню рослин-хазяїв відбувається через насіння.

В одному варіанті реалізації, вертикальна передача ендофітів приводить до вертикальної передачі ендофітів від першого покоління другому поколінню рослин-хазяїв. Краще, вертикальна передача від першого покоління рослин-хазяїв другому поколінню рослин-хазяїв відбувається через насіння.

В одному варіанті реалізації, спосіб додатково включає стадію вибору рослини-хазяїна

Зесаї!є, яка не виявляє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції, з популяції інфікованих рослин- хазяїв.

В четвертому аспекті винахід стосується способу надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну 5есаїе 5рр., який включає штучне інфікування рослини з5есаїйе 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом роду епіхлое (Еріспіоае) де комбінація грибковий ендофіт-рослина Зесаїіе продукує принаймні один алкалоїд на рівні, достатньому для надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну.

В п'ятому аспекті, винахід стосується способу надання захисту від шкідників рослині-хазяїну бо зесаїе 5рр., який включає штучне інфікування рослини Зесаїе 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом роду епіхлое (Еріспіоає), де комбінація грибковий ендофіт-рослина Зесаіе продукує принаймні один алкалоїд, що надає зазначеного захисту від шкідників рослині-хазяїну.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, принаймні один алкалоїд є алкалоїдом, вибраним з групи, що складається з пераміну, М-ацетилнорлоліну, лоліну, М- форміллоліну, М-ацетиллоліну та М-метиллоліну.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, принаймні один алкалоїд є лоліном або пераміном або обома.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, лолін продукується на рівні принаймні 25 мкг/г.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, лолін продукується на рівні, вказаному у Таблиці 7 для лоліну.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, лолін продукується в діапазоні значень від принаймні 25 мкг/г до приблизно 3660 мкг/г.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, перамін продукується на рівні принаймні 1 мкг/г.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, перамін продукується на рівні, вказаному у Таблиці 7 для пераміну.

В одному варіанті реалізації четвертого або п'ятого аспектів, перамін продукується в діапазоні значень від принаймні 1 мкг/г до приблизно 45 мкг/г.

В одному варіанті реалізації, спосіб додатково включає стадію вибору комбінації грибковий ендофіт-рослина Зесаіїе, що продукує принаймні один алкалоїд на рівні, достатньому для надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну.

В шостому аспекті, винахід стосується насіння Зесаіе 5рр., інфікованого грибковими ендофітами роду епіхлое (Еріспіоае). Краще, насіння ЗесаІе 5рр. є насінням зЗесаїе 5рр., вибраних з групи, що складається з Зеса|е сегеаіє, Зесаіє топіапит, 5есаїе зійсшт, бесаїє зуЇмезіге та зесаїе маміїомії. Ще краще, насіння є насінням зЗесаїе сегеаїе.

В одному варіанті реалізації будь-якого з третього, четвертого, п'ятого або шостого аспектів винаходу, викладених вище, бесаїеє 5рр. вибирають з групи, що складається з бесаїе сегеаїе, зесаіїе топіапит, Зеса|е в5ігісйшт, ЗесаІе 5уїмезіге та Зеса|е маміомі. Краще, Зесаїе 5рр. є

Зо ЗБесаїе сегеаї!е.

В одному варіанті реалізації будь-якого з третього, четвертого, п'ятого або шостого аспектів винаходу, викладених вище, принаймні один грибковий ендофіт є ендофітом, виділеним з

ЕІутиз 5рр.

Краще, грибковий ендофіт виділений з ЕІути5 тшарбіїйє. Краще, грибковий ендофіт є ендофітом з роду епіхлое (Еріспіоає). Краще, ендофіта з роду епіхлое вибирають з групи, що складається з АНЗОЗ39 (МАНІ 50716), АНЗО46 (МАНІ 2 50576), АНЗО49 (МАНІ 50577), АНЗОБО (МАНІ Я 50578), АНЗОб4 (МАНІ 50718), АНЗО6б7 (МАНІ 50719), АНЗОб68 (МАНІ 50720),

АКЗ3073 (МЕКІЖ 50721), АК3074 (МЕКІЖ 50722), АК3076 (МККІЖ 50723) та АК3078 (МЕКІ й 50724) та їх комбінацій. Краще, винахід стосується штамів АК3039, АК3046, АКЗ3050, АКЗ3067, АКЗО68, АК3074 та АК3078, краще, АК3046, АКЗ3050 або АК3068.

Інші аспекти винаходу можна зрозуміти з наведеного далі опису, який представлений лише як приклад та з посиланнями на супровідні креслення.

СТИСЛИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

Винахід буде далі описаний лише для прикладу та з посиланнями на креслення, на яких:

Фігура 1 зображує дендрограму філогенетичних взаємозв'язків, основану на розмірах алеля

ЗОВ, вказаних у Таблиці 2.

Фігура 2 зображує чотири рослини 5есаїє сегеаіІє, сорт Вайпи; одна неінфікована (Е-); та три інфіковані АКЗ3046. Зліва направо: нормальна, карликова та низькоросла морфологія. Е- та

АНЗО46-інфіковані нормальні та карликові рослини дають квітки, низькоросла - ні.

Фігура З зображує кількість пінявих виділень личинок або число пінниць/рослину, спостережуваних на рослинах 5есаїе сегеаіІє, сорт Вапи, інфікованих ендофітами АКЗ3046 (Капи

АНЗО46), та на неінфікованих рослинах (Кайи Мі). Також показана кількість пінявих виділень личинок або число пінниць/рослину, спостережуваних на рослинах вівсяниці лугової (Ревійса ргаїєпвіз зуп. І оЇйшт ргаїепб5є зуп. ЗсПпедопоги5 ргаїєпвіз), інфікованих її природними ендофітами Меоїурподішт ипсіпаййт (МЕ Е-), та на неінфікованих рослинах (МЕ Е-).

Фігура 4 показує, що певні штами ендофітів істотно (Р«0,05) інгібували міцеліальний ріст

Еизагішт дгатіпеагит у подвійній культурі (дані з неопублікованого дослідження 5іцагї Сага,

АдНезеагсі Па).

Фігура 5 показує штами ендофітів зернових, які істотно (Р«0,05) інгібували міцеліальний ріст бо КПігосіопіа 5оїапі у подвійній культурі (дані з неопублікованого дослідження 5ішагі Сага,

АдНезеагсі Па).

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Визначення

Наступні визначення призначені для кращого опису даного винаходу та як посібник для рядових фахівців в цій галузі техніки у практиці даного винаходу.

Якщо не зазначено інше, усі технічні та наукові терміни, використовувані в даному документі, слід розуміти як такі, що мають значення, зрозумілі рядовим фахівцям у відповідній галузі техніки, до якої належить даний опис. Приклади визначень звичайних термінів ботаніки, мікробіології, молекулярної біології та біохімії можна знайти у Віоіоду ої Ріапіб5, Вамеп евї аї. (єд5.), М.Н. Егеетап апа Сотрапу, (2005); Ріапі Рпузіоіоду, Таї? еї аї. (єдв.), Зіпацег Авзосіаїев,

Іпсогрогаїєд, (2010); Воїапу: Ап Іпігодисіоп о Ріапі Віоіоду, У.О. Майзеїй, Чопе5 « Вапей

Ї еатіпо, (2003); МеїШод5 г Сепега! апа Моїесшіаг Містобіоіоду, За Еайіоп, С.А. Недау, еї а). (єд».), АБМ Ргезв, (2008); Епсусіоредіа ої Місторіоіоду, 2па єд., дозпца І єдегрига, (єд.), Асадетіс

Ргевз5, (2000); Містобріоюду Ву Сійе Моїез, І. Едуагк АїЇсато, МУУйеу, (1996); Оісіопагу ої

Місгторіоїоду апа Моїієсшіаг Віоіоду, біпдієюп еї аї. (24 вед.) (1994); Віоіоду ої Містоогдапізтв 1117 ей., ВгосК еї аї., Реагзоп Ргепіїсе Наї!, (2006); Віодімег5йу ої Еипаді: Іпмепіогу апа Мопійогіпд

Меїподз», МиеїПег еї аї!., Асадетіс Ргевв5, (2004); Сепез5 ІХ, Вепіатіп І ем/п, допез 8 Вапієй

Рибіївпіпо, (2007); Тне Епсусіоредіа ої Моїесшціаг Віоіоду, Кепагеу» евї аї. (єдз.), ВіасКмеї! Зсієпсе ца., (1994); МоїІєсшаг Віоіоду апа Віоїесппоїоду: а Сотргепепзіме ЮезК Веїегепсе, Вобеп А.

Меуєегз (вєд.), МСН Рибіїзнегз, Іпс., (1995); Зутбріозев ої агаззев м/п зеедрогтпе Типда! епдорпуїев. зепага! Сі еї аї. (2004) Аппиа! Неміем ої Ріапі Віоїоду 55: 315-340; та Спетоїуре аїмег5йу ої еріспіоає, типада! зутбріопів ої дгаззез, Зспага! СІ, Моипу СА, ЕРаціКпег УВ, Ріогєа 5, Рап У (2012)

Еипаа! Есоїіоду 331-344 (Зспага| еї а!., 2012).

Вважається також, що практика даного винаходу може здійснюватися з використанням стандартних ботанічних, мікробіологічних, молекулярно-біологічних та біохімічних протоколів та процедур, відомих фахівцям та описаних, наприклад, в Меїйоса5 ої 5іцауіпа Воої бЗузіетв, мої. 33, УМоїдапд Вопт, Зргіпде!-Мепад, (1979); Ноої теїйоа5: А Напароок, Аїрепй І. тії Зргіпде", (2000); Віодіметзйу ої Рипаді: Іпмепіогу апа Мопіюгіпд Меїйподз, МиеПег єї аї., Асадетіс Ргевв5, (2004); Епмігоптепіа! Місгобіоіоду: Меїпод5 апа Ргоїосої!в5, у.Е.Т. Зрепсег еї а)Ї., Нитапа Ргев5,

Зо (2004); Епмігоптепіа! Місгоріоіоду, Р.О. 5Нагпта, АІрна 5сіепсе Іпіегпайопаї, (2005); Епмігоптепіаї!

Місторіоіоду, У.В. І єадбенег, СЕ Ргоїезвіопа! Рибріїзпіпо, (2005), Моїесшціаг Сіопіпд: А І абогаюгу

Мапиаї, Мапіаїів еї аїЇ., Сої4 бргіпд Натбог Іарогаюгу Ргев5, (1982); Моїесшаг Сіопіпд: А

І арогаїогу Мапиаї! (2 єд.), Затьгоок еї аї!., Соїд бргіпд Натог І арогаюгу Ргезз, (1989); Сціде ю

Моїесшіаг Сіопіпд Тесппіднев Мої.152, 5.Ї. Вегдег апа А.В. Кіттеї!! (Едв.), Асадетіс Ргевзз Іпс., (1987); Віоїєсппоіоду ої Епаорпуїіїс ЕРипді ої Стазбзе5. 1994 Васоп апа МУнйе (Едз5.) та інші загальнодоступні довідкові матеріали, що стосуються галузі техніки, до якої належить даний винахід, які усі включені за посиланням до даного документа в повному обсязі.

Термін "рослина", у використовуваному в даному документі значенні, охоплює цілі рослини та усі частини рослини з усіх стадій життєвого циклу рослини, включаючи, без обмеження, вегетативні та репродуктивні клітини та тканини, частини рослин, призначені для вегетативного розмноження, насіння, ембріони, паростки, стебла, листя, листкові піхви та пластинки, суцвіття, корені, пиляки, лігули, палісад, мезофіл, епідерміс, вушки листків, верхню квіткову лусочку, нижню квіткову лусочку та пагони.

Термін "епіхлое (Еріспіоає)", у використовуваному в даному документі значенні, стосується збірної групи грибкових ендофітів, яка включає два роди грибкових ендофітів: члени формального роду анаморфів Меоїурподіит та члени телеоморфного роду Еріспіоб.

Термін "ендофіти з роду епіхлое (Еріспіоає)у, у використовуваному в даному документі значенні, стосується ендофітів групи "епіхлое (Еріспіоає)", що, як відомо фахівцям або було показано в даному документі, утворюють симбіотичну асоціацію з рослиною-хазяїном.

Термін "надає принаймні деякий рівень захисту від шкідників", у використовуваному в даному документі значенні, охоплює вимірне зниження частоти, тяжкості та/або тривалості впливу шкідника на рослину бесаіє 5рр. Краще, вимірне зниження є статистично значущим зниженням з Р-значенням 0,05 чи менше.

Термін "рівень, достатній для надання захисту від шкідників", у використовуваному в даному документі значенні, з посиланням на рівні алкалоїдів, означає будь-який рівень алкалоїду, продукований симбіозом рослина-ендофіт, що є достатнім для створення вимірного зниження частоти випадків, тяжкості або тривалості зараження шкідником, інфекції або шкідливого ефекту на рослину-хазяїна бесаіе 5рр., інфіковану грибковим ендофітом відповідно до винаходу.

Краще, алкалоїд є пераміном або лоліном або похідним лоліну. Краще, вимірне зниження є бо статистично значущим зниженням з Р-значенням 0,05 чи менше.

Термін "статистично значущий", у використовуваному в даному документі значенні, стосується ймовірності того, що результат чи співвідношення спричинені чимось іншим, ніж випадковістю. Результат може бути визначений як статистично значущий шляхом перевірки статистичної гіпотези, як відомо та робиться фахівцями в цій галузі техніки. Перевірка статистичної гіпотези дає "Р-значення", як відомо фахівцям, яке показує ймовірність того, що виміряний результат викликаний однією лише випадковістю. Фахівці вважають, що загальноприйнятні рівні значущості, які становлять 595 (0,05) чи нижче, є статистично значущими.

Термін "підсилений захист від шкідників", у використовуваному в даному документі значенні, стосується рівня захисту від шкідників, що надається рослині Зесаіе 5рр. в симбіотичній асоціації з грибковими ендофітами роду епіхлое (Еріспіоає), який зменшує частоту, тяжкість та/або тривалість зараження шкідниками, інфекції або шкідливого ефекту на рослину внаслідок присутності та/або активності даного шкідника у порівнянні з частотою, тяжкістю та/або тривалістю таких саме зараження шкідниками, інфекції та/або шкідливого ефекту на рослину зЗесаїє 5рр., що не має грибкових ендофітів (контрольна рослина), та/або рослину бесаїйе 5рр., що має інші грибкові ендофіти.

Терміни "штучне інфікування" та "штучна інокуляція" у використовуваному в даному документі значенні, охоплює будь-яку інокуляцію рослини, особливо рослини бесаїє 5рр., зокрема бЗесаіє сегеаї, грибковим ендофітом з утворенням симбіотичної асоціації рослина/грибок, яка є невідомою в природних умовах.

Термін "іп ріапіа", у використовуваному в даному документі значенні, в контексті грибкових ендофітів стосується ендофіту, коли він живе симбіотично у рослині-хазяїні.

Термін "стабільний симбіоз рослина/грибок, у використовуваному в даному документі значенні, стосується симбіотичної асоціації, яка зберігається протягом життєвого циклу рослини, де рослина не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції. В "стабільній симбіотичній комбінації" рослина-хазяїн інфікується ендофітом в першому поколінні та продукує насіння, при пророщуванні якого виростає друге покоління рослин-хазяїв, які також є інфікованими ендофітом.

Термін "нормальний життєвий цикл", у використовуваному в даному документі значенні,

Зо стосується нормального репродуктивного циклу бесаІє, який включає ріст першого покоління рослини з продукуванням насіння, при пророщуванні якого виростає друге покоління рослини.

Термін "не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції, у використовуваному в даному документі значенні, з посиланням на рослину-хазяїна, що містить грибкового ендофіта, означає, що рослина-хазяїн має по суті нормальний морфологічний фенотип, відомий фахівцям для цієї рослини-хазяїна. При цьому, "по суті нормальний морфологічний фенотип" рослини- хазяїна, у використовуваному в даному документі значенні, стосується типової морфології рослини-хазяїна, відомої та загальноприйнятої в даній галузі техніки для цієї рослини-хазяїна при даних умовах росту.

Термін "нормальний фенотип" рослини-хазяїна, у використовуваному в даному документі значенні, стосується типової морфології, росту та інших фенотипових характеристик рослини- хазяїна, що виявляються протягом життєвого циклу рослини-хазяїна, включаючи репродуктивний цикл рослини-хазяїна та насіння рослини-хазяїна, як відомо та є загальноприйнятим в цій галузі техніки для цієї рослини-хазяїна, коли вона не містить ендофіта.

Термін "аномальний фенотип" по відношенню до рослини-хазяїна, у використовуваному в даному документі значенні, стосується морфології, росту або інших фенотипових характеристик рослини-хазяїна на будь-якій стадії життєвого циклу рослини-хазяїна, включаючи репродуктивний цикл рослини-хазяїна та насіння рослини-хазяїна, які відрізняються від відомих та загальноприйнятих в даній галузі техніки як типові, або таких, що знаходяться в звичайно спостережуваному діапазоні для цієї рослини-хазяїна. Термін "аномальний фенотип' по відношенню до рослини-хазяїна, у використовуваному в даному документі значенні, може включати низькорослі рослини чи карликові рослини, або рослини з явно помітними зовнішніми свідченнями ендофітної інфекції, або рослини, неспроможні завершити нормальну репродукцію через насіння, без обмеженння ними.

Термін "включає", як він використовується в даному описі винаходу, означає "складається принаймні частково 3". При тлумаченні формулювань в даному описі винаходу, які включають цей термін, ознаки, що йдуть слідом за цим терміном в кожному формулюванні, усі мають бути обов'язково присутніми, але інші ознаки також можуть бути присутніми. Споріднені терміни, такі як "включати" та "що включає", мають тлумачитися у такий саме спосіб.

Передбачається, що посилання на діапазон цифрових значень, розкритий в даному бо документі (наприклад, від 1 до 10) також включає посилання на усі раціональні числа в цьому (с;

діапазоні (наприклад, 1, 1,1, 2, 3, 3,9, 4,5, 6, 6,5, 7, 8, 9 та 10), а також будь-який діапазон раціональних чисел усередині цього діапазону (наприклад, від 2 до 8, від 1,5 до 5,5, та від 3,1 до 4,7) і, таким чином, усі піддіапазони усіх діапазонів, явно розкритих в даному документі, є цим самим явно розкритими. Це лише приклади того, що є конкретно передбачуваним, і усі можливі комбінації числових значень між зазначеними найнижчим значенням та найвищим значенням мають вважатися такими, що явно вказані в цій заявці у такий саме спосіб.

Детальний опис

Багато злаків прохолодного сезону (Роасєає, підродина Роосідеає) мають грибкові ендофіти роду епіхлое (Еріспіоае), що поширюються через насіння, які є відомими через їх біозахисні властивості та, особливо, через продукування алкалоїдів, що виявляють активність проти шкідників, таких як лоліни (2Ппапод еї аї., 2010) та перамін (Коштап еї аї., 2007). Асексуальні епіхлое (види Меоїурподійт) передаються переважно або повністю вертикально, у той час як статеві структури (строма) споріднених видів Еріспіоє можуть утворювати горизонтально поширювані спори (аскоспори) (2Ппапа еї аї., 2010).

Більшість видів Меоїурподішт вважаються близько спорідненими з видами роду Еріспіоб.

Багато видів Меоїурподішт могли еволюціонувати з Еріспіоб в результаті процесів, що включають міжвидову гібридизацію (Т5аї еї аї!., 1994). На підставі молекулярно-філогенетичних даних деякі автори вважають, що асексуальні види Меоїурподішт походять або від індивідуальних видів Еріспіоє, або від гібридів, утворених за участі принаймні двох предкових видів Еріспіоє (Тваї єї аї., 1994; Мооп еї аїІ., 2004). Сучасна таксономія вважає, що члени формального роду анаморфів Меоїурподішт є дуже близькоспорідненими членами телеоморфного роду Еріспіоє (Сщівєпп єї аї., 1996). Згідно з попередніми редакціями кодексів ботанічної номенклатури, формальний рід стосується асексуальної спори або вегетативного стану і телеоморфний рід стосується сексуального стану. Зараз кодекс ботанічної номенклатури описує один гриб за протоколом однієї назви (зіпдіє патіпа) (МіПег еї а. 2011). Колективно, два роди, Меоїурподіут та Еріспіоє, відомі в даній галузі техніки як ендофіти "епіхлое".

Симбіотичні асоціації між грибами епіхлое та злаковими травами-хазяями є звичайними і молекулярно-філогенетичні дані дозволяють припустити, що видова специфічність, спостережувана в цих симбіотичних асоціаціях, викликана коеволюцією цих груп рослин та

Коо) грибкових ендофітів (5спагаї еї а!., 2008).

Жоден із сучасних одомашнених злаків в природних умовах не інфікований ендофітами епіхлое, хоча для деяких їх родичів дикого типу це можливо (Маїгзпаї! єї а!., 1999). Без бажання обмежуватися теорією зазначимо, що, на думку авторів винаходу, в процесі еволюції сучасних злаків, агротехнічні заходи, такі як зберігання насіння, могли привести до втрати історичних асоціацій, якщо вони існували (М/егу єї а!., 1987).

Утворення стабільного симбіозу рослина/грибок між грибковими ендофітами роду епіхлое (Еріспіоає) та рослиною-хазяїном, яка не є природним хазяїном гриба, є проблематичним та непередбачуваним (Зітрзоп апа Масе, 2012).

Вважають, що це спричинено вимогою, при створенні таких симбіозів, щодо успішної інтеграції численних біологічних змінних між партнерами, які можуть включати екологічні, біохімічні та/або молекулярні несумісності (СНгібіепзеп еї аї!., 2000). В даному описі розкритий великий обсяг необхідних досліджень, включаючи значну кількість експериментальних робіт, виконуваних методом спроб та помилок, потрібних для розробки успішних протоколів та процедур, за допомогою яких були створені стабільні симбіотичні асоціації між певними штамами грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає) та рослинами-хазяями 5есаїе 5рр., які не є природними хазяями таких грибів.

Несподівано, автори винаходу визначили, що штучна інокуляція може бути використана для створення стабільних симбіозів рослина/лрибок між деякими грибковими ендофітами роду епіхлое (Еріспісає) та рослинами-хазяями 5есаїе 5рр. Використовуючи способи за винаходом, описані в даному документі, автори винаходу змогли одержати інфіковану рослину-хазяїна зЗесаїє 5рр., яка утворює стабільну симбіотичну асоціацію з інфекційним грибом, що дозволяє інфікованій рослині розвиватися в нормальному життєвому циклі, та/або при якій інфікована рослина не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції. Додатково, автори винаходу знайшли, що утворення таких симбіотичних асоціацій може забезпечувати принаймні певний рівень корисного ефекту для рослини-хазяїна, який полягає у продукуванні в рослині принаймні одного лолінового алкалоїду, похідного лолінового алкалоїду або пераміну, або їх комбінації, що може надавати рослині-хазяїну принаймні деякого рівня захисту від шкідників.

Автори винаходу несподівано виявили, що ізоляти певних грибкових ендофітів, узяті від диких родичів злаків, є придатними для створення стабільних симбіозів рослина/грибок з бо рослинами-хазяями бесаїє зрр., зокрема бесаїє сегеаіє. Зокрема, автори винаходу створили симбіотичні асоціації, які приводять до одержання комбінації грибковий ендофіт/рослина-хазяїн

Зесаіє 5рр. що може мати принаймні певний рівень підсиленого захисту від шкідників у порівнянні з контрольними рослинами 5есаїйе 5рр.; тобто, рослинами тих самих 5есаїе 5рр., які є неінфікованими тим самим симбіотичним грибковим штамом епіхлое. Без бажання обмежуватися теорією зазначимо, що, на думку авторів винаходу, підсилений захист від шкідників слід очікувати в комбінаціях грибковий ендофіт/рослина-хазяїн, що продукують певні алкалоїди, особливо лолін, похідні лоліну та/"або перамін. Відповідно, автори винаходу вважають, що продукування алкалоїду (алкалоїдів) лоліну та/або пераміну грибковим ендофітом роду епіхлое (Еріспіоає) або комбінацією грибковий ендофіт/рослина-хазяїн забезпечує принаймні певний рівень підсиленого захисту від шкідників для рослини-хазяїна.

Зокрема, автори винаходу встановили, що після використання штамів ендофітів та способів за винаходом, розкритих в даному документі, рослини-хазяї бесаіе 5рр., зокрема рослини-хазяї

ЗесаІє сегеаІє, інфіковані певними штамами грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає), мають підсилений захист проти нематод у порівнянні з контрольними рослинами 5есаїе.

Загалом кажучи, симбіотичні асоціації, утворені між рослинами-хазяями та їх грибковими ендофітами роду епіхлое (Еріспіоає), основані на складних та тісних біологічних взаємодіях, які приводять до високого ступеня видоспецифічності як для ендофіта, так і для хазяїна (бБітрзоп апа Масе, 2012).

В результаті довготривалої програми досліджень, заявники ідентифікували уперше гриби епіхлое, здатні утворювати стабільні симбіози рослина/грибок з рослинами-хазяями зЗесаїе 5рр.

Заявники додатково ідентифікували ендофіти, здатні надавати інфікованій рослині-хазяїну, коли вони перебувають в симбіозі з рослинами-хазяями Зесаїіе 5рр., зокрема рослинами-хазяями бЗесаІе сегеаіе, здатність продукувати один чи декілька алкалоїдів, що забезпечують для рослини принаймні певний рівень підсиленого захисту від шкідників, у порівнянні з неінфікованою контрольною рослиною. Зокрема, один чи декілька алкалоїдів можуть бути лоліном, похідними лоліну або пераміновими алкалоїдами.

Відповідно, в одному аспекті даний винахід стосується виділеного штаму грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає), вибраного з групи, що складається з АК3039 (МЕКІ я 50716),

АНЗО46 (МАНІ 50576), АНЗО49 (МАНІ ЯйБ5О577), АНЗО5О (МАНІ Я 50578), АНЗОб4 (МАНІ

Коо) 50718), АНЗОб7 (МАНІ 50719), АНЗО68 (МАНІ Ж 50720), АНЗО7З (МАНІЯ 50721), АНЗО74 (МАНІ Я 50722), АНЗ3076 (МАНІ 50723) і АК3078 (МЕКІЖ 50724) та їх комбінацій. В одному варіанті реалізації виділений штам є біологічно чистим. Краще, винахід стосується штамів

АКЗ039, АК3046, АК3050, АК3067, АК3068, АК3074 та АК3078, краще, АК3046.

Вищевказані штами грибкових ендофітів були депоновані в Міністерстві сільського господарства США, Службі сільськогосподарських досліджень регіону Середнього Заходу (Адгісийига! Везвагсі 5егмісе Мідууезі Агеа), Національному центрі досліджень, спрямованих на застосування у сільському господарстві (Маїйопа! Сепіег їог Адагісийига! і2аноп Резвєагси, 1815

Мопій Опімегейу Зігевї, Реогпіа, ІШіпоїз, 61604-3902, ОА) 13 жовтня 2011 р., для штамів:

АКЗ3046 (МЕКІ Ж 50576), АК3049 (МЕКІ Ж50577) та АК3050 (МЕКІ Ж 50578), і 6 березня 2012 р. для штамів АНЗОЗ9 (МАНІ 2 50716), АНЗОб64 (МАНІ 2 50718), АНЗОб7 (МАНІ 50719), АНЗОбВ8 (МККІЖ 50720), АК3073 (МЕКІЖ 50721), АК3074 (МККІ й 50722), АК3076 (МЕКІЖ 50723) та

АНЗО78 (МАНІ Я 50724), згідно з Будапештським договором в цілях патентної процедури.

Ендофіти були виділені з ЕІути5 5рр., включаючи Е. тшаБбіїїх, одержаного з районів

Киргизстану, Казахстану, СРСР та Росії, як вказано у Таблиці 6.

Вищевказані ендофіти були виділені з інфікованих ендофітами рослин ЕІутив5 5рр., включаючи ЕЕ. тюшарбіїїх, після поверхневої стерилізвції рослинної тканини, як описано (Спгівієпзеп вї а!., 2002).

Після виділення, виділені та/або біологічно чисті грибкові ендофіти можуть культивуватися з використанням стандартних методик, відомих фахівцям та розкритих в даному документі, включаючи приклади.

В одному варіанті реалізації, грибкові ендофіти культивують на антибіотичному картопляному агарі з декстрозою (АВРОА) при температурі від 20 "С до 25 "С, краще, від 217 до 23"С. Оптимальною температурою для вирощування грибкового ендофіта є 2276.

Вирощування грибкового ендофіта при температурах вище чи нижче цього діапазону значень є можливим, хоча ріст може бути ослабленим або може зовсім припинитися. В одному варіанті реалізації, грибковий ендофіт культивують у темряві.

Винахід також стосується способу захисту рослини Зесаїйе 5рр. від шкідників, який включає штучне інфікування рослини бесаїе 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом роду епіхлое бо (Еріспіоає), причому грибковий ендофіт іп ріапдіа продукує принаймні один алкалоїд на рівні,

достатньому для надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну.. В одному варіанті реалізації, принаймні один алкалоїд є алкалоїдом, вибраним з групи, що складається з пераміну, М-ацетилнорлоліну, лоліну, М-форміллоліну, М-ацетиллоліну та М- метиллоліну.

Інокуляція може бути проведена з використанням кільчиків бесаіє 5рр., які пророщували протягом приблизно двох тижнів. Краще, кільчики пророщують протягом 4-9 днів.

За межами цього діапазону, кільчики ще можуть утворювати ефективні асоціації, але в деяких випадках можуть бути занадто молодими або занадто старими для поселення грибкового ендофіта. Насіння має бути вільним від сторонніх грибів та бактерій, щоб кільчики не були ослаблені внаслідок мікробного зараження.

В одному варіанті реалізації, штучна інокуляція може бути проведена з використанням базальної (Базаї) інокуляції кільчиків 5есаіе 5рр. Для ефективного утворення асоціації грибковий симбіонт/рослина-хазяїн Зесаіе 5рр., інокуляцію ендофітів слід проводити в меристему рослини-хазяїна шляхом надрізу рослини та введення міцелію культури гриба.

Фахівцям в даній галузі техніки відомо про природну резистентність до шкідників та захист злаків, які ендофіти з роду епіхлое, що ростуть симбіотично зі злаковими рослинами-хазяями, можуть надавати в такій комбінації. Зокрема відомо, що лолінові алкалоїди та алкалоїд перамін надають певного такого захисту без помітної або відомої токсичності для ссавців або людей, які споживають злакові рослини або продукти, одержувані опосередковано внаслідок споживання злакових.

Лоліни є групою споріднених біологічно активних природних продуктів, які мають спільні окремі хімічні та біологічні характеристики. Лоліни є алкалоїдами, тобто органічними сполуками, які містять основні атоми азоту та хімічно визначаються як насичені 1-амінопіролізидини з внутрішнім ефірним місточком, що з'єднує два кільцевих атоми вуглецю (0-2 з 0-7). Внутрішній ефірний місточок, який є незвичним в органічних сполуках, вважають характерною ознакою групи. Конкретні лоліни включають норлолін, а похідні його 1-аміно-фрагмента включають лолін (з метильною групою), М-метиллолін (з двома метильними групами, ММ), М-ацетилнорлолін (з ацетильною групою, МАМІ), М-ацетиллолін (з метильною групою та ацетильною групою, МАГ) та

М-форміллолін (з формільною групою, МЕ) (ЗсНагаїЇ еї а!., 2007; Зснага| єї а!., 2012).

Відомо, що лоліни є загалом пестицидними та відлякуючими шкідників сполуками, продукованими в злаках, інфікованих симбіонтами ендофітними грибами епіхлое (Еріснпіоє /

Меоїурподішт врр.). Було продемонстровано, що лоліни підвищують резистентність злакових рослин-хазяїв до рослиноїдних шкідників (Ви5б еї а!., 1997). Конкретні лоліни можуть мати деякі відмінності в біологічній активності проти конкретних шкідників. Було також висунуте припущення, що присутність лолінів може забезпечувати рослині-хазяїну певний рівень захисту від екологічних стресів, включаючи засуху та просторову конкуренцію (Маїїпому5Ккі апа ВеїезкКу, 2000).

Лолінові алкалоїди можуть продукуватися в симбіотичній комбінації як грибковим ендофітом, так і рослиною-хазяїном. Важливим є продукування лолінових алкалоїдів комбінацією, причому продукування індуковане в комбінації присутністю грибкового ендофіта на або усередині тканин рослини, особливо, присутністю грибкових гіфів між клітинами рослини.

Історично, іп мйго відтворення існуючих в симбіозі умов, що створюють можливість продукування лолінових алкалоїдів, було знайдено надзвичайно складним (Ропег 1994). Тому до відносно недавнього часу було невідомо, чи є лолінові алкалоїди, продукування яких спостережують в таких симбіотичних асоціаціях, продукованими самим грибковим ендофітом, або ж вони синтезуються рослиною у відповідь на інфекцію. Лише відносно недавня робота

ВіапКепеПір еї аіІ. (2001) продемонструвала, що ендофіти Меоїурподішт ипсіпайт можуть продукувати лоліни у хімічно визначеному живильному середовищі. Ця робота дозволяє припустити, що ендофіти є також продуцентами лолінів в їх природних злакових хазяях (ВіапКепзпПір еї аї., 2001). Прямий хімічний аналіз природних епіхлое також продемонстрував цей ефект (5спагаЇ єї аї., 2007).

Перамін (піролопіразиновий алкалоїд) є біологічно активним алкалоїдом, продукованим деякими комбінаціями ендофітів та рослин (5спага! еї аї.,, 2012). Було показано, що продукування пераміну є залежним від функціонування принаймні одного гена ендофіта (Тапака єї аї., 2005). Було показано, що перамін є антифідингом для деяких комах-шкідників рослин, і може надавати захист проти зараження інфікованих ендофітами рослин деякими комахами (Коулап та І асп, 1994).

Винахід додатково стосується способу одержання стабільної комбінації рослина- хазяїн/грибковий ендофіт роду епіхлое (Еріспіоає), який включає штучне інфікування рослини 60 Зесаіє 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом, що утворює стабільну комбінацію з інокульованою рослиною, причому рослина-хазяїн не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції. Це означає, що після утворення комбінації інфікована рослина-хазяїн зесаіе 5рр. виявляє нормальний морфологічний фенотип Зесаїйе 5рр., відомий фахівцям, який є очікуваним для умов росту в місцезнаходженні комбінації.

За певних умов, грибкові ендофіти, які є облігатними симбіонтами одного виду або штаму рослини-хазяїна, можуть бути введені іншому виду або штаму рослини-хазяїна для створення комбінації, що нормально не зустрічається в природі. Однак, такі комбінації можуть бути нестабільними та приводити до одержання рослин-хазяїв, що мають аномальний фенотип, тобто, аномальні морфологічні та/або фізіологічні ознаки у порівнянні з рослинами-хазяями того самого штаму або виду, які є або неінфікованими, або містять природного симбіонта. Аномальні фенотипові ознаки можуть включати карликові рослини (5ітрзоп апа Масе, 2012), рослини з помітно епіфітним ростом (Спгізіепзеп еї аї!., 2012), колонізацію судинного пучка (СНгізієпзеп єї а!., 2001) та локалізовану загибель клітин (Спгівієпзеп, 1995).

Заявник уперше зміг створити стабільну симбіотичну комбінацію рослин-хазяїв бесаїє 5рр. та грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає), що приводить до стабільної комбінації рослина/грибок, яка не виявляє аномальних ефектів ендофітної інфекції. Стабільні симбіотичні комбінації, запропоновані в даному документі, можуть виявляти нормальний морфологічний фенотип і повний та нормальний репродуктивний цикл.

В одному варіанті реалізації, стабільна симбіотична комбінація є достатньою для забезпечення можливості вертикальної передачі ендофітів. В одному варіанті реалізації, вертикальна передача здійснюється за допомогою квіткових пагонів та продукованого згодом насіння. В одному варіанті реалізації, вертикальна передача ендофітів відбувається від першого покоління другому поколінню рослин-хазяїв. Краще, вертикальна передача від першого покоління рослин-хазяїв другому поколінню рослин-хазяїв відбувається через насіння.

В одному варіанті реалізації, рослиною-хазяїном є бесаіє в5рр., вибрані з групи, що складається з ЗесаІе сегеаіє, Зесаіе топіапит, ЗесаїЇе 5ігісішт, БЗесаіе 5уїЇмезіге та Зесаїе маміомі. Краще, рослиною-хазяїном є 5есаїє сегеа!є.

Винахід додатково стосується ендофітів, здатних надавати при інфекції рослини-хазяїна

ЗесаІе 5рр. здітність комбінації ендофіт/рослина продукувати один чи декілька алкалоїдів з

Зо лоліну, похідних лоліну та/або пераміну.

Винахід додатково стосується насіння рослини 5есаїе 5рр., інфікованої принаймні одним грибковим ендофітом роду епіхлое (Еріспіоае). Краще, ендофіти з роду епіхлое виділені з

ЕІутив 5рр. Краще, грибковий ендофіт виділений з Еї(ути5 тишабіїїх. Краще, ендофіти з роду епіхлое вибирають з групи, що складається з АКЗ3039 (МАК Ж 50716), АК3046 (МЕРІ Ж 50576),

З5 АНЗОї4-9 (МАНІ 250577), АНЗО5О (МАНІ 50578), АНЗО64 (МАНІ 50718), АНЗОб7 (МАНІ 50719), АНЗОб8 (МАНІ 50720), АНЗО73 (МАНІ Ж 50721), АНЗО74 (МАНІЯ 50722), АНЗО076 (МЕКІЖ 50723) та АК3078 (МАК Ж 50724) та їх комбінацій. Краще, винахід стосується штамів

АКЗ039, АК3046, АК3050, АК3067, АК3068, АК3074 та АК3078, краще, АК3046.

Краще, насіння бЗесаІе 5рр. є насінням бесаїє сегеаіє, Зесаіе топіапит, Зесаїє вігістшт, зЗесаїє зуїмевзіге або б5есаїє маміомії. Ще краще, насіння є насінням 5есаїе сегеа!є.

Різні аспекти винаходу будуть далі проілюстровані у необмежувальний спосіб з посиланням на наступні приклади.

ПРИКЛАДИ

ПРИКЛАД 1

Детектування штамів грибкових ендофітів

Більш ніж 580 зразків (ассеззіоп5) насіння ЕІутиз 5рр. були одержані з різних джерел і, якщо кількість насіння дозволяла, до приблизно 50 індивідуальних насінин або кільчиків досліджували на інфекцію ендофітами. Живих ендофітів у листкових піхвах кільчиків, вирощених до стадії двох чи більше пагонів, визначали у спосіб, описаний бітрзоп еї аї. (2012).

Було знайдено, що приблизно 695 зразків продукували принаймні один паросток, що містить живі ендофіти, які могли бути додатково досліджені у наступних прикладах.

ПРИКЛАД 2

Детектування генетичних відмінностей штамів грибкових ендофітів

Для того, щоб зосередитися на виборі штамів ендофітів з тих ЕІ(утив5 5рр., що містять живі ендофіти і які могли б становити додатковий інтерес, ендофіти, зібрані з до б рослин для кожного зразка, були частково охарактеризовані та проаналізовані на генетичні відмінності методом ДНК-фінгерпринтингу, основаним на генотипних даних, одержаних з до 8 вибраних локусів маркерних простих коротких повторів (З5К) з використанням праймерних послідовностей, вказаних у Таблиці 1. Раніше було показано, що ці праймерні послідовності бо загалом ампліфікують поліморфні ДНК-послідовності ендофітів з роду епіхлое (Еріспіоає), що відповідають ендофітам іп ріапіа.

Зразки приблизно по 100 мг вологої ваги нижніх (раза!) пагонів використовують для екстракції повної геномної ДНК (рослина ж ендофіт), з подальшою процедурою виділення рослинної ДНК з використанням набору РазійМА відповідно до інструкцій виробника (Віо 101,

Мівіа, Саїйоіа).

Ампліфікацію 55А проводять з парами олігонуклеотидних праймерів, з використанням одного з двох протоколів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Таблиця 1). В обох протоколах

ПЛР проводять з використанням термоциклера іСусієг (ВіоВаєд, Негсціез, Саїтотіа, О5А).

Протокол 1 був таким, як описано (Мооп еї а!., 1999), за винятком того, що використовували температуру відпалу 60 "С. В цьому протоколі прямі праймери були міченими на 5'-кінці флуорофором 6-ЕАМ "м (Арріїєа Віозузіетв5, Еозіег Спу, СаїШогпіа).

В протоколі 2 прямі праймери були синтезовані з 21-нуклеотидною МІ1З3 хвостовою послідовністю на 5'-кінці (5-ТатТААААСпАСаасССАсСтТ-3) (ЗЕБО ІЮ МО: 1), для сприяння універсальному міченню продуктів ПЛР за допомогою 6-ЕАМ'М-міченого М13 праймера (бсп!цеїКе, 2000). Зворотні праймери були синтезовані з послідовністю 5-4 ТСТТ-3' (5ЕО І

МО: 2) на 5-кінці для сприяння нематричному (поп-Іетріаїєд) аденілюванню на 3'-кінці продукту

ПЛР (Вгом/пвівіп еї а!., 1996). Використовували об'єм ПЛР-реакції 10 мкл, що містить приблизно 10 нг загальної геномної ДНК, 2,5 мМ хлориду магнію, їх буфер для ПЛР, 0,05 мМ кожного амМтТР, 0,0375 мкМ прямого праймера, 0,15 мкМ зворотного праймера, 0,15 мкМ флуоресцентно міченого М1З-праймера та 0,75 од. ДНК-полімерази Ріайпит Тад (Іпмйгодеп, Сагізбаа,

Саїїогіа). ПЛР проводили з використанням такого профілю: (1) 94 "С протягом 4:00 хвилин, (2) 30 циклів з: 94 "С протягом 30 секунд, 55 "С протягом 30 секунд та 72 "С протягом 30 секунд, (3) 8 циклів з: 94 "С протягом 30 секунд, 53 "С протягом 30 секунд та 72 "С протягом 30 секунд, (4) 727С протягом 30 хвилин (згідно з 5сепивєїЇКе 2000).

Продукти ПЛР аналізували методом капілярного електрофорезу на приладі АВІ 3100

Сепеїїс Апаіузег з використанням 22 см капілярного блока з полімером РОР-7 "М (Арріїєйа

Віозувієтв). (15500 112 (Арріїєд Віозузіет5) використовували як внутрішній стандарт розміру.

Електроферограми аналізували з використанням АВІ Ргізт Сепезсап (м 3.7, Арріїєа Віозувієтв) і генотипні дані кількісно оцінювали з використанням АВІ Ргізт Сепоїурег (м 3.7, Арріїєй

Коо) Віозубієтв).

Рослини, досліджені як описано вище, потім додатково характеризували шляхом проведення хімічних аналізів. Шість інфікованих кільчиків були додатково проаналізовані на присутність алкалоїдів, пов'язуваних з присутністю ендофітів, таких як індолдитерпени, алкалоїди ріжків, перамін та лоліни. Зразки типових представників кожного грибкового генотипу збирали для більш детального генотипування з використанням праймерів, вибраних для локусів поліморфних 558.

Результати в Таблиці 2 та на Фігурі 2 показують, що ендофіти за даним винаходом належать до одного клада, позначеного як Група 1 у Таблиці 2, і можуть бути охарактеризовані як такі, що мають спільними принаймні більшість розмірів алелів 554 для локусів 55Н, вказаних у Таблиці 1 та Таблиці 2. Інші ендофіти у Таблиці 2, Таблиці З та на фігурі 2 є прикладами, призначеними для ілюстрації наявності та співвідношень з ендофітами інших типів, які не відповідають вимогам даного винаходу.

Таблиця 1.

Праймерні послідовності 55К. вто | прямий | СОСТСАССОСТАСАТАСАССАТОЯ | 011000011013 воротний| СТСАТССАСТААСОСАСССВАСЯ |10101010101010101011014 апебі9 | прямий | ТАССТСТОСАСОсСТОТАТОС | 2 6 ЮЩщ1|Б5.Б Б 771 воротний| ТОСАТААСАСТСАССТТАТАЄТСЯ | 310101010101010101011116 апе33 | прямий | ССОТСАСОАСОСТАСАТАЄАА | 012 | 7 711 зворотний| ТТОСАЛОСТОДАСАДААСТСАА 11010118 205027 | прямий | САТОАССТАТСТІОАТОСТАССАЄ | 0121 юЮщ8 70 воротний| ССТОТАТАААСТТСООСАТОСТАТ 10101010 205031 | прямий | САСАТАТССССТСТОСТЗАТСТАА 10101211 700 воротний| САСАСССТТАСАСТАТСААСТТОСС | 31010101010101010110112 се50004| прямий | САСТАААСАСАСССАЛОААСААСА | 2113 1 |зворотний| АСАСАССТААСААСТТТТССССТТ | 1.74 се50022 | прямий | АССТІТССААТСАССАСАТАСАТА | 012115 воротний| ТААТТТАСОСТАССАТТТТСТОСЯ | 30101010101010101116 се50041| прямий | ССТСССТАТТСТААТОСАЄСТАТЕ 0012117 7000 | Бворотний | САСТОТАССОСАСТТТОТСААТАЄ | 11101118 се500БА прямий | ТСТАТААТАААСАТОСССТОСТсТ | 2. 16.19 771 | воротний| СТОТТОАДАСТТОТТОСАТСАЄТЬ | 10101010101010101120 се500б0| прямий | СОАААТТСТАСАСТАТаТТОСАЄС | 012121 воротний| СТАСАТОТАТТТТОЛОСАССОСТТ | 0101010101010101011122 -се500б1| прямий | САСТОЛОАСССССТОТАСТААСТС | 012123 7000 | зворотний| САСТСАТТСТІСОТОСАТТЯТСТТ | 551 24 се500б7 | прямий | САААТОАОССОТСТАТСТТАААЄС | 2..1..25 1 зворотний| ТТТСТТСАТТТССААЛСААСААСА 11010116 -се50093| прямий | СТОСТАСАСАТАСТТОСААСАТЕЯ | 012127 71 оворотний| САСТОСААТААТТТАСССАССАТТ | 10111128

Таблиця 2.

Розміри алелів 558. 00010111 РозмірипродуківПлРоює 3333 пе п С ПО ПОЛ КОХ КОНТ: ЗУ НО пе п ПО ПО ПО ПОН то НО пе п с по ПО ПОЛ КОН с НО НО пе Ех и ПНЯ ПО ПОЛ КО КОХ 11111111 пе п ПНЯ ПО ПОЛО КОН КОХ пи Пт І ПО ПОНЯ ПОЛЯ ПО ПО пед я ПО ПО ПО ПОН: То НО 17001170 257 | 26 пили ПЕ ТЕ ПНЯ ПОНЯ НОЯ НО пох НО пе т п ПО ОН КОН: ЗУ НО пе п ЕС ПОЛЯ ПО КОХ КО НО 1 розмір алеля -/- 0,5 п.о. 2 Для усіх локусів 558, за винятком В10, розмір продукту включає близько 25 п.о., що належать до послідовностей М13 та "свиний хвостик" (рія їаї!)

ЗГрупа 1 - АК3039, 3046, 3049, 3050, 3064, 3067, 3068, 3073, 3074, 3076 та 3078 зГрупа 2 - АК3002, 3005, 3015, 3017 та 3020

ПРИКЛАД З

Виділення штамів грибкових ендофітів

Гриби були виділені з великого числа інфікованих ендофітами рослин після поверхневої стерилізвції рослинних тканин, як загальновідомо в даній галузі техніки, зокрема, як описано

СНгізіепзеп еї аї. (2002). Пагони видаляли з рослин зрізуванням у основи та укорочували до приблизно 5 см, після чого піддавали поверхневій стерилізації. Розрізані пагони піддавали поверхневій стерилізації шляхом швидкого промивання 9695 етанолом та витримування протягом 1 хвилини в 1095 відбілювальному (рієасі) розчині з подальшим промиванням двічі у стерильній воді. Пагони розрізали в поперечному напрямку; стеблові вузли (5пеаїй гіпдв) відокремлювали та поміщали на картопляний агар з декстрозою (АВРОА) з 5 мкг/мл антибіотика тетрацикліну. Чашки Петрі інкубували у темряві при 22-25 С протягом 3-5 тижнів. Культури могли пересіювати на таке саме середовище.

Культури аналізували на швидкість росту колоній, морфологію колоній, здатність продукувати конідії, діапазон розмірів конідій, послідовність генів ВД-тубуліну ирг) (Мооп еї аї. 2004) та інші описові ознаки, які усі брали до уваги при селекції ендофітів для додаткових аналізів.

Вибрані культури, одержані та, в деяких випадках, пересіяні у споосіб, описаний в даному прикладі, були використані для тестування інокуляції та можливої стійкої інфекції кільчиків зесаїє сегеаїІє, як описано нижче.

ПРИКЛАД 4

Опис ендофітів іп міо характеристики при вирощуванні на РОА (картопляний агар з декстрозою) узгоджувалися з описами Меоїурподішт (СНгівієпзеп еї аї., 1993; Сієпп єї аї., 1996), маючи швидкість росту від повільної до помірно повільної, зі значеннями в діапазоні від 4 тижнів і більше на РОА. Колонії підвищені над агаром, білі, схожі на вату, скручені від незначного до сильного ступеню, повстисті, з численними повітряними гіфами. Зворотний бік колоній від жовтувато-коричневого до кремового на краях. Конідіогенні клітини були відокремленими, піднімалися перпендикулярно над гіфами, мали ширшу основу і звужувалися на кінці. Фіалідні конідії були склоподібними, гладкими, від човноподібних до серпоподібних, 2,05-14,96 мкм в довжину х 1,37-8,19 мкм в ширину. Жоден з ізолятів не був стерильним. Індивідуальні характеристики штамів наведені у Таблиці 3. ши Таблиця З п В в в В в Вр Мін р оМакевтєєь мін зр макет у кювлони етандх пом авян З ЕНДОфІ довжина ширина: у довжина цаовжинат: ширина ширина ум УВіджеЗ

Бутивдапиісиє ГОАВОТ З001 ОЇ Ба | х | 22 | | 409 | 749 | | 157 | 2оз | | їв | то (Еутивааниісиє | АНОГОЗ005 1 464 | х | гає | | гою» | Бе | | 170 | 3830 | | гол | ол (Бутиєзр. ГОАВ | 3005 | 430 | х | 2ме | | зво | 541 | | 2о5 | злив | | гаю | 2 (Бутивзр. ГАВ Ї| 3015 | 487 | х | глив | | зво | вві | | 161 | зов | | 268 | о (Бутиввр. ГАЙ) 53017 | 428 | х | т88 | | г2ов | 5е5 | | ї2о | 24 | | ги | 1 (Бутиєзр. ГОАВ | 3018 | 405 | х | 267 | | з35 | 517 | | ївв | 507 | | зве | 23 (Бутивзр. ГОДНІ 8050 | Бл | х | губ | | зе7 | вво | | 190 | зві | | 242 | з (Емутивсапіпиє ГАНСІО5039| виє | х | 3830 | | 442 | во | | 177 | 495 | | 238 | 2. (Бутивтшларів ГОДА | ЗБ | 524 | х | г2ув | | зво | 721 | | 183 | Бо | | мо | т (Бути пла | АЙ ОЇ Зо | 56 | х | заз | | 357 | 772 | | гло | 487 | | 414 | 14 (Бмутивтларів ГАВ | 050 | 580 | х | 342 | | з57 | 836 | | 231 | 429 | | 425 | 2 (Бмутивмюіпісиє АВ | 305 | 391 | х | 2гмо | | 274 | 5ло | | 137 | зл | | оз | 48 (Бути парів |ГСАВСТОВОБЯ | ї2ив | х | 654 | | вл! | ї496| | 454 | вло | | 230 | 54

Бмутивитаюєпі ГОАН | 3062 | 6ло | х | 424 | | 500 | ввв | | ззо | 496 | | т25 | 2 (Бутивтларів ГОАВ | 3068 | вою | х | 334 | | 467 | 791 | | 236 | 408 | | зву | 18

Бутовсаптшя | АП, юю 636 | х | зи | | 52 | 989 | | 281 | ля / | 160 | 06

Бутивсапіплиє ГОАВ Ї| 3074 | 624 | х | 354. | | 5го | 731 | | 2в4 | 422 | | зав | 5 зобейеше | ла зо во | х | зва | | ові | ми | | зо | лю | м | зм зер. бгеуйоїїи5 ОА 6,02 х 3,63 2,81 7,47 3,01 4,89 34,5 1 пехлне | м ле! зе. 1» | | се Та не ЇаоЇ ьо маг. охспепвів ДИ х 3,33 4,49 7,31 2,51 4,54 51,6 0,7

ПРИКЛАД 5

Використання послідовності гена рД-тубуліну для визначення співвідношень ендофітів з відомими видами Еріспіоє

Грибковий ендофіт злакових може належати до видів Еріспіоє або видів Меоїурподішт.

Деякі, але не всі види Меоїурподійт, є очевидно гібридами, похідними від двох чи більше видів

Еріспіоє, як було виявлено у першу чергу шляхом порівняння вибраних генних послідовностей (Мооп єї а!., 2004).

Присутність численних алелів деяких локусів, використаних для аналізу 55414 ендофітів (як у

Прикладі 2 вище) може вказувати на те, що клади, до яких вони належать, імовірно мають гібридне походження.

Генні послідовності їшб2 трьох прикладів ендофітів, АК30О39, АК3046 та АКЗО064, описані в

Зо цій заявці, були проаналізовані з використанням методу Мооп 6вї аї. (2004) з незначними змінами для визначення ймовірності того, що ендофіти є похідними від одного чи декількох розпізнаваних видів Еріспіоє. Чотири інші ендофіти, очевидно з інших кладів, також були аналогічно проаналізовані для виявлення їх співвідношення з відомими видами Еріспіоб.

Праймери та умови, використані для ПЛР-ампліфікацій, були модифіковані у спосіб, який дозволяє краще забезпечити, щоб численні алелі 2 були спостережуваними в усіх зразках, для яких гібридне походження вважається ймовірним або можливим. Вибраними праймерними послідовностями були прямий праймер ТО СС ТСА СОА СОС АСА АС (КО251-Е) (5ЕО І

МО: 29) та зворотний праймер ССС АТА САТ ТАС АСС ТТ Сто осо (К.О252-8) (5ЕО І МО: 30), вибрані з метою одержання продуктів ПЛР ендофітів з ЕІутиз 5рр., що відповідають по суті та включають відповідні послідовності, описані та використані для визначення співвідношень ендофітів Еріспіоє та Меоїурподішт та їх гібридів (Мооп єї аїЇ., 2004). ПЛР проводили з початковою стадією при 952 (3 хвилин); 35 циклів при 952 (30 секунд), 622 (30 секунд), 722 (45 секунд); кінцева стадія 722 (5 хвилин).

Продукти ПЛР були секвеновані за способом бапдег (1997) на ДНК-аналізаторі АВІ РВІЗМ 3700 (Арріїєй Віозузіетв5). Послідовності, які містили численні перекривні піки, вважалися такими, що походять від гібридів, в той час як ті, для яких цього не спостерігали, вважали похідними від не-гібридів.

Клонування ПЛР-ампліконів, коли існували свідчення (походження від) декількох послідовностей, проводили з використанням набору ТОРОФ ТА Сіопіпдб (з вектором рСКФІ2.1-

ТОРОФ)) (Іпмігодеп). До 10 клонів секвенували, як описано вище, та проводили вирівнювання з використанням модуля АїЇїдп Х приладу Месії МТІ Адмапсе 11 (Іпмйгодеп), з послідовностями індивідуальних алелів їШра.

Індивідуальні алелі шШр2 були віднесені до найближчих негібридних видів Еріспіоє у такий спосіб: послідовності вирівнювали з використанням бОіаїйдп-ТХ (З!ибгатапіап єї аї., 2008) і дерева максимальной імовірності були побудовані з цього вирівнювання з використанням комплекту програмного забезпечення РнНуіїїр (Ееібепвівіп, 2005). Для створення кінцевого дерева запускали програму ОМАМІ. з використанням 1000 циклів самоналагодження (рооївігарв) та трьох рандомізацій порядку введення послідовностей на комплект даних (рег 5еї) і зводили в одне консенсусне дерево з використанням підходу правила більшості. Дерево було одержане з використанням ЮОепагозсоре (Низоп еї аіІ., 2007) для найближчого віднесення відомих видів

Еріспіоє до вибраних ендофітів.

Ендофіти АКЗ3039, АКЗ3046 та АКЗО064, описані в цій заявці, дають дві послідовності їиб2, які узгоджуються з ендофітами, що є гібридами Е. Бготісоїа та Е. атагіап5. Цей гібрид не був досі описаний і може вважатися новим видом, який поки що названий Е. рготісоїа х атагіапв.

Штами ендофітів АК3049, АК3050, АК3067, АК3068, АКЗ3073, АК3074 та АК3078 утворюють групу, близьку до АК3039, АК3046 та АКЗ3064 за даними 55Н-аналізу (Фігура 1) і можуть також

Зо вважатися такими, що найбільш імовірно належать до Е. Бготісоїа х атагійап5. Три інших ендофіти у порівняльному тестуванні були віднесені до однієї групи з Е. бготісоїа, і один з інших ендофітів - з Е. уапдлі - вони є представниками інших груп ендофітів зі спільними конфігураціями 558-генотипів, спостережуваних для зразків, джерелом одержанння яких були

ЕІутиз 5рр.

Об'єднані дані для 55К та р-тубуліну дозволяють припустити, що штами ендофітів АК3039,

АКЗ3046, АК3049, АК3050, АК3064, АК3067, АК3068, АКЗ3073, АК3074 та АК3078 утворюють репрезентативну групу щойно охарактеризованих ендофітів, що можуть вважатися функціональним кладом, які можуть бути перенесені з їх нативної рослини-хазяїна до альтернативного хазяїїна, бесаіє, з утворенням штучно створеної стабільної симбіотичної комбінації Зесаіе/ендофіт, причому інфікований хазяїн 5есаіє демонструє нормальний ріст та має нормальний життєвий цикл.

ПРИКЛАД 6

Інокуляція грибкових ендофітів роду епіхлое (Еріспіоає) в бесаїеє сегеаїє

Насіння 5есаїе сегеаіє, сорти Кайи, Атіїо та "КУУ5", та вибрані сорти 5. сегеаІє, одержані від д-ра Марка Ньюелла (Ог Ма/к МемеїЇ, Те Затиє!ї Вобепз Мобіє Еошйпааїййоп) (МЕ95307А,

МЕ953198, 97326, Ваез К54, або МАТОМ2) були піддані поверхневій стерилізації та інокульовані, як описано асп апа СпПгізіепзеп (1985). Насіння піддавали поверхневій стерилізації шляхом занурення в 5095 розчин сірчаної кислоти на 15 хвилин з подальшим п'ятикратним промиванням водопровідною водою, та зануренням в 1095 розчин побутового відбілювача (Чапоїа) на 15 хвилин з подальшим промиванням два рази у стерильній воді.

Насіння висушували у шкафу з ламінарним потоком повітря на стерильному фільтрувальному папері М/найтапп перед розкладанням на чашках Петрі з 495 водним агаром. Насіння на чашках пророщували у темряві при 22-25"С протягом 4-9 днів та утворені етіольовані кільчики інокулювали перед поверненням до темного інкубатора на 7 днів. Після цього інкубаційні чашки поміщали під біле флуоресцентне світло принаймні на 7 днів, і потім видаляли кільчики та висаджували їх в комерційну горщикову суміш та вирощували у теплиці. Рослини вирощували протягом близько 6 тижнів до проведення ідентифікації інфікованих особин. Інфіковані рослини ідентифікували методом бітреоп єї а). (2012). Рослини вирощували далі у теплиці для дослідження фенотипу інфікованих рослин у порівнянні з типовими неінфікованими рослинами бо і, зокрема, для визначення, чи будуть утворюватися суцвіття та насіннєві голівки.

Зведення успішних інокуляцій, позначених "так", наведене у Таблиці 4 для тих штамів ендофітів, де принаймні деякі з інокульованих рослин мали по суті нормальний фенотип та були здатними розвиватися в нормальному життєвому циклі (Фігура 2). З рослин збирали насіння, як вказано у Таблиці 4.

Таблиця 4.

Штами, якими інокулювали та інфікували 5. сегеаІеє, та приклади продукування насіння.

ШЕ ЕЕ Я

Спроби с. . о. . . -. | інфіковані |рослини 5есаїе було інфіковане

Ендофіти інокуляції с. рослини продукують інфіковане життєздатними зЗесаїє . . . зЗесаїє насіння ендофітами ендофіти

АнЗзО46/

АнЗзО46/

АНЗО46/ Ваїез

АнЗзО46/ "інокульований в 5. сегеаїє маг. Вапи "х інокульований в 5. сегеаїє маг. Атійо "«хінокульовані зразки жита (Зесаїіе сегеаіє) від д-ра Марка Ньюелла (Пе бЗативє! Кобрегів

Мобіе Рошипааїййоп). Варіант як вказано: МЕ9У5307А, МЕ953198, 97326, Ваїез Н54 або МАТОМ.

БВП - буде визначено пізніше

Так - очікуваний результат

ПРИКЛАД 7

Продукування алкалоїду в інфікованих ендофітом природних батьківських рослинах

Листкові пластинки та псевдостебла рослин ЕІутив тиїабіїв5, ЕІутив сапіпив, ЕІутив игаІепві5, ЕІ(утив пем5Кії та ЕЄІ/утив тиабіїї5 маг. о5сПепвів, інфікованих конкретними штамами ендофітів, аналізували на лолінові алкалоїди та перамін з незначними модифікаціями загальновизнаних методів (Кеппеду апа Виби, 1983; Маїе5 єї аЇ., 1989) та на перамін (Вазтивззеп єї аї., 2012). Результати наведені у Таблиці 5. Загальна кількість лолінових алкалоїдів у листках досліджених рослин була вище, ніж у псевдостеблах. Без бажання обмежуватися теорією зазначимо, що, на думку авторів винаходу, загальна кількість алкалоїдів, присутніх в досліджених рослинах, є репрезентативною для діапазону, що є достатнім для забезпечення принаймні деякого захисту від шкідників для рослини-хазяїна (М/їКіпзоп еї аї., 2000). Ці результати показують, що ряд штамів ендофітів, які входять до клада, визначенгого за даними для 55 та р-тубуліну, наведеними в інших розділах даного документу, в стані іп ріапіа можуть надавати симбіотичній комбінації здатність продукувати вимірні кількості лолінових алкалоїдів або пераміну або обох.

Таблиця 5.

Загальні кількості лолінових та перамінових алкалоїдів в інфікованих ендофітами батьківських рослинах ЕіІутив.

Лоліни(мкот) (1 Пераміне (мкг) піший піший пішши пішш 7 Листковапластина | 465.1.....660 піший вій піший

АНЗО7

АНЗО74 іш

АНЗО7

Примітка: " аналіз методом (СС-РІЮО (газова хроматографія з полуменево-іонізаційним детектором), 2? аналіз методом І С-М5 (рідинна хроматографія з мас-спектрометрією)

ПРИКЛАД 8

Джерело та географічне походження вибраних ендофітів Е(утив 5рр.

У Таблиці 6 перелічений ряд виділених штамів ендофітів, розкритих в даному документі, номери доступу джерел, з яких вони були отримані, гадані види вихідних зразків (ассезвіоп) рослини-хазяїна та регіональні джерела зразків. Рослини-хазяї ЕІутив5 5рр. загалом були одержані з центральної Азії.

Таблиця 6.

Штами виділених ендофітів із зазначенням числового коду АВ, гаданого вихідного виду-хазяїна, регіонального джерела та номера доступу зразка.

САВЗОг9 | 0 Ботшарів 00| 00 Озероїосик куль, Киргизстані | РІО 564954

САВЗОБО | Ботшарів 00| 00 Озероіосик куль, Киргизстан | РІО 564954

САвзові | Естларів | ГорнийАлтай, Росія | РІ | 564949. ! Алма-Ата

АК3овИ Блю 0 дмайнукаюакттн | МО БиТеВ

Перевал Чіке-Таман

АВЗО74 Е. сапіпив (СпеКеїетап Развз5), 564915 нове | Бшушж пн»

Гори Киргизького

АНЗО7б6 Е. тшиїабіїї5 маг. оБспепвів Алатау (Кпіді2-Аїазац), 531640

Киргизстан

САвзохВ | 0 Єспеуеюі 00| 0000 НовосибірськРося | РІ | 564925

Примітки 1. Воуаї Воїапіс Сагаепв, 5еей Сопзегуайоп Оераптенпі, Агаіпдіу, ОК 2. РиПтап Інзійше, Ууазпіпуюп 5іаїеє Опімегейу, РиПтап, МА., ОА

З. Могаіс Сепеїїс Везоигсе Сепіге (Могасеп), АІпагтр, Зугедеп

ПРИКЛАД 9

Продукування алкалоїду в рослинах 5есаїє сегеаїє

Кільчики Зесаїе сегеаіе, сорт Вайи, інокулювали ендофітами, переліченими у Таблиці 7, вирощували у теплиці та підтверджували присутність в них ендофіта при по суті нормальному фенотипі рослин. Листкові пластинки та стебла окремо аналізували на лолінові алкалоїди (Кеппеду апа Вих, 1983; Магїез еї аї., 1989) або перамін (Сагіймайе еї а!., 1994). Результати в

Таблиці 7 показують діапазони концентрацій як для лолінових алкалоїдів, так і для пераміну.

Без бажання обмежуватися теорією зазначимо, що, на думку авторів винаходу, загальна кількість лолінових алкалоїдів та пераміну, присутніх в досліджених рослинах, є характерною для діапазону, що є достатнім для забезпечення принаймні деякого захисту рослини-хазяїна від шкідників (Коулап 1993; УМІКіпзоп еї аї., 2000; Васепу єї а!., 2009а 20095).

Таблиця 7.

Результати аналізів алкалоїдів в рослинах 5. сегеаїє (до З рослин), інфікованих ендофітами.

Лоліни! (мкг/г) Перамінг (мкг/г) 7717 ваш 1 по Середнє) Діапазон | по | Середнє | Діапазон»

Листкова 7 Стбло 6 | 87 | 6510 | 6 | 167 |162и

Листкова 167-280 151-160

Листкова Стбло | 6 | 362 | 250-669 1217203

Листкова о Стбю | 1 1 321 1 | 5 1 68 48724

Листкова 3272 ї2-68

Листкова тела 1 101 3631

Листкова 7 Стблю (| 6 | 276 | 122-488 58245

Листкова 10-82 16-36

Листкова 392-470 255

Листкова 92-437 пава

Листкова 39-607 36240

Примітка: " аналіз методом СС-РІЮ, 2 аналіз методом ЕГПІБА (твердофазовий імуноферментний аналіз)

ПРИКЛАД 10

Комбінації ЕІутив тиїгабіїїз/(ендофіт виявляють біологічну активність проти шкідників злаків

Через відсутність контрольних Е. тшабіїх, що не містили б ендофітів, використовували вівсяницю лугову з її природним ендофітом (Меоїурподішт ипсіпаїшт) та без нього, оскільки вона, як відомо, продукує лолінові алкалоїди та виявляє відому активність проти попелиці.

Вплив на попелицю

Попелиця НКПораїозірпит раді є важливим шкідником злакових рослин, тому що вона переносить вірус жовтої карликовості ячменю.

У біологічному аналізі з вибором, що проводився з використанням пагонів у чашках Петрі,

число АпПораїовзірпит раді на ЕЄ/уутив тиїабіїїз, інфікованому АНЗО5О, було близьким до кількості на вівсяниці луговій, інфікованій її природним ендофітом Меоїурподішт ипсіпайт, та істотно меншим, ніж кількість попелиці на контрольній вівсяниці луговій, що не містить ендофітів (Таблиця 8).

Таблиця 8.

Кількість попелиці В. раді, знайденої на пагонах Е. тиїабіїї5, інфікованих

АНЗО5О, та на вівсяниці луговій з (МЕ Ех) та без (МЕ Е-) її природного ендофіта М. ипсіпаїшт у випробуваннях з вибором протягом З днів. 00011111 | 1111 Кількістьпопелицьлаюн.//-/-://.-ЗО 0000000 МЕЕ 17171110 0 1 08

Результати цих випробувань дозволяють припустити, що лолінові алкалоїди, продуковані в результаті утворення симбіотичної асоціації між Е. тшаріїйх та АКЗ3050, можуть відлякувати попелицю від поїдання рослин, як це видно на пасовищних травах (МІіКіпзоп еї а!., 2000).

Вплив на кліщів Асегіа

Асегіа 5рр., зокрема А. (о5іспеїІа, є кліщами, які переносять вірус смугастої мозаїки пшениці в Австралії. Кліщ, використаний в цих випробуваннях, був ідентифікований як такий, що належить до Асеїіа 5рр., гадано як А. гозіспейа.

Через відсутність контрольних Е. тшиїабіїїх, що не містили б ендофітів, та невідомий ефект генотипу рослин на поширеність кліщів Асегіа, вплив лолінових алкалоїдів на кліщів оцінювали на шести рослинах вівсяниці лугової, інфікованих ендофітами, та на шести рослинах без ендофітів. Кліщів Асегіа підраховували на трьох пагонах кожної рослини. Істотно більше кліщів було присутньо на рослинах без ендофітів, ніж на інфікованих ендофітами (кілдькість/пагін: 74 для Е-- порівняно з 454 для Е-. Р«0.001). Результати наведені нижче у Таблиці 9.

Таблиця 9.

Середня кількість кліщів Асегіа на двох листах трьох пагонів на шести рослинах вівсяниці лугової з (Е-к) та без (Е-) ендофітів М. ипсіпайт. 01771111 ЕЕ 17 | 5ЕО(ствідхилу | Значущість.://ГІ

Як показано вище у проведених дослідженнях, результати цих випробувань з кліщами дозволяють припустити, що лолінові алкалоїди відповідають за відлякування травоїдних кліщів, аналогічно впливу на попелицю, який був продемонстрований на пасовищних травах (М/іїКіпзоп еїа!., 2000).

Вплив на яблуневу міль

Відомо, що ця комаха є чутливою до біологічно активних речовин, продукованих ендофітами райграсу пасовищного. Вона була використана тут для того, щоб продемонструвати присутність біологічно активних речовин у рослинах Е. тиабіїї5, інфікованих АНЗО46.

Зо Був виявлений дуже сильний ефект АНЗО46, коли рослинний матеріал Е. тшиабії5, узятий від рослин, інфікованих АНЗО46, був включений до штучного раціону, яким годували яблуневу міль. Середній процент личинок, які прижилися та почали годуватися протягом перших 24 годин після приміщування новонароджених личинок на тестовані раціони, складав: 8895 в середньому для трьох інших видів ЕІути5, не інфікованих ендофітами, у порівнянні з 495 для личинок, раціон яких містив Е. тиїабіїї5, інфікований АНЗО46. На День 10 випробувань, 6095 личинок, яких годували рослинним матеріалом без ендофітів, пройшли линяння до першої вікової стадії

(іпвіаг) у порівнянні з лише 1395 личинок, яких годували АНЗО46, що линяли до перщої вікової стадії. Результати цих випробувань навдені нижче у Таблиці 10.

Таблиця 10.

Частка яблуневої молі, яка прижилася на раціонах після 24 год. та почала годуватися після 24 та 48 год., і середній час до першого линяння при приміщуванні на раціони, що містять ліофілізований рослинний матеріал ЕІути5 без ендофітів або інфікований продукуючими лолін ендофітами АКЗО046. прижилися годувалися линяння 111111111171111111гагод.//// | 24год. | 4в8год. | Іпднів/

Еутив тшаріїв| АНЗОїЄ | 005 2 щ | 005 | 000 | 2716 80 | 77777177 0и53 | олбо2г | 02 | 010792

Р Ї77771717171717171711717171711111лк0001 | «0001 | «0001 | «ФО

Результати цих випробувань з міллю є сильним свідченням на користь того, що АНЗО46 продукує лолінові алкалоїди, відповідальні за відлякування травоїдної яблуневої молі.

ПРИКЛАД 11

Захист від шкідників інфікованого ендофітом бесаїє

Був поставлений експеримент з випробування здітності ендофіта захищати Зесаїе від кореневих нематод (РгаїуїІепспив 5рр.), з використанням пагонів бесаїє сегеаІє, сорт Вайи, з ендофітом АКЗ3046 або без нього. Одинадцять індивідуальних пагонів Ек та Е- Капи, вибраних з 4 незалежних батьківських рослин на групу обробки (2-3 клони на батьківську рослину) пересаджували в глибокі лотки (деер гоої ігаіпегх) розміром 5х5х12 см, що містять 100 г зібраного в полі грунту з природним зараженням 30 Ргаїуієпснпив 5рр. на 100 г. До кожного лотка додавали додатково 30 вирощених в лабораторії Ргаїуієпснив репеїгапе, так щоб кожна рослина була доступною для 60 нематод. Рослини інкубували в освітлюваній камері росту при 7С протягом 30 днів. Рослини потім видаляли з грунту, корені промивали, потім очищали з використанням 1,595 хлориду натрію протягом З хвилин. Нематод у коренях забарвлювали з використанням анілінового синього в гліцерині. Корені потім аналізували під мікроскопом та 20 підраховували число нематод у кореневій системі. Ендофітна інфекція не впливала на вагу коренів.

Присутність ендофіта АНЗО46 спричинювала значне (Р.-0,05) зменшення числа нематод на кореневу систему (Таблиця 11).

Як було показано у випробуваннях з відлякування комах, описаних вище, результати цих випробувань з нематодами надають сильні докази на користь того, що лолінові алкалоїди, продуковані АНЗО46, відповідають за надання інфікованим бЗесаіе принаймні деякого рівня захисту від шкідників шляхом перешкоджання колонізації нематодами коренів інфікованих ендофітами рослин бесаіе. Це узгоджується з тим, що для лолінів були продемонстровані ефекти відлякування та пестицидної дії на нематод (Васецйу еї а!., 2009а 20096).

Коо)

Таблиця 11.

Число кореневих нематод (Ргаїуепсвпиз 5рр.) у коренях рослин зесаїе сегеаІє, сорт Напи, з ендофітами (АКЗ3046) та без ендофітів (Е-) (Р - 0,013).

ПРИКЛАД 12

Вплив Зесаїйе сегеаїе маг. "Капи", інфікованого ендофітами АКЗ046, на Сегодопіна айзігаїї5

Злакові трави та зернові в Новій Зеландії та Австралії часто інфікуються личинками мінуючої мухи Сегодопіна айзігаїїв (Оірієга: Адготу?ідає), також відомої як упеаї 5Пеаїй тіпег (мінер піхв листків пшениці). Личинки цієї мухи поїдають зсередини тканини ряду злакових та зернових, спричинюючи ушкодження, які можуть призвести до загибелі пагона. Мінери залишають видимі сліди у листках.

В цьому експерименті рослини 5. сегеаїе су. Капи, інфіковані продукуючим лолін ендофітом

АКЗ046 або неінфіковані (Мії), були піддані зараженню б. айзігаїї5. Вівсяниця лугова, інфікована її природним ендофітом Меоіїурподійт ипсіпаїййт, була включена в експеримент тому, що цей ендофіт також продукує лолінові алкалоїди.

Метод

По шість рослин кожного з бесаіє "Напи", інфікованого АНКЗ3046, та вівсяниці лугової, інфікованої М. ипсіпашт, з їх аналогами, що не містять ендофітів (Мі), порівнювали на їх вплив на зараження б. айзігаій5. Рослини випадково розподіляли на однакові експериментальні групи, які включали по одній рослині кожного типу, і по чотири лялечки мінуючої мухи, вирізаних з рослин райграсу пасовищного, вирощуваних у наметі (5стееппоизе) розміщали у основи кожної рослини (між пагонами). Крім того, по одній дорослій самці та по одному самцю мухи, які вже вилупилися із зібраних лялечок, випускали в експериментальні групи 1-5, і одного самця - в експериментальну групу 6. Кожну експериментальну групу з чотирьох рослин накривали тонкою сіткою, натягнутою на проволочну клітку. Клітки знімали з рослин через 2 тижня після їх встановлення. Експеримент проводили у теплиці з максимальною денною температурою 22 "Сі рослини поливали вручну у разі потреби.

Число пагонів і кількість та довжину ходів личинок в кожному листі реєстрували через 4 та 6 тижнів після розміщення лялечок та дорослих комах на рослинах, і присутність ушкоджень від личинок або лялечок в кожному стеблі - через 6 тижнів.

Лічильні дані піддавали логарифмічному перетворенню (п), і пропорційні дані перетворювали добуванням квадратного кореня перед проведенням аналізу за допомогою програми Сепвіаї міб методом дисперсійного аналізу (АМОМА) з даними, зблокованими по експериментальним групам.

Результати

Лише одна з шести рослин РНапйи, інфікованих АНЗ3046, була заражена мухами, у порівнянні з усіма шістьма рослинами Напйи МіїЇ. Число пагонів/рослину (Р«0,001) та частка пагонів (Р«0,002), заражених б. ашйвігаї5, на Вапи, інфікованих АНЗО46, були істотно нижчими, ніж на Вайи МІії, в обидва моменти контролю через 4 та 6 тижнів (Таблиця 12). Крім того, АНЗ0О46 знижував число ходів/рослину (Р«0,001) (ходи є вертикальними слідами, які залишають личинки, що поїдають

Зо тканини усередині рослини), та число стебел пагонів (тобто, нижніх частин кожного пагона), які були ушкоджені або містили личинок чи лялечок.

Рослини вівсяниці лугової були загалом сильніше заражені мухами, причому всі рослини були атаковані. Інфекція М. ипсіпашт у вівсяниці лугової знижувала частку пагонів, заражених б. айзігаййв в моменти часу 4 (Р.-0,007) та 6 тижнів (Р«е0,002) (Таблиця 12). Крім того, істотно менше (Р-0,05) стебел пагонів були ушкоджені або містили личинок в інфікованій ендофітом вівсяниці луговій у порівнянні з рослинами без ендофітів.

Середнє число живих пагонів, число ушкоджених пагонів, частка ушкоджених пагонів та число ходів/рослину, спричинених Сегодопійа айзігаїї5 через 4 та 6 тижнів після того, як лялечки та дорослі комахи були випущені на рослини бесаїє сегеае маг. "Вапи" та вівсяниці лугової з (МЕ М. пс.) та без (МЕ Мії) ендофітів, наведені у таблиці нижче. Середнє число пагонів з ушкодженнями та або лялечками у стеблі пагонів наведене для контрольної перевірки в момент часу 6 тижнів. Дані для середніх чисел піддані логарифмічному (Іп) перетворенню і дані для часток перетворювали добуванням квадратного кореня.

Таблиця 12. 2 2 11111111 феманвоввіваююі кю МБО рзнацення| начення, 4тлижняд/////711111111111111111111Г1111111111111Сг1111Ї11сг1

Іближнів////77777777771111111111111111111Ї111111111111171СГ111Ї1111с11111г11 (Числоушкоджених пагонів)рослину.ї | -0,69 | 182 | 2,50 |29210332| -001 | 0 (Часткаушкодженихпагонів.//////// | 1000 | 053 | 062 |103 1 0лЛО6| -001 | 0002 (Число ходів|дослигуї 7777111 | 069 | 224 | 2,71 |5,3510,930| -001 | 0075

Число пагонівзушкодженням стебла | -0,69 | 155 | 1,66 |252|0396| -001 | 0,046 "БЕ - стандартна помилка різниці для порівнянь усіх чотирьох груп обробки гр-значення призначені для порівняння між інфікованими рослинами та рослинами без ендофітів усередині видів

Висновки

Інфекція бЗесаіе су. Вайи, інфікованого продукуючим лолін ендофітом АНЗО46, істотно знижувала зараження мінуючою мухою Сегодопіна ашйвігаїї5. Інші продукуючі лолін види ендофітів вівсяниці лугової також знижували частку пагонів, ушкоджених личинками мух та число пагонів з ушкодженням стебла.

Результати цих випробувань надають сильні докази на користь того, що лолінові алкалоїди, продуковані АНЗО46, відповідають за надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників інфікованим 5есаїє зрр. шляхом зниження зараження б. айзігаїї5 інфікованих ендофітом рослин

Зесаіє зрр. Це узгоджується з продемонстрованими для лолінів ефектами відлякування та пестицидної дії на інших комах та шкідників рослин (сага єї. аіІ., 2007; Васейу еї а!., 2009а 20096).

ПРИКЛАД 13

Вплив "Кайи" бесаїпє, інфікованого ендофітом АНЗО46, на пінниць

Був проведений експеримент з порівняння впливу бесаЇе сегеєаЇє маг. Вайи, інфікованого

АНЗО46, та вівсяниці лугової, інфікованої її природним продукуючим лолін ендофітом М. ипсіпаїшт, разом з відповідними неінфікованими контролями, на комаху-шкідника Рпйаєпив 5ритагійи5 (пінниця), що поїдає ксилему, яку вважають чутливою до лолінових алкалоїдів.

Рослини клонували так, щоб в кожному експерименті з різними комахами використовувалося шість генетично ідентичних рослин інфікованого Найи та інфікованої і неінфікованої вівсяниці лугової, але лише три з шести рослин Напи без ендофітів були однаковими.

Було проведено два експерименти, перший з використанням зрілих німф пінниці, які швидко розвивалися в дорослих особин, і другий з використанням молодших німф. В обох випадках на кожну рослину випускали по три пінниці В першому експерименті рослини накривали ацетатними клітками, які не були повністю непроникними для комах, в той час як в другому експерименті використовували непроникні для комах найлонові покриття. Число присутніх пінниць і число малих, середніх та великіх грудок "слини", які пінниці виділяють при годуванні, регулярно підраховували протягом кожного експеримента. бесаіє Ранйи, інфіковані АНЗО46, зменшували як число, так і кількість "слини", продукованої пінницями, у порівнянні з рослинами без ендофітів (Фігура 3).

Зо В першому експерименті, істотно менше пінниць були присутніми на рослинах з АНЗО46 порівняно з рослинами без ендофітів протягом усього експерименту, тоді як в другому експерименті зменшення кількості було значним лише на початку експеримента. На відміну від цих результатів, інфікована ендофітами вівсяниця лугова не впливала на число або на годування пінниць.

Результати цих випробувань надають сильні докази на користь того, що лолінові алкалоїди, продуковані АНЗО46, відповідають за надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників інфікованим бесаїє шляхом зниження зараження пінницями інфікованих ендофітом рослин

Зесаіє. Це узгоджується з продемонстрованими для лолінів ефектами відлякування та пестицидної дії на інших комах та шкідників рослин (сага єї. аіІ., 2007; Васейу еї а!., 2009а 20096).

ПРИКЛАД 13

Випробування з хворобами рослин

Наступні одержані іп міго результати демонструють вплив вибраних ендофітів на грибкові патогени зернових, включаючи інгібування розвитку ряду патогенних та сапротрофних грибів.

Наприклад, ряд штамів ендофітів в значному ступені (Р«х0,05) інгібували міцеліальний ріст

Еизатпцт дгатіпеагпит та ВАПігосіопіа зоЇапі (Фіг. 4 та Фіг. 5). Ці два патогени є причинними факторами фузаріозу колоса та ризоктоніозу, відповідно, які обидва є спустошливими хворобами зернових культур. Ці ендофіти мають потенціал забезпечення захисту проти багатьох хвороб зернових. Без бажання обмежуватися теорією зазначимо, що, на думку авторів винаходу, хоча досі не були ідентифіковані механізми дії, відповідальні за таке інгібування, ймовірним механізмом є антобіоз внаслідок продукування невідомих вторинних метаболітів.

Результати випробувань продемонстрували, що ряд штамів ендофітів істотно (Р«0,05) інгібує міцеліальний ріст Ризагішт дгатіпеагит (Фіг. 4) та КПігосіопіа зоіапі (Фіг. 5).

Хоча винахід був описаний як приклад та з посиланням на конкретні варіанти реалізації, слід розуміти, що модифікації та/"або удосконалення можуть бути зроблені без виходу за межі обсягу винаходу.

Крім того, у випадках, коли ознаки або аспекти винаходу описані за допомогою груп

Маркуша, кваліфікованим фахівцям буде зрозуміло, що винахід також описаний при цьому для будь-якого індивідуального члена або підгрупи членів групи Маркуша. бо Кваліфікований фахівець зрозуміє, що винахід, як він викладений та описаний в даному документі, не обмежений лише описаними аспектами, варіантами реалізації та прикладами, але також охоплює по суті та в обсязі винаходу ті варіанти та модифікації винаходу, які будуть очевидними кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки (включаючи пересічного фаївця в даній галузі техніки) з урахуванням розкриття, зробленого в даному документі, та відомого рівня техніки.

ПРОМИСЛОВА ЗАСТОСОВНІСТЬ

Штами ендофітів з роду епіхлое (Еріспісає), симбіози рослина/грибок, насіння, продуковане такими симбіозами, та способи одержання таких симбіозів відповідно до винаходу, розкриті в даному документі, усі мають промислову застосовність у вирощуванні рослин, які використовуються для споживання людиною або тваринами.

ПОСИЛАННЯ

Васену АА, 5поокК МЕ, Сієпп АЕ, Моє УР, НІії М, Сиргєайй А, Тітрег Р, Васоп СУМУ (2009а)

Тохісйу ої епдорпуїе-іптесієс їаї! Ттезсцє аїКаїоід5 апа дгаз5 теїароїйев оп Ргаїуіепспив5 зегірпеті.

Рпуїораїпоіоду 99: 1336-1345

Васенцу АА, 5поокК МЕ, Сієпп АЕ, Мое УР, Мадабпуги Р, Васоп СМ (20095) Спетогїахів дівгирійоп іп Ргаїуіепспив Зсіірпетгі Бу заї!Ї Ттезсце гоої ехігасів апа аїКаїоід5. доштаї ої Спетісаї

Есоїоду 35: 844-850

ВіапКкепвпПір 90, Зрієгіпуд МУ), УМіКіпзоп НН, Раппіп ЕЕ, Вивй ГР, сага! СІ. (2001). Ргодисійоп ої ОЇїпе аКаід5 бу щШе агаз5 епаорпуїє, Меоїурподіит ипсіпайнт, іп еїйпей тедіа.

Рпуюспетівігу 58: 395-401

Вгом/пвзівїп МУ, Сагрієп 90, Зтійй УА (1996) Модшиацйоп ої поп-Тетріаїей писієоїіде адайіоп ру

Тад ОМА роїутегавзе: Ргітег тодіїїсайнопв ІНаї Тасіїїаїе депоїуріпо. ВіоТесппідне5 20: 1004-1010

Визв І Р, УМіїКіпвоп НН, сага! СІ (1997) Віоргоїєсіїме АІКаїсід5 ої Стаз5-Рипда! Епдорпуїе зЗутрбіозев. РіІапі Рпузіоіоду 114: 1-7

Савзіда УЕ, Оцівїад СВ (1998) Сюоїдеп Аде ої Іпзесіїсіде Везеагсі: Раві, Ргезепі, ог Ешиге?

Аппиа! Немієм ої Епіото!оду 43: 1-16.

СНгівїепзеп МУ (1995) Маїпаїйоп іп Ше аріїйу ої Астетопішт епдорпуїев ої Гоїїшт регеппе,

Еевшса агипаїіпасєа апа Р. ргаїепвів Ю Тогт сотраїйріє аззосіайопв іп Ше З дгаз55е5. Мусоіодісаї!

Везеагсі 899: 466-470

Зо Спгізїтепзеп МУ, Веппей КУ, зсптій У (2002) Сгоулп ої Еріспіобє/Меоїурподіит апа р- епдорпу!їез іп Ісамез ої І оїїйт апа Ревійса дгаззевз. Мусоодіса! Незеагсі 106: 93-106

СНгізіепзеп МУ, Веппей ВУ, стій У (2001) Мазсшціаг Бипаїє соіопізайоп Бу Меоїурподійт епдорпуїез іп паїшига! апа помеї аззосіайоп5 м/йй дгаз5ев5. Мусоіодіса! Незєагсі 105: 1239-1245

СНгівїепзеп МУ), ІГейспітапп А, Комжап ОО, Таррег ВА (1993) Тахопоту ої Астетопійт

Епадорпуїез ої Таї! Резсце (Резіиса-Агипаіпасеєа), Меадом Резсие (Е-Ргаїепвів) апа Регеппіа! Вуеє-

Став (І оїйт-Регеппе). Мусоіодіса! Везвагсі 97: 1083-1092

СНгівїепзеп МУ, Бітрбзоп М/В, А! Зата!гтаії Т (2000) Іп'есіоп ої їаїЇ Тезсце апа регеппіаї гуедгазз5 ріапі5 Бу сотбіпайоп5 ої айегепі Меоїурподійт епдорпуїе5. Мусоіодіса! Незеєагсп 104: 974-978

СНгівїепзеп МУ, Заціббигу К, Бітрбоп М/В (2012) Сопзрісцоив ерірнуїйс дтоУЛИ ої ап іпіегзресіїйс пургід Меоїурподішт 5р. епаорпуїеє оп аібіопеай пові іп'огезсепсе5. Рипда! Віоіоду 116: 42-48

Евізепвівїп, у. (2005) РНМІІР (Рпуїодепу Іптегепсе РасКаде) мегвіоп 3.6. Різшіршеа ру Ше ашног. Оераптепі ої Сепоте бсієпсев, Опімегейу ої УМавзпіпдюп, 5еацше

Саппулайе І, Зргозеп /, Вгідд5 ЇЇ, СоПп А, Томуег5 М (1994) Роой диаШу оп Ше Тапт:

Іттипоїодіса! деїесіп ої тусоїохіпе іп Мем 7еаїапа разіога! адгісийиге. Роса 5 Адгісийигаї!

Іттипоіоду 6: 123-129

Сієпп АЕ, Васоп СМУ, Ргїсе В, Напіїп ВТ (1996) МоіІєсшаг рпуіодепу ої Астетопішт апа її

Тахопотіс ітріїсайоп5. Мусоіодіа 88: 369-383

Низоп 0, Віснієг 0, Вайзсп С, Оегиїйап Т, Егап:2 М, Вирр А (2007) Оепагозсоре: Ап іпіегасіїме мівуег Тог Іагде рпуіодепеїс ігеез. ВМО Біоіпгогтаїйсв 8: 460

Кеппеду СМУ, Визв ГР (1983) ЕПесі ої епмігоптепі апа тападетепі Тасіог5 оп Ше асситишиайоп ої М-асеїу! апа М-тогтуї! Іоїїпе аїКаїоїавз іп їа!! Тезсиє. Стор Зсіепсе 23: 547-552

Кошцтап А, ІГапе СА, Спгізієпзеп МУ, Егазег К, Таррег ВА (2007) Регатіпе апа оїШег Типдаї аіка!сід5 аге ехидей іп Те динаїйоп ша ої епдорпуїе-іптесієй дгаззе5. Рпуюспетівігу 68: 355-360

Іаїсп СМ, Спгізієпвеп МУ (1985) Апійісіа! Іптесіоп ої Стазвев м/йй ЕпаорпНуїев. Аппаїв ої

Арріїєа Віоіоду 107: 17-24

МаїїпомжеКкі ОР, ВеІезКу ОР (2000) Адаріайоп5 ої епдорпуїе-іпієсієд сооІ-згеазоп дгабз5е5 юЮ епмігоптепіа! зіге5565: МесНнапібзтв ої агошдні апа тіпегаї! 5іге55 (оІегапсе. Стор Зсієпсе: 40: 923- 60 940

Магзнаї! О, Типаїї В, Меїзоп І А (1999) Осситепсе ої їшпда! епаорнуїев іп 5ресіє5 ої Ума

Тйісит. Стор Зсієпсе 39: 1507-1512

МіПег 95, Ршпк МА, У/адпег МІ, Ватіе Е, Носії РС, Негепаееєп Р (2011) Ошсотез ої Ше 2011 роїапіса! потепсіацште зесіюп аї Ше ХМІІІ Іпіегпайіопаї! Воїапіса! Сопагез55. РнуюкКеуз 5: 1-3

Мооп СО, Таррег ВА, 5сой В (1999) Ідепіййсайоп ої Еріспіоб епаорпубез іп ріапїа бу а тістозаїе|Ше-базед РОСА пдегргіпііпуд аззау м/йй ашотаїеа апаїувіз. Арріїеєд апа Епмігоптепіаї!

Містобіоіоду 65: 1268-1279

Мооп СО, Стамеп КО, Іеиспітапп А, Сієтепіє 51, Зспамк! Сі (2004). Ргємаієпсе ої іпіегзресіїїс пубгід5 атопдві азехиа! Типда! епадорпуїез ої дгаззе5. МоїІесшаг Есоіоду 13 (6): 1455- 1467

Ропег УК (1994). Спетіса! сопвійцепів ої агазз епаорнуїев. Іп: Васоп, С.МУ., МУНйе г. У.Е (Едз), Віотесппоіоду ої ЕпаорнНуїйс Рипаді ої Стаззе5. СВС, Воса Вайп, НІ, рр. 103-123

Вазтиззеп 5, І апе СА, Масе МУ, Раг:опз АУ, Егазег К, Хиє Н (2012) Тне изе ої депотісв апа теїароїотіся теїпод5 їо диапійу Тшпда! епдозутріопіз апа аїКаїоід5 іп дгаззе5. Меїнод5 іп

Моїесшіаг Віоіоду 860: 213-226

Вожап ОО (1993) І оїйкетв, регатіпе апОа рахійпе: тусоїохіпе ої Ше гуєдгазв/епдорпуїе іпіегасіюп. Адгісийиге, Есозузієтв апа Епмігоптепі 44:, 103-122

Вожшап ОО, Іасн с2СМ (1994) Ніганйоп ої епаорнуїе-іпіесівє!д регеппіа! гуєдгаз5ев5 ог іпстєазей іпзесі гезізіапсе. Іп: Васоп СМУ, М/пе г. УЕ (єдвз), ВіотесппоЇоду ої ЕпдорНуїє Рипаї ої Сгазз5ез. СВО Ргезз, Воса Наюп, Еогіда, рр. 169-183 запдег ЕР, МісКІієп 5, Соцівоп АВ (1977), ОМА зедиепсіпуд м/йй сНаїіп-їегтіпаїйіпу іппіріюгв,

Ргосеєдіпдз ої пе Маїйопа! Асадету ої Зсіепсе5 ОБА 74 (12): 5463-5467 зепага! СІ, Стамеп КО, ЗреаКтап 5, 5іготбрего А, І іпавігот А, Мовпіда А (2008). А помеї їеві

Тог пові-5утбріопі содімегдепсе іпаісаїез апсіепі огідіп ої Типда! епдорпуїез іп дгаз5ев. зубі Віої. 57: 483-498 зЗепага! Сі, Стоз5тап ВВ, Мадабпуги Р, РашКпег УВ, Майк ОР (2007) І оїїпе аїКаїоідв:

Ситепсіев ої тиїшаїївт. Рнуюспетівігу 68: 980-996

Зспага! СІ, Мошпа СА, РаціКпег ОВ, Ріогєа 5, Рап .) (2012) Спетоїуріс аімегейу ої еріснісає

Типда! зутбіопів ої дгаззев5. Рипдаї! ЕсоЇоду 5: 331-344

Коо) зЗепиєїЇКе М (2000) Ап есопотіс теїпоа ог Ше Пиогезсепі Іабеїїїпуд ої РСА тадтепів. Майшге

ВіоїесппоЇоду 18: 233-234

Зітрзоп М/В, Масе М) (2012) Момеї! аззосіайопе рейуєеп еріснпіоає епаорнуїез апа дгавззев:

Розвірійев апа ошсотев. Іп "Єріспіоає, епаорпуїез ої соої! зеабзоп дгавззев: Ітріїсайопв5, ші2айоп апа ріоіоду. (Ед СА Моцйпо, СЕ АїКеп, ВІ МеСиїеу, УА 5ігіскіапа, СІ. Зесагаї.) рр. 35-39. (Те

Зативї! Кобегіз Моріє Гоипааїйоп: Агатоге, ОКіапота)

Зітрзоп МА, Зсптіа У, Біпуй у, Рамійе МУ, доппзоп ВО (2012) А тогрпоодіса! снапде іп Те

Типда! зутріопі Меоїурподіит Іоїї іпдисе5 дуапіпа іп її5 Нові ріапі І оїїшт регеппе. Рипда! Віоїоду 116: 234-240 зЗИибгатапіап АВ, Каштапп М, Могдепвієттпт В (2008) ПІАГІСМ-ТХ: дгеєду апа ргодгезвіме арргоаспев їТог 5едтепі-базей тийПіріє зедиепсе аїїдптепі. АІдогйттв їТог Моїесціаг Віоіоду 3: апісіеє 6

ТапакКа А, Таррег ВА, Рорау А, Раїкег ЕУ, 5соїйї В (2005) А зутбіозіз ехргеззейд поп-пірозотаї! реріїде зупіпеїазе їот а тиїцаїївіїс Типда! епаорпнуїе ої регеппіа! гуедгаз5 сопіе!5 ргоїесіюп 0 Ше вутбвіоїшт їтот іпзесі Ппегбімогу. МоїІесшаг Місгтобіоіоду 57: 1036-1050

Тваії НЕ, Пи УББ, еїабеп С, СНгівієпбеп МУ, ІГаїсн сс, бівде! МА, 5спагаІ! Сі (1994).

Емо!Ішіопагу адімегвіїісайноп ої Типда! епдорпуїез ої їаї! Тезсце дгаз5 Бу Ппубргіаіганоп м/ййп Еріспіоє зресієв5. Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 91 (7): 2542-2546

М/епу ВЕ, Агемедо МО, Соорег ТМ (1987) ІпПнепсе ої тоівіиге сопієепі, Іетрегайшге, апа Іепдій ої віогаде оп 5еєй дептіпайоп апа 5игміма! ої епдорпуїїс Типді іп зеєдв5з ої заї! Ттезсиє апа регеппіа! гуедгазз5. Рпуїораїпо!оду 77: 893-900

МКіпзоп НН, 5ієеде! МЕ, ВіапКепеПір 90, Маїогу АС, Виві І Р, Зспага! СІ. (2000). Сопійршіоп ої Тшпдаї! Іоїїпе аїКаїоїд5 (о ргоїесійоп їтот арпіав іп а дгазз-епдорпуїе тиїшаїївт. МоїІесшіаг Ріапі

Містобе Іпіегасіоп5 13: 1027-1033

Маїез 502, Гепвівг УС, Вапеїї ВУ (1989) Аззау ої іаї! тезсйє зеєд ехігасів, тасіпз апа аїКаїсіде ивіпа Ше Іагдає тіКжеєа рид. дУошигпаї ої Адгісийиге апа Роса Спетівігу 37: 354-357 2е|да ЗЕ, Мебийіє НН, бозтап ЗА (1993) Ерідетіоіоду ої пеакнй апа заїеїу гі5К5 іп адгісиниге апа геїагей іпдивігв - Ргасіїса! арріїсанопв Тог гига! рпувзісіап5. М/евієтп уошттаї ої Медісіпе 158: 56-63 «папа, ОХ, Мадабнуги Р, ВіапКепеПір 90, Зспага! СІ (2010) Аге Іоїїпе аїКаїоїа Іеме!5 гедшаїтей 60 іп агазо епдорпуїез Бу депе ехргезвіоп ог зибзігаїе амайарвійу? Ріапі Зідпаїїпа апа Вепаміог 5 (11):

1419-22

І ПЕРЕДІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«11592 ГРАКСЛАМНЗ ТЕКНОЛОДЖЕ ЛІМІТЕД кі2аз ГРИБКОВІ ЕНДОФІТИ З. ПОЛІЙПШЕНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ «1330» БАВЗБЯ ЗВА «165802 38 «кі7а» Рабепїїв версія 3,5 «510» 1 «231 ї8 «2125 ДНК : «213» Прозймер, штучний - кава» ї ївтазазсяз севссаву 18 «2105 7 «215 7 «і2з ДНК «213» Праимер, штучний «кава 2

ВЕС : з «2102 З «і» 24 «8125 ДНК «2173» Праймер, штучний «-4885 3 свстсвеввс їасаїзсасс аб | за «ай» 4 «яті» 3 «232з ДНК «213 Праймер, штучний «а» 4 сксакісваді засвсевнсв Вася 23 «215 5 «11» 31 «й12У ДЯК «933» Праймжер, штучний

«405» 5

Хвсстствса сЕдтркактс с их «ліз 5 «213» 74 «12 НК «313» Праймер, штучний «аа» б їтЕсСаїавсас Тозссттата рісвб 24 «вій 7 «211з 23 «212» ДНК «83» Празймер, штучний кава» У всвВітТравказ вдствивівЕ ах 2 стІїйх. 8 «11» 22 «8212» ДНК «7і3» Праймер, штучний «388 8 тїтІссзансов азсвавадіс аз й «кгівх 9 «233» 24 «815з ДИК «3» Прзимер, штучний «вах З ваївасксаї сківзірств ссас 24 «238 19 . «2312 А «3 ДНК -24ї3з Празймер, штучнив «аа» За сЕтдтастаза шХТсвнЕаКс ста ха «23ах «7313 4

«212». ДНК «213» Праймер, штучний «48075 11 каваїатссс встсстивх став | 28 «218025 19 «2113 24 «5392 ДНК «233» Праймер, штучний «лойх 172 сасавсвтїа састатсвас Тс 24 «2Щеах 3 «2331» 78 «213» ДНК : «233» Праеймез, штучний «во» 13 саксгавсеття састастсває Тс 4 «2і1йз 34 «511» 34 «2322 ДИК «23 Прайюмер, штучний «4005 14 звасарятаа навяєтїксс сої 74 -21йз 15 «811 24 «2122 ДНК «213» Праймеюв, щтучний хааХ. авсїсЕссза свасвасзта саїз 4 «3» 15 «211 78 «2323 ДК «233 Праймер, їтучний «408» 16 застав свасвЕКукс косе ай

«хх її «2115 24 «2325 ДНК «213» Праймер, штучний «вва» 17 ввтссстатті сізатрсавн саї5 а «2185 18 «-2115 24 «л1и» ДНК «2155 Праймер, штучний «аб» 18 санініасяк настсївіса вів: 24 «8145 19 таїї» 84 «212» ДНК «2і3» Праймер, штучний «вах 195 сЕїзїзатаа зозтрисетв сТсЄ 24 «230» 78 к231з 724 «2125 ДНК «33 Праймер, штучний «ай» 8

НЕБЕС вазав Ітвтсвваїс ас 24 «214» 51 «23їз 24 «2325 ДВК «213. Праймер, штучний

Аа» ЗІ скаааїкЕиз дастатвїквЕ варе 4 «2305 92 «2312 24 «2125 ДНК 22352 Праймер, штучний «ай» 37 ктадаїтнтаї їКтварсзвв все 28

«2195 23 «8411: 74 й «2125 ДНК «233» Праймер, штучний «ах 23 кзеТезаасс сеЕтетаніа арії 84 «їй» 74 «2115 24 «й32» ДИК «233» Праймер, штучний «аб» 24 вавісастст Тсртссвіїв сс 24 «210» 75 «85117 24 «з12» ДНК «213» Прайжмер, вітучний «80» 25 цазатрвавис шісіаїтстїв зад 24 «216» 75 «2315 24 «815» ДНК «233: Праймер, штучний «ваз 6

ТЕКсВтавВії їссзазвває аасз за «2102 Д(27 - «йВ1з 28 сохжайУ ДНК «313» Праймер, штучний «чабУ 27 ствстадаса заскївравс атре 74 «Я» 28 «2312 28 «532» ДНК «213» Праймер, штучний

Зо

«айх 8 савятсвзата асЕЕвВрдван с | | | га «ій» 35 «2135 29 «ій ДНЕ «2135 Праймер, штучний «4аВйх 25

ТеяостТсвас дасвсасває : за «йїаз за «8312 74 «2175 ДНК «8і3» Праймер, штучний «498» 38 сссатасзуї асасстктсї вес 24

Claims (62)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом ЛМеоїурпоаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МАК 50716, для підвищення стійкості до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

2. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом ЛМеоїурпоаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МЕКІ 50576, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

3. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Леоїурподбішт групи Еріспісає, депонований за номером МЕКІ 50577, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння бесае 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

4. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом ЛМеоїурпоаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МЕКІ 50578, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

5. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Леоїурподбішт групи Еріспісає, депонований за номером МЕКІ 50718, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

б. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом ЛМеоїурпоаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МЕКІ 50719, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е зрр. або насіння бесайе 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

7. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Леоїурподбішт групи Еріспісає, депонований за номером МЕКІ 50720, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е зрр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

8. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Леоїурподбішт групи Еріспісає, депонований за номером МЕКІ. 50721, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння бесае 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

9. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Леоїурподбішт групи Еріспісає, депонований за номером МЕКІ 50722, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

10. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Меоїурносаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МЕКІ 50723, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е 5рр. або насіння бесае 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

11. Виділений штам грибкового ендофіта, що є видом Меоїурносаішт групи Ерісніоає, депонований за номером МЕКІ 50724, для підвищення резестивності до шкідників та/або хвороб штучно інфікованих рослин беса/е зрр. або насіння беса/е 5рр., де рослина і ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію.

12. Виділений штам за будь-яким з пп. 1-11, який є біологічно чистим.

13. Рослина 5бесаїе 5рр., інфікована грибковим ендофітом виду Леоїурподіит групи Еріснісоаеє, де бесае 5рр. не є природним хазяїном ендофіта, і де рослина та ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію, що дозволяє рослині розвиватися в нормальному життєвому циклі, рослина бесаїе 5рр., інфікована грибковим ендофітом, має підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників або підвищену резистентність до принаймні однієї хвороби рослин, або обидві, у порівнянні з рослиною бесаїе 5рр., не інфікованою грибковим ендофітом.

14. Рослина 5есае 5рр. за п. 13, у якій ендофіт передається від першого покоління беса/е 5рр. другому поколінню беса/е 5рр. шляхом вертикальної передачі.

15. Рослина 5есаїе 5рр. за п. 14, у якій вертикальна передача від першого покоління рослин- хазяїнів другому поколінню рослин-хазяїнів відбувається через насіння.

16. Рослина беса/е 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій ендофіт є ендофітом, виділеним з БЕІутиг 5рр.

17. Рослина бесаїе 5рр. за п. 16, у якій ендофіт виділений з Е/утиз тиїарійїв.

18. Рослина беса/е 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій ендофіт є вибраним з групи, що складається з МЕКІ. 50716, МЕКІ 50576, МЕКІ 50577, МАВІ 50578, МАВІ 50718, МАНІ. 50719,

МАВ. 50720, МАВ. 50721, МАВ 50722, МАВІ. 50723 і МЕКІ. 50724 або їх комбінацій.

19. Рослина беса/е 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій ендофіт є вибраним з групи, що складається з МЕКІ 50716, МЕРІ 50576, МЕКІ 50578, МАВ 50719, МАВ 50720, МАВ 50722 та МК 50724.

20. Рослина 5есаї!е 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій ендофіт є МЕКІ. 50576, МЕНІ. 50578 або

МАВ. 50720.

21. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій рослина беса/е 5рр., інфікована грибковим ендофітом, не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції.

22. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій рослина беса/е 5рр., інфікована грибковим ендофітом, демонструє нормальний морфологічний фенотип.

23. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій рослина беса/е 5рр., інфікована грибковим ендофітом, продукує лолінові алкалоїди та/або перамін.

24. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій рослина беса/е 5рр., інфікована грибковим ендофітом, має підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників, де шкідники вибрані з групи, що складається з: (1) видів попелиці (Арпідідає), представлених ВРора!озірпит расії, бсРіларнів дгатіпит, НРора!ювзірпит таї!аі5, Меїороїрніит аїтподит, ойобіоп 5рр., 5Побіоп амепає, 5Побіоп Гадапае, рішгарнів похів; (2) видів злакових та зернових мух (Адготуідає; Апіпотуїідає, СПіІогорічає, Серпідае та Сесідотуїйдає), представлених ОзсіпейПа й Овсіпела ривзійШа, Мауейоїа аевзтгисіо!г, Сегойопійа врр., Сегойопіна аизіга!ів, Сегодопінла апдизіїреппіз, Еоптіа Питідаа, Меготуле атегісапа, Наріоаїріозі5 тагдіпаа, Спіогорз ритіїйопів, Тірша 5рр., Спготаїюту/!а шзсца, Серпих рудтаеив, Спготаюту/!а Тизсша, Сопіагтіпіа Іпсі; (3) видів трипсів (ТНгірідає), представлених Г/тотрипси сегеайит, І Ітотрипси аепіїсоті5, Аріпотрипси гити5, бЇепотрипси дгатіпит; (4) видів коників та цвіркунів (Асгідідає та СгуІПдає), представлених /осизіа тідгайогпа, Рпашастіайт тагадіпа!іе, Ррашйастіаіт уїйЩашт, Ме!/апоріих врр., ТеІеодгулиє соттоаи»в; (5) видів клопів (ІГудаєїдає), представлених Мувзз5іив5 Пийопі, Віїзвиб Іеисорепив Іеисорепив; (6) видів довгоносиків (Сигсцііопідає), представлених орпепорногиз 5рр.; (7) видів похідних черв'яків та озимих черв'яків (Мосіцідає), представлених Реейда!ена ипірипсіа, бродорієга 5рр., Муїпітпа зерагаїа; Регзесіапіа ауегза, Адговіїв ІрвПоп; (8) видів листоїдів (Спузоптеїїдає), представлених ОшШшета те/апорив; (9) личинок хрущів (Зсагабаєїдає), представлених видами Рорі//а /аропіса, Созіеуїга 7еаіапаїса, РруПорепіна 5рр., ВНігогоди5 та/га/5, Апізоріа зедейшт; (10) видів борошнистого червця (Рзецйдососсідає та Соссідає), представлених РІепасоссих огаеї, Ваіапососси5 ороае, Нірегхейа гитісів, РогрНугорнога іпісі; (11) видів дротяників (ЕІасегідає), представлених Соподегив врр., Г/топійв бо 5рр.; видів жуків (Сагарідає), представлених 2абгих Іеперпо!іаев; (13) видів кліщів (Егпорпуїдає та

РепіпаІєїдає), представлених РеплілаІеиз 5рр., На/оїудеих аевзітисіої, Асепа зрр.; (14) видів шкідників запасів продуктів (Сигсцііопідає, 5імапідає, Ругаїїдає, Сеїеснідає, Тепебргіопідає, Возігіспідає), представлених бйорийи5 оогулае, бйорийи5 дгапапи5, ойогода сегеаепа, НРугорепна аотіпіса, СгуріоІезіез 5рр., Огугаернйи5 вигпіпатепвзі5, Сайта сашепа, Ріоаіа іпіегрипсіела, Тіропйит сотивит, Тпіроїит савіапеит, І авіодепта етісоте; (15) видів пінниць (Сегсороїдеа), представлених РНі/аепиє 5ритатпив, (16) видів нематод, представлених кореневою нематодою (Ргаїу/епспих в5рр., зокрема Р. оте), Р. степайш5, Р. педіесіивє та Р. репеїгапз), вівсяною нематодою (Не!гегодега зрр. та Рипсіодега 5рр., зокрема Н. амепає, Н. Іайропв, Н. погаесаїїв, Н. Ні/ріемі, Н. тапі, Н. ріїепевіга, Н. раківіапепвів та Р. рипсіага), галовою нематодою (Ме/оідодупе 5рр., зокрема М. сРіпйуоосді, М. паавхі, М. апіеШа, М. тістоїуїа,. М. ойПеїзопі, М. дгатіпісоїа, М. дгатіпії, М. Кікиуепвіз та М. 5рапіпає), стебловою нематодою (Ойуіепспиз врр., зокрема Б. аїрзісаї! та 0. гадісісоіа); пшеничною нематодою (Апди/ла Іпсі); (16) видів слимаків (Оегосегаз гейсшацт та Агіоп 5рр. зокрема А. полепвіз адд. та А. зибіив5сив). В одному варіанті реалізації шкідники є нематодами, краще кореневими нематодами (Ргау/епснпив

5рр.), або мінуючими мухами Сегодопійа ашзігаїї5 (Оіріега: Адготуідає), також відомими як м/пеаї 5пеайй тіпег (мінер піхв листків пшениці).

25. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, у якій рослина беса/е 5рр., інфікована грибковим ендофітом, має підвищену резистентність до принаймні однієї хвороби рослин, де хвороба рослин спричинена рослинним патогеном, вибраним з групи, що складається з вірусу жовтої карликовості ячменю (І е(еоміги5), грунтового вірусу мозаїки пшениці (Ригоміги5) та вірусу смугастої мозаїки пшениці (Тгйптоміги5), Хапіпотопах сатрезігї, Рзепдотопавз зугпіпдає, СоПетпспит дгатіпісоїа, СіотегеПа дгатіпісоїа (телеоморфа)|, АЛетага в5рр., Сіаайозропит Реграгит, МусоврНнаєтейа азвзіапа (|телеоморфа)|, Ерісоссит в5рр., брогобоотусев 5рр., оїетрнНуїит зрр., Віроїагів зогокіпіапа, Сосніїобо!шх займиз (гелеоморфаї), Ризапит врр., ТПШеїа сапевз, ТПейа пісі, ТПейа Іаеміз, Тена Ююейада, Нутепиїа сегеаїїх, СерпаІюзропит дгатіпейт, Не!Ітіпіпозрогішт займит, Соспіобоїиз займиє Ц(гтелеоморфа|) Соргіпиз зуспготогбійив, ПРПорпозрога аюресигі, ТШПена сопігомегза, Сіамісерв5 ригригеа, брНасеїа зедешт (анаморфа)|, Ризапит сиітогит, Рвеидозеріога допасіх, беіепорпота допасіх, Меомовзвіа іпаїса, ПТПена іпаїса, Риссіпіа гесопайа, Аесідіит сіетайаї5 (анаморфа)|, Сегсозропаїит дгатіпів, ЗСОПСОТСпиИт Зо дгатіпіх, РРаеозрнпаєта Регроїтіспоідез, ІГеріозрпаєепа Регротспоїдез5, О5Шадо -тсі, Містодоспіит пімаіе, Бизапит пімаІе, Моподгарне!а піма!йє |телеоморфа|, Егувзірпе дгатіплів, Руїйит арпапідепаййт, Руїййит аптепотапев, Рушійт дерагуапит, Руфіт дгатіпісоїа, Руїйит иШтит, СірбегеПа 7еае, Ризапит дгатіпеагит (анаморфа), берюпа зесаїїв, беріопа їтісі, МусозрНаєтеЛа дгатіпісоїа (телеоморфа)|) НРігосіопіа сегеаї!йй5, НРігосіопіа 5о1апі, ВНігосіопіа леае, Віитепа 5рр., Сегагобавзійіит сегеаіе |(гелеоморфа)|, Мугіозсіегоїпіа Богеаїїв, осіегоїїпіа Богеайз, Турпиїа іданоепвів, Турпиа іпсагпаїєе, Турпша ізрікапепвів, Турпиїа ієпікапепвів маг. сападепвів, єгадопозрога подогит, беріогіа подогит, РіаеозрНнаєтлта подогит Ігелеоморфа)|, Геріозрпаєта пойогит, ШМгосувіїв оссиМа, Риссіпіа дгатіпі5, Аврегдйив 5рр., Мідгозрога 5рр., Репісшіит в5рр., НРігорив5 5рр., РхеидосегсозрогеПа Негроїпіспоїде5, Таревзіа асиогтів |(телеоморфа|, /лейо діитагит (анаморфа|, Ругепорнога псі-герепії5, Югеснвіега Ітіисі-теретів (анаморфа|, Не/тіпіпо5ропит псі-терепіїв, Риссіпіа пйсіпа, Руїйіит 5рр., НРупспозрогійт взесаїйв, Риссіпіа 5іппОогптіх, Саеитаппотусез дгатіпіє та Ризапит рзепйдодгатіпеагит.

26. Рослина беса/е 5рр. за п. 25, у якій рослинним патогеном є Риссіпіа гесопайа, Риссіпіа ітісіпа, Риссіпіа дгатіпіх, Ризапит в5рр., Рушбійт 5рр., НРупспозропит 5есаїїв, Риссіпіа зіпогтів, Ссаегеитаппотусез дгатіпів, Нрігосіопіа 50іапі або Ризапит рзеидодгатіпеагит.

27. Рослина бесаІе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, де беса/е 5рр. вибирають з групи, що складається з беса/е сегеаієе, бесає топіапит, бесае 5ігісішт, бесає зумезпе та бесаеєе уаміомії.

28. Рослина бесаїе 5рр. за будь-яким з пп. 13-15, де беса/е 5рр. є бесайе сегеа!є.

29. Спосіб одержання стабільної комбінації рослина-хазяїн/грибковий ендофіт виду Меоїурподіит групи Еріспісає, який включає штучне інфікування рослини 5беса!е 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом, що утворює стабільну комбінацію з інокульованою рослиною, причому рослина-хазяїн не демонструє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції і має нормальний життєвий цикл, і де комбінація має підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників або підвищену резистентність до принаймні однієї хвороби рослин, або обидві, у порівнянні з рослиною бесаїе 5рр., не інфікованою грибковим ендофітом.

30. Спосіб за п. 29, у якому стабільна комбінація рослина-грибок є достатньо стабільною, щоб дозволити вертикальну передачу ендофіта. 60

31. Спосіб за п. 30, у якому вертикальна передача здійснюється за допомогою відростків або частин рослини, призначених для вегетативного розмноження.

32. Спосіб за п. 30 або 31, у якому вертикальна передача здійснюється квітковими пагонами, що дають насіння.

33. Спосіб за будь-яким з пп. 30-32, у якому вертикальна передача ендофіта приводить до вертикальної передачі ендофіта від першого покоління другому поколінню рослин-хазяїнів.

34. Спосіб за будь-яким з пп. 30-32, у якому вертикальна передача від першого покоління рослини-хазяїна другому поколінню рослини-хазяїна відбувається через насіння.

35. Спосіб за будь-яким з пп. 29-34, у якому спосіб додатково включає стадію вибору рослини- хазяїна бесаєе 5рр., що не виявляє зовнішніх симптомів ендофітної інфекції, з популяції інфікованих рослин-хазяїнів.

36. Спосіб за будь-яким з пп. 29-35, у якому беса/е 5рр. вибирають з групи, що складається з беса!е сегеаіє, бесаіе топіапит, бесае зігісшт, беса!/е зумезіге та бесае уаміомії.

37. Спосіб за будь-яким з пп. 29-36, у якому беса!/е 5рр. є бесае сегеа!є.

38. Спосіб за будь-яким з пп. 29-37, у якому принаймні один грибковий ендофіт є ендофітом, виділеним з Е/утих 5рр.

39. Спосіб за будь-яким з пп. 29-38, у якому грибковий ендофіт виділений з Е/утих тарі.

40. Спосіб за п. 39, у якому ендофіт вибирають з групи, що складається з МККІ. 50716, МЕКІ. 50576, МАВІ 50577, МАВІ 50578, МАВІ 50718, МАНІ 50719, МАВ. 50720, МАВ 50721, МАВІ. 50722, МЕНІ. 50723 і МЕМ. 50724 та їх комбінацій.

41. Спосіб за п. 40, у якому ендофіт є МАЕКІ 50716, МКК 50576, МАМІ 50578, МАВІ. 50719, МЕНІ 50720, МЕКІГ. 50722 або МЕКІ. 50724.

42. Спосіб за п. 41, у якому ендофіт є МЕКІ. 50576, МЕМ. 50578 або МЕМ 50720.

43. Спосіб надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну бесаце в5рр., який включає штучне інфікування рослини 5бесае 5рр. принаймні одним грибковим ендофітом виду Меоїурпоаіит групи Ерісніоає, де комбінація грибковий ендофіт-рослина беса/е продукує принаймні один алкалоїд на рівні, достатньому для надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну, де рослина й ендофіт утворюють стабільну симбіотичну асоціацію, яка забезпечує рослині можливість розвиватися у нормальному життєвому циклі.

44. Спосіб за п. 43, у якому принаймні один алкалоїд є алкалоїдом, вибраним з групи, що Зо складається з пераміну, /Л-ацетилнорлоліну, лоліну, Л-форміллоліну, Л-ацетиллоліну та л- метиллоліну.

45. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому принаймні один алкалоїд є лоліном або пераміном або обома.

46. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому спосіб додатково включає стадію вибору комбінації грибковий ендофіт-рослина беса!/е, що продукує принаймні один алкалоїд на рівні, достатньому для надання принаймні деякого рівня захисту від шкідників рослині-хазяїну.

47. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому бесайе 5рр. вибирають з групи, що складається з беса/е сегеаіе, бесаіе топіапит, бесае зігісіит, беса!е зумезіге та беса!/е уаміомії.

48. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому бесае 5рр. є беса!е сегеа!е.

49. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому принаймні один грибковий ендофіт є ендофітом, виділеним з Бути» 5рр.

50. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому грибковий ендофіт виділений з Е/утив тіЛабіїїв.

51. Спосіб за п. 43 або п. 44, у якому грибковий ендофіт є ендофітом виду Леоїурподіит групи Еріспіоавє.

52. Спосіб за п. 51, у якому ендофіт вибирають з групи, що складається з МКК 50716, МКК. 50576, МАВІ 50577, МАВІ 50578, МАВІ 50718, МАНІ 50719, МАВ. 50720, МАВ 50721, МАВІ. 50722, МЕНІ. 50723 та МЕКІ. 50724 та їх комбінацій.

53. Спосіб за п. 52, у якому ендофіт є МЕКІ 50716, МАМІ 50576, МЕКІ 50578, МАВ 50719, МЕНІ 50720, МЕКІГ. 50722 або МЕКІ. 50724.

54. Спосіб за п. 53, у якому ендофіт є МЕКІ. 50576, МЕКІ 50578 або МЕКІ. 50720.

55. Насіння бесае 5рр., інфіковані грибковим ендофітом виду Меоїурпоаіит групи Еріспіоае, що одержаний зі штучно інфікованої рослини, яка утворює симбіотичну асоціацію між ендофітом і рослиною, де асоціація має підвищену резистентність до одного чи декількох шкідників або підвищену резистентність до принаймні однієї хвороби рослин, або обидві, у порівнянні з рослиною бесаїе 5рр., не інфікованою грибковим ендофітом.

56. Насіння 5бесае 5рр. за п. 55, у якому насіння є насінням 5есае 5рр., вибраним з групи, що складається з беса/е сегеаієе, бесає топіапит, бесае 5ігісішт, бесає зумезпе та бесаеєе уаміомії.

57. Насіння бесаїе 5рр. за п. 55 або п. 56, у якому насіння є насінням бесае сегеа!е. 60

58. Насіння беса/е 5рр. за п. 55 або п. 56, у якому принаймні один грибковий ендофіт є ендофітом, виділеним з Е/ути» 5рр.

59. Насіння беса/е 5рр. за п. 55 або п. 56, у якому грибковий ендофіт виділений з Е/утив тиїарів.

60. Насіння беса/е 5рр. за п. 59, у якому ендофіт вибирають з групи, що складається з МЕКІ. 50716, МАНІ 50576, МАНІ 50577, МАНІ. 50578, МАНІ 50718, МАНІ. 50719, МАВ. 50720, МАНІ 50721, МАНІ. 50722, МАВ. 50723 та МЕКІ. 50724 та їх комбінацій.

61. Насіння беса/е 5рр. за п. 60, у якому ендофіт є МККІ. 50716, МЕКІ. 50576, МАВІ 50578, МЕН 50719, МКК. 50720, МЕКІ. 50722 або МЕКІ. 50724.

62. Насіння 5есаї!е 5рр. за п. 61, у якому ендофіт є МЕКІ. 50576, МЕКІ. 50578 або МЕКІ. 50720. ні нн понн нин ніпін внннтнннннин АВЖКИи : АНІ ншш іаню і АЖ? ілезюе ши Авжаа ав вве я вста іднзата ГЕ І - і й рихте ще Зввезптв Ї днннанняклднлякляккат клала пня алкнк т Ат носки нн кн тн нстн чат ч нянні нта чннклнткчлннтяньнн- ДЩЕВЙ пн пониннни КОКО КА ож Коедіцієчт Жаккзра

ФГ.

КК ЕК СоОООВ ов оо КО ЗВ З о ОБ Хе ЗОх Зоо се - В ОК ОК СУК У УК НХ 5 Б, у 5 ЕК Я с ОО ЗВ ЗМО Як І асо С Я ще ОО ВУС ХО шва Но в МО ДК с МО ОБО Ох ОМ ОК ох ОО Б М В Ех я ее ІВ с ПОКИ що п у У: дО є ЗВ З КЗ Зк ОІВ МО ТЕ жо КК ККУ я КК с ОМ ОО Ж КО В с МОМ ВВ У УК ах ОО ОКУ НК В ПО А НКК МУК ОКО ПЛИНИ, ПДИПИМИМИИЙ ОО КО ЗК КК ВВ УЖ УКХ і ЗК ССС Е о с КОКО б. я ССС З сх ОЗ М З ОК с УКВ КК МКК ТЕТ І Й 5 о ХО З а о. І їх ща а С. З Я Б. КОХ В З НЯ СІКИНХ с т ОО ККУ ях ЗК МУ У МК я її ОО ОО і. КК со ОМ КВУ МКК В У ОК с с о с о Є КОХ о. АК п о КО і. Б онннннссСсСся с 0. ОК ЕВ, НН с ОО п МО я сс. СХ ОО КК МК, 155 с о. І як НК. М: с МОМ ПК Я ОН КК В ОНИ Не ОК ОА Ме В а г Ох хо я с ОО пе в ОН ВО с КК МИ ВОК Кн о З х СК ВОК ВХ З ОО ЗОН п В СКК КОКО ще я ОЗ ЩО СОМ 0. ж я У шо а з КВ у о ор ВХ с ВК с КЕ КМ у КК с о - Он с ЗО ЕК У ех ЖК ке ОК я МО ОКХ ОК ІМК шо с фону . ВВ п КК с ВО КВ Ох А ІК КВ В ОН Я В ОС ЗХУх ЕВ о ОК Б ОО КК х и: ОХ М ШК о. ОКО С о хх шо ЖЕ ПТМКМИН КМ я о, ОВ АМКУ ЗХ па о ВАК ОО ЗО ОКХ ОККО ОО в с. Х п. З с с ШОК У КУМ Х ОВ МОМ Я ОКО 0: с ОХ ХМК ВК ЗЕ те КН с хх ОХ ОО Ко В о о. п. о. п ПЕК ОККО НИКИ УП ЖУКОВ ПЕК КАМ ОО ОК В ВВ ОВНА ХУ КК М о ОК В МВ пово о КО 0 с З Не ТИСКУ КО ЗОН УК КВК Ж У Ен пн ОО ОМ І У а

Ж о. о М МНЕ СН Ко ПД ОС ЕС ВХ КК 5 УМОВ СОМ с с ОО МЕ БО Кк КОКО ЗНО У СООКНК ко во о ТЕООВ и ЗВ ОК 5 ОЗ ОО що НН ші ЗОН о Ко КВК - М ДЕК ен ОКУ ке ОО о ЗХ БЕЖ с ОВ НН КВ ЕН ОО о СЕ її ХО З БОБ б С: ВОК о В КОХ М Х ОО КХ ОО ОКХ НН ХОМ БО о І ж С ока в ЕЕ о они зх ОО ЗХ Ж ЖК А КН ОК В ОХ ПК ЩОБ ОБОХ Я ж ВО ан ОКО БО 00 мо кН 000 Ж ОМ ОВ зай У 000 ПЕ ОКА МАВ КО З х х Ж : М Є В ООН КОД МКК х хе УКХ м ХУ їх Те нн нн І: і я Во я я

ФІГ. я